Введение к работе
Актуальность проблемы. Рекомбинантные аденовирусы
широко используются в молекулярно-биологических,
биомедицинских и микробиологических исследованиях. Аденовирусные векторы, несущие в составе генома чужеродные гены, например, антигенов микроорганизмов, являются удобным инструментом для исследования соответствующих белков in vitro и in vivo, а также служат основой для разработки нового поколения генно-инженерных вакцин. В последние годы активно разрабатываются различные схемы использования аденовирусных векторов для продукции рекомбинантных аналогов белков, применяемых с целью терапии и профилактики различных заболеваний человека (цитокинов, иммуномодуляторов, антител и др.), поскольку белки, полученные из природных источников, являются дорогостоящими и, зачастую, небезопасными для использования в биомедицинских целях. Применение векторов на основе аденовирусов человека и животных особенно актуально для продукции таких биологически-активных рекомбинантных аналогов белков человека, которые невозможно получить в системах экспрессии на основе клеток прокариот и низших эукариот (Е. coli, Sacharomyces cerevisiae, Aspergillus sp. и др.). В настоящее время разработаны способы получения рекомбинантного фактора роста нервов Р (Xiao В., 2008) и антител к коронавирусу (Havenga M.J., 2008) в клетках, трансдуцированных аденовирусными векторами, содержащими в составе генома экспрессирующую кассету с геном соответствующего белка. Использование в этих работах векторов на основе аденовируса человека 5-го серотипа обусловлено безопасностью и высокой эффективностью такого типа векторов, что доказано в результате многочисленных исследований, в том числе и I, II и III фаз клинических испытаний. Однако все разрабатываемые в настоящее время на основе рекомбинантных аденовирусов 5-го серотипа системы экспрессии для получения препаративного количества белка характеризуются высокой себестоимостью. В этой связи, актуальным является разработка новых подходов к продукции рекомбинантных белков человека. Одним из таких подходов является синтез рекомбинантных белков в куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы - одна из наиболее экономичных и безопасных (в случае использования SPF-эмбрионов) биотехнологическая система, применяемая на протяжении уже не одного десятка лет. Важной характеристикой данной системы служит схожесть аппарата транскрипции и трансляции с таковым
млекопитающих, что необходимо для получения биологически-активных белков человека.
Для доставки и экспрессии генов в курином эмбрионе перспективным является использование векторов на основе аденовируса птиц 1-го серотипа (chicken embryo lethal orphan) -CELO. В работе Л.В. Череновой (2004 г.) показано, что при размножении в курином эмбрионе рекомбинантного вируса CELO, в аллантоисной жидкости происходило накопление продукта экспрессии гена интерлейкина-2, включенного в состав его генома. Данный факт служит предпосылкой для разработки на основе CELO эукариотической системы продукции рекомбинантных белков в курином эмбрионе.
Примером белков человека, нуждающихся в разработке для его продукции новых систем экспрессии, является лактоферрин. Он обладает перспективными в биофармацевтическом плане свойствами: антибактериальной, иммуномодулирующей, противовоспалительной и антиоксидантной активностью. Многогранность физиологических функций Лф обусловливает перспективность создания на его основе лекарственных средств широкого спектра действия. В настоящее время в клинике используется лактоферрин, выделяемый из донорского женского молока. В связи с этим, широкое его применение ограничивается недостаточностью сырья. Поэтому получение рекомбинантного аналога лактоферрина человека аутентичного природному белку в препаративных количествах является актуальной задачей.
Серьезной проблемой при использовании белков в качестве лекарственных средств для парентеральном введения, является их быстрая элиминация из организма за счет действия протеолитических ферментов и клеток иммунной системы. Например, при внутривенной инфузии лактоферрина человека период его полураспада в организме составляет всего несколько часов. Пролонгация действия препарата в организме достигается путем его регулярного введения в течение 5-7 дней через каждые 12-24 часа, что зачастую является причиной токсических состояний реципиентов. Новым подходом к решению данной проблемы может стать доставка и длительная экспрессия гена целевого белка непосредственно в организме, осуществляемая аденовирусными векторами. Наиболее целесообразно использование вектора на основе аденовируса 5-го серотипа.
Таким образом, получение рекомбинантных аденовирусов человека и птиц, экспрессирующих ген лактоферрина человека, для
продукции биологически-активного белка in vivo и в курином эмбрионе, является актуальным направлением исследований.
