Введение к работе
Актуальность проблемы
Молочнокислые бактерии (МКБ) уже более ста лет привлекают внимание исследователей. Исторически в ядро этой группы включены бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus и Leuconostoc (Albano et al., 2007). Род Lactococcus, тесно ассоциированный с пищевыми продуктами, является одним из самых значимых среди них (Holzapfel et al., 2001), а некоторые виды лактококков относятся к симбионтной микробиоте человека, в связи с чем были удостоены статуса GRAS (Generally Regarded As Safe).
Исследования последних десятилетий выявили способность МКБ образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов - бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия (Cascales et al., 2007). Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта, и поэтому считается, что они могут заменить традиционные химические консерванты (Nes et al., 2007). Так, бактериоцин низин, образуемый Lactococcus lactis, с успехом используют для увеличения сроков годности продуктов питания в пищевой промышленности многих стран уже более 50 лет (Cleveland et al., 2001). Но применение низина, как и других бактериоцинов, ограничивается относительно узким спектром антимикробного действия, направленным только в отношении грамположительных бактерий, и появлением среди пищевых патогенов устойчивых форм (Kaur et al., 2011).
Особую значимость молочнокислые бактерии приобрели после открытия способности к продукции фунгицидных веществ ( et al., 2005). Получение новых штаммов МКБ, обладающих антибактериальной и фунгицидной активностью, в перспективе может решить проблему не только порчи продуктов питания, но и лечения ряда инфекционных заболеваний (Marteau et al., 2003; Rouse et al., 2008). Хорошо изучены фунгицидные вещества, образуемыми бактериями рода Lactobacillus (Yang et al., 2010), тогда как наличие фунгицидной активности среди бактерий рода Lactococcus является очень редким и малоизученным свойством, а о природе фунгицидных веществ почти ничего не известно (Florianowicz et al., 2001; Стоянова и др., 2007). В этой связи выделение, изучение свойств и биосинтеза новых антибактериальных и фунгицидных антибиотиков, образуемых лактококками, а также исследование перспективы их применения имеет фундаментальный и практический интерес. Возросший спрос медицинской и пищевой промышленности в новых безопасных антимикробных препаратах с широким спектром действия обуславливает актуальность данного исследования.
В процессе поиска штаммов лактококков, обладающих широким спектром бактерицидного и фунгицидного действия, на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова из коровьего молока Бурятии был выделен штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194 (Стоянова и др., 2006). Однако химическая природа активных компонентов, продуцируемых L. lactis subsp. lactis 194, и особенности их биосинтеза не были изучены. Данная работа посвящена выделению и установлению химической природы антибиотических веществ, образуемых L. lactis subsp. lactis 194, изучению их синтеза, а также исследованию возможности их практического применения.
Цель и задачи работы.
Цель исследования: изучение синтеза антибиотического комплекса широкого антимикробного спектра действия, образуемого активным вариантом штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучить диссоциацию популяции штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 с целью выделения наиболее активного продуцента.
-
Разработать условия выделения и очистки антибиотических веществ, образуемых активным вариантом штамма L. lactis subsp. lactis 194-К.
-
Изучить физико-химические и биологические свойства индивидуальных антибиотиков, установить их химическую природу.
-
Изучить синтез антибиотического комплекса штаммом L. lactis subsp. lactis 194-К и подобрать оптимальную среду культивирования.
-
Испытать эффективность культуры штамма 194-К in vivo на моделе спонтанного хронического дерматоза.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Получен активный вариант штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К, образующий сложный антибиотический комплекс широкого спектра бактерицидного и фунгицидного действия.
-
Разработаны способы выделения и очистки антибиотиков, образуемых активным вариантом 194-К.
-
Установлен состав антибиотического комплекса: наряду с известным бактериоцином низином А, обнаружен новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), которые являются новыми биологически активными веществами.
-
Эксперименты на мышах линии CBRB-Rb (8.17)1Iem показали эффективность культуры штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи.
Научная новизна и практическая значимость работы.
-
Изучена диссоциация штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и выделен активный вариант 194-К, продуцирующий антибиотический комплекс с широким спектром антибактериального и фунгицидного действия.
-
Разработана схема выделения и очистки антибиотического комплекса и его отдельных антибиотиков, относящихся к разным классам органических соединений.
-
Впервые показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К наряду с низином образует новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А, В), не имеющие аналогов в базе данных природных биологически активных веществ (BNPD).
-
Изучено влияние оптимизированных ферментационных сред различного состава на синтез фунгицидного антибиотика 194-А и нового бактериоцина 194-D. Подобрана оптимальная для их продукции среда.
-
Показана эффективность культуры штамма 194-К для уменьшения степени выраженности симптомов хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17)1Iem.
Практическая значимость работы заключается в получении активного варианта штамма L. lactis subsp. lactis 194-К, разработке схемы выделения новых антибиотиков, перспективных для использования в пищевой промышленности и медицине. Доказана эффективность перорального применения культуры штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи.
Апробация работы и публикации.
Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2012» (Россия, Москва 2009, 2012); симпозиуме «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Россия, Москва, 2009); III-й научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (Россия, Москва, 2009); III-й Международной конференции «International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology» (Португалия, Лиссабон, 2009); VII-й Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларуссия, Минск, 2010); VI-м Московском международном конгрессе «Биотехнология, ее состояние и перспективам развития» (Россия, Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Фармацевтическая и медицинская биотехнология» (Россия, Москва, 2012); ежегодном международном конгрессе «Инфекционные заболевания» (Россия, Москва, 2012).
Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова 18 сентября 2012 г. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, среди которых 6 статей в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 32 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 258 отечественных и зарубежных источника.
