Содержание к диссертации
Стр
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas.
1.1.1. Таксономическое расположение бактерий рода Xanthomonas . . 13
1.1.2 Физиолого-морфологические особенности бактерий рода
Xanthomonas 16
Характеристика фитопатогенных процессов, вызываемых бактериями рода Xanthomonas 17
Практическое значение бактерии Xanthomonas campestris 25
1.2. Участие углеводсодержащих биополимеров в фитопатогенезе 29
1.2.1.Строение клеточной оболочки грамотрицательных
микроорганизмов 30
Выделение и очистка углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и липополисахаридов из наружной мембраны бактерий Xanthomonas campestris 33
Реологические характеристики растворов полисахаридов 37
Биологическая роль углеводсодержащих биополимеров и зависимость её от их физико-химических свойств 40
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
2.1. Материалы 52
Культуры микроорганизмов 52
Растительные объекты 53
Приборы и материалы 54
2.2. Методы исследований 55
2.2.1. Проведение инокуляции растительных объектов бактериальной
культурой и исследуемыми препаратами 55
Хроматографические методы 56
Колориметрические определения 59
Обработка высокомолекулярного материала из культуральной жидкости 45% фенолом 63
Определение содержания жирных кислот 63
Выделение и.очистка экзополисахарида из культуральной жидкости 64
Методы выделения ЛПС из наружной мембраны 64
Получение О-ПС посредством кислотного гидролиза ЛПС ... .66
Обработка полисахарида ультразвуком 66
Удаление белковых примесей с помощью проназы 66
Определение вязкости полисахарида 66
Обработка водных растворов полисахаридов хлороформом . . 67 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 68
3.1. Выделение и определение физико-химических свойств ЛПС и О-ПС
X campestris pv. campestris 8183а 68
3.1.1. Получение и выделение ЛПС наружной мембраны бактерий
X. campestris pv. campestris 8183а и X. campestris
pv. campestris В 610 68
Хроматографическое разделение ЛПС и определение его химического состава 69
Деградация ЛПС штаммов X. campestris pv. campesrtris 8183а
и В 610 и получение О-ПС штамма X. campestris pv. campesrtris 8183а
и его химический состав 73
3.2. Выделение полисахаридсодержащего продукта из культуральной
жидкости бактерий штаммов Xanihomonas campestris pv. campestris
В 610 и Xanihomonas campestris pv. campestris 8183а и определение его
физико-химических свойств 79
Получение и выделение углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости штаммов бактерий X campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. campestris 8183а 79
Определение и анализ биополимерного состава углеводсодержащих полимеров из культуральной жидкости 82
Определение моносахаридного состава полисахаридсодержащих полимеров из культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris 8183 а, X. campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. vesicatoria В 546 92
3.3. Биологический эффект углеводсодержащих биополимеров бактерий
рода Xanthomonas 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129
ВЫВОДЫ 133
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ .135
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ЛПС - липополисахариды
О-ПС - О-специфический полисахарид
ПСЛК — полисахаридлипидный комплекс
ЭЛПС - экзолипополисахарид
ЛПБК - липополисахаридлипидный комплекс
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭПС - экзополисахарид
ЛОС — липополиолигосахарид
ПВК — пировиноградная кислота
Man - манноза
GlcA — глюкуроновая кислота
Gal - галактоза
Xyl - ксилоза
Rha - рамноза
Rib - рибоза
Glc — глюкоза
Fuc - фукоза
GalA - галактуроновая кислота
GalN - галактозамин
GlcN - глюкозамин
ГЖХ - газожидкостная хроматография
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ЖК - жирные кислоты
К ДО - 2-кето-З-дезоксиоктановая кислота
МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот
MaMs — базовый раствор солей макроэлементов
MiMs — базовый раствор солей микроэлементов
Введение к работе
Актуальность темы.
Микроорганизмы рода Xanthomonas являются фитопатогенами широкого спектра действия, охватывающего большинство семейств сельскохозяйственных культур. Экономический ущерб, наносимый заболеваниями, вызываемыми бактериями этого рода, значителен и достигает высоких цифр. В связи с этим изучение ксантомонад начато с периода их выделения и установления их вирулентных свойств.