Цель исследования: получение рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и птиц, экспрессирующих ген лактоферрина человека, для продукции биологически-активного рекомбинантного лактоферрина в эукариотических клетках in ovo и in vivo.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1. Создание вектора на основе генома аденовируса птиц CELO,
обеспечивающего повышенный уровень экспрессии целевого гена в
пермиссивной и непермиссивной системе.
Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Ад5-Lf, экспрессирующих ген лактоферрина человека.
Анализ экспрессии рекомбинантного лактоферрина человека в культуре эукариотических клеток, инфицированных полученными аденовирусными векторами.
Изучение продукции рекомбинантного лактоферрина человека в клетках млекопитающих in vivo на модели лабораторных животных.
Получение рекомбинантного лактоферрина человека в куриных эмбрионах, инфицированных аденовирусным вектором CELO-Lf.
6. Изучение физико-химических, антигенных и биологических
свойств (антиоксидантная активность) рекомбинантного
лактоферрина человека.
Научная новизна.
- Впервые был получен рекомбинантный аденовирус птиц CELO,
обеспечивающий повышенный уровень экспрессии целевого гена в
пермиссивной и непермиссивной системе in vitro, in ovo и in vivo. Для
этой цели впервые были использованы регуляторные 5'-
нетранслируемые элементы поздней области транскрипции генома
вируса CELO - двучастный лидер и лидер гена гексона. В результате
проведенных экспериментов по трансфекции плазмидными
конструкциями p415BPL-SEAP и p415BPLwhl-SEAP, а также
трансдукции вирусом CELO-BPLwhl-SEAP пермиссивных и
непермиссивных клеточных культур показана функциональная
независимость двучастного лидера от цис-транс взаимодействия с
вирусом CELO.
Впервые было установлено на примере 5'-нетранслируемой области гена гексона, что подобные структурные элементы генов поздней области транскрипции генома аденовируса имеют важное значение в процессе экспрессии чужеродных белков.
Сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO-Lf, несущий экспрессирующую кассету с геном лактоферрина человека
под контролем HCMV-промотора, двучастного лидера и 5'-нетранслируемой области гена гексона вируса CELO.
Разработана новая эукариотическая система продукции рекомбинантного лактоферрина человека в клетках куриного эмбриона in ovo с использованием аденовирусного вектора CELO-Lf. Была показана аутентичность рекомбинантного Лф человека природному белку.
- В экспериментах in vivo определена длительность и уровень экспрессии лактоферрина человека в составе рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Afl5-Lf после системного введения препаратов данных вирусов лабораторным животным. Произведено сравнение содержания лактоферрина в сыворотке крови крыс по временным и количественным характеристикам после введения препаратов рекомбинантных вирусов и препарата белка лактоферрина, выделенного из женского молока.
Практическая значимость. Рекомбинантный аденовирус Ад5-Ы в перспективе может стать основой для разработки генно-инженерного препарата, который обеспечит экспрессию и длительную циркуляцию рекомбинантного Лф человека в организме, что позволит заменить его регулярное введение. В дальнейшем на основе векторов Ад5 и CELO могут быть созданы эффективные системы экспрессии других биологически-активных рекомбинантных белков человека как in vivo, в организме реципиента, так и in ovo, в курином эмбрионе.
Получено положительное решение о выдаче патента по заявке № 2007120447 от 1 июня 2007 года «Способ получения биологически активного рекомбинантного белка лактоферрина человека».
Внедрение результатов работы в практику.
Экспрессирующая кассета, содержащая двучастный лидер и 5'-нетранслируемую область гена гексона, внедрена в работу лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН для создания плазмид и рекомбинантных аденовирусных векторов на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающих повышенный уровень экспрессии целевых генов.
Коллекция рекомбинантных аденовирусов: CELO-BPLwhl-SEAP, CELO-Lf, CELOdBKb и Afl5-Lf - хранится в музее лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Препарат рекомбинантного лактоферрина человека, экспрессированного в клетках куриного эмбриона in ovo с использованием аденовирусного вектора CELO-Lf, и препарат
рекомбинантного аденовируса Адб-Lf подготовлены к предклиническим испытаниям.
Материалы диссертации используются в лекциях для студентов ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» в рамках курса молекулярной биотехнологии.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии " (Москва, 2006), XX зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии " (Москва, 2008), расширенном заседании кафедры органической и биологической химии Московского Педагогического Государственного Университета 16 июня 2008 года. Апробация диссертации состоялась на совместном заседании отдела «Генетики и молекулярной биологии бактерий» и отдела «Медицинской микробиологии» 13 октября 2008 г. ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 научных работы, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 статьи в сборниках международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (264 источника, из которых 13 отечественных и 251 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 25 рисунков.