С целью поиска эффективных средств защиты для борьбы с болезнями, возбудителями которых являются микроорганизмы данного рода, выявление механизмов фитопатогенеза становится одним из приоритетных направлений научных работ в этой области [10,15, 38, 61, 64].
Важнейшей задачей в данной отрасли исследований является нахождение веществ микробного происхождения, ответственных за проявление тех или иных симптомов заболевания. Особую роль во взаимодействии растение-хозяин - микробная клетка играют полисахариды микробного происхождения, т.к. возможность различных вариаций из моносахаридов практически беспредельна [27]. Обусловлено это также высокой реакционной способностью моносахаридов. Исследования в этой области начаты сравнительно недавно [26, 38, 64], в связи с этим основной недостаток существующей информации состоит в её противоречивости. Большинство исследователей считает, что полисахариды ксантомонад биологически активны в отношении растения-хозяина, но этот вопрос остаётся не решённым окончательно.
Известно, что виды этого рода подразделяются на многочисленные патовары, которые отличаются друг от друга способностью вызывать заболевание только у определённых растений. Невыясненным остаётся вопрос, с чем связан механизм специфичности. Некоторые работы
подтверждают, что внеклеточные полисахариды Xanthomonas campestris оказывают специфическое фитотоксичное действие [64, 38]. Результаты других не подтверждают этого [38, 66, 71, 143]. Если утверждение первых верно, то неясно, каким образом это происходит, т. к. моносахаридный состав полисахаридов этого вида схож [10].
Данные по химическому составу и биологическому действию внеклеточных липополисахаридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий немногочисленны [17]. У бактерий рода Xanthomonas они выделены не были. Информация по физико-химическим и биологическим свойствам ЛПС микроорганизмов данного рода носит ограниченный характер [98, 143, 144, 145, 59]. Показано, что при внесении их в корневую область проростков капусты также происходит угнетение роста [59]. Комплексное, сравнительное изучение свойств углеводсодержащих биополимеров ксантомонад позволит более определённо ответить на вопрос об их участии в фитопатогенных процессах.
Цель и задачи исследования.
Цель исследования — выделение и изучение физико-химических и биологических свойств углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и наружной мембраны бактерий Xanthomonas campestris.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Выделить ЛПС из наружной мембраны бактерий X. campestris.
Определить физико-химические свойства выделенного ЛПС.
Получить О-специфический полисахарид (О-ПС) штамма Xanthomonas campestiis pv. campestris 8183а и провести анализ его химического состава.
4. Выделить внеклеточные полисахаридсодержащие биополимеры из
культуральной жидкости бактерий X. campestris pv. campestris и X campestris
pv. vesicatoria, провести сравнительное исследование их физико-химических
свойств.
5. Изучить биологическую активность углеводсодержащих биополимеров
из культуральной жидкости и ЛПС из наружной мембраны X. campestris pv. campestris.
Научная новизна. Впервые показано фитотоксическое действие смеси низкомолекулярных производных (олигосахаридов и модифицированных моносахаридов), фрагментов из полисахаридлипидных комплексов (ПСЛК) и экзолипополисахаридов (ЭЛПС) бактерий шаммов X. campestris pv. campesrtis 8183а, X. campesrtis pv. campesrtis В 610, X. campesrtis pv. campesrtis В 611. Этот тип взаимоотношений описан в фитопатологии впервые. Показано, что полисахаридлипидные комплексы (ПСЛК) штаммов X. campesrtis pv. campestris В 610 и X. campesrtis pv. campestris 8183а также способны оказывать специфическое фитотоксическое действие посредством образования гелевых структур в ткани растения-хозяина. Выявлено, что в результате деполимеризации внеклеточных углеводсодержащих ч биополимеров (ПСЛК) штаммов X. campesrtis pv. campestris В 610, X. campesrtis pv. campestris В 611 и X. campesrtis pv. campestris 8183а происходит расширение спектра специфичности их действия на растения семейства паслёновых, являющихся растениями-хозяевами патовара X. campesrtis pv. vesicatoria. Показано, что полисахарид из культуральной ' жидкости бактерий X. campestris представляет собой сложный биополимер, в состав которого входит липидная часть. Обнаружено различие в количественном моносахаридном составе углеводной части внеклеточных полисахаридов (ПСЛК) бактерий X. campestris pv. campestris штаммов В 610 и X. campestris pv. campestris 8183а и ЭПС X. campestris pv. vesicatoria штаммов В 546, различающихся по растению-хозяину. Впервые выделен и охарактеризован по физико-химическим свойствам экзолипополисахарид (ЭЛПС) из культуральной жидкости бактерии X. campestris и модифицирован метод его выделения. Вьщелен и охарактеризован по физико-химическим свойствам ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. campestris 8183а. Установлен химический состав О-специфического
полисахарида, полученного из ЛПС этого штамма. Впервые для О-ПС бактерий рода Xanthomonas установлено присутствие фукозамина. Произведена сравнительная характеристика ЭЛПС и ЛПС штаммов X. campestris pv. campestris 8183а и X. campestris pv. campestris В 610, установлено различие в их химических и биологических свойствах. Установлена фитотоксичность ЭЛПС, проявляющаяся в виде не описанных ранее для действия данного препарата симптомов заболевания, специфичных для растения-хозяина (семейства крестоцветных), коренным образом отличающихся от изменений, вызываемых ЛПС этого же штамма.
Практическая значимость работы. Изучение свойств углеводсодержащих биополимеров бактерий X. campestris позволяет приблизиться к пониманию взаимоотношений в инфекционном процессе между возбудителем и организмом-хозяином. Полученные нами данные по ) расшифровке механизма вирулентности фитопатогенных бактериозов могут послужить основой для создания эффективных средств борьбы с ними, для определения восприимчивости растений к заболеванию.
Модифицированная нами методика выделения ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas позволяет оптимизировать процесс получения данных веществ ' с целью дальнейшего их изучения.
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова, Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского при выполнении курсовых и дипломных работ, а также при чтении лекций по курсу «Микробиология» для студентов и аспирантов Саратовского государственного аграрного университета им. Н. И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Бактерии рода Xanthomonas способны выделять в окружающую среду два различных биополимера:
а) внеклеточный липополисахарид (ЭЛПС), отличающийся по своему
строению и биологическим свойствам от ЛПС наружной мембраны;
б) углеводсодержащий биополимер из культуральной жидкости,
представляющий собой полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК), в состав
которого входит липидная часть.
2. В состав ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv.
campestris 8183а входит два О-ПС, различающихся по своєму заряду, и
состоящих из остатков рамнозы и фукозамина.
3. Низкомолекулярные производные (олигосахариды и
модифицированные моносахариды), фрагменты из полисахаридлипидных
комплексов (ПСЛК) и экзолипополисахаридов (ЭЛПС) бактерий
X. campestris обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина,
проявляющейся в виде специфических симптомов заболевания. Действие
данных фрагментов имеет более широкий спектр, чем область
фитопатогенного действия самих бактерий.
Внеклеточные углеводсодержащие биополимеры бактерий рода Xanthomonas обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина.
Модифицированный метод Вестфаля является эффективным для раз- * деления и выделения углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости бактерий рода Xanthomonas: ПСЛК и ЭЛПС.
Апробация работы. Материалы исследований, приведённые в диссертации, были представлены на конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Пущино-на-Оке, 1995), Международной конференции молодых учёных «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003); научно-практической коференции «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб"» (Саратов, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, 2 из которых - в журналах ВАК РФ.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Саратовского государственного университета им. Н.И. Вавилова.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, методы и материалы исследования, экспериментальную часть, заключения, выводов и списка литературных источников, содержащего 152 наименования, в том числе - 88 зарубежных. Работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 32 рисунка и 7 таблиц.
