Введение к работе
Актуальность работы. В составе микробиоценоза человека и животных имеются экологические ниши, колонизированные бактериями с весьма высокой плотностью популяций отдельных видов (или групп близких видов). Наиболее исследованными являются колиформные бактерии кишечника (преимущественно представленные E. coli), а также лактобациллы влагалища. Под влиянием различных факторов эти, а также иные микробные популяции нормальной микрофлоры могут изменяться в качественном и количественном отношении, что зачастую приводит к нарушению устоявшегося биоценоза, снижению численности или гибели отдельных представителей, к появлению микроорганизмов, не характерных для данного биотопа, и развитию дисбиотических заболеваний [Oakley et al, 2007]. Существует множество факторов, способных влиять на состав и состояние микрофлоры, и одним из наименее изученных факторов остается фаговая инфекция. Так как бактериофаги обладают, как правило, штаммовой специфичностью [Chibani-Chenouffi et al., 2004], для изучения возможной роли фаговой инфекции в экологии отдельных видов бактерий в симбиотических микробных сообществах человека и животных необходимо иметь возможность оценки уровня внутривидового разнообразия индивидуальных популяций соответствующих микроорганизмов. Для этого необходимы современные молекулярные методы, не требующие много времени и средств, и в то же время, обладающие высокой разрешающей способностью и воспроизводимостью. Так как ряд физиологических и биохимических показателей (чувствительность к фагам, антибиотикорезистентность, продукция токсинов и др.) микроорганизмов, в том числе, медицински важных, являются признаками штаммов, необходимы системы, способные надёжно дифференцировать микробы на внутривидовом уровне.
В качестве объектов исследования мы выбрали две симбиотические микробные системы млекопитающих, для которых имеются основания предполагать значительное воздействие природных бактериофагов на структуру и динамику популяций хорошо охарактеризованных видов бактерий. Это биоценоз кишечника лошади, в котором мы исследовали разнообразие колиформных бактерий, и биоценоз влагалища человека с заселяющими его популяциями лактобацилл.
На настоящий момент данные о составе микробного сообщества влагалища человека на внутривидовом уровне ограничены. В то же время в ряде работ [Blackwell et al.,1999; Kilic et al., 2001] высказывались предположения о возможной роли фаговой инфекции в развитии такого распространённого дисбиотического растройства, как бактериальный вагиноз [Turovskiy et al., 2011]. Предположение о фаговой этиологии части случаев бактериального вагиноза хорошо согласуется с данными об эпидемиологии этого расстройства, характерной для заболеваний, передающихся половым путем [Sprinivasan et al., 2010]. Кроме того, при разработке вагинальных пробиотических препаратов для лечения БВ [Falagas et al., 2007; Aslim et al., 2006] полагают целесообразным учитывать различную индивидуальную совместимость пациенток не только с определенными видами, но и штаммами лактобацилл, что требует данных о динамике как видового, так и штаммового состава сообщества.
Существующие методы видовой идентификации лактобацилл очень трудоёмки и не пригодны для массового анализа, а методы дифференциации их штаммов практически не разработаны. Представление о Lactobacillus acidophilus как о практически единственном представителе нормальной микрофлоры влагалища со времен Дедерлейна [Thomas S., 1928] непоколебимо просуществовало почти столетие. Только с внедрением молекулярно-генетических методов исследования появилась возможность на новом методическом уровне изучать композиционные особенности состава микробиоты влагалища, которая играет важную роль в колонизационной резистентности этого органа как защитного барьера репродуктивной системы человека в целом [Antonio et al., 2003; Stoyancheva et al., 2006]. Первые исследования показали значительное видовое разнообразие лактофлоры и отличия её в разных этнических группах женщин и в различных регионах мира, что, по-видимому, является генетически обусловленным [Kilic et al., 2001; Song et al., 1999; Antonio et al., 1999]. Такие исследования могут стать базой для новых терапевтических стратегий в лечении влагалищных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, а также основой при отборе штаммов для создания пробиотических биопрепаратов.
В России ранее не проводилось систематических исследований по видовой идентификации влагалищных лактобацилл у женщин различных возрастных групп и при различном состоянии микробиоценоза влагалища. Проблема внутривидового (штаммового) разнообразия лактобацилл также практически не изучена ни в России, ни в других странах.
В качестве модельного объекта для исследования разнообразия индивидуальных популяций энтеробактерий выбрана экосистема кишечника лошади. Слепая кишка и толстый кишечник лошади содержат сложное микробное сообщество, которое играет важную роль в переваривании целлюлозы и поддержании здоровья животного [Dombek et al., 2000]. В отличие от толстого кишечника человека, где по имеющимся косвенным данным преобладают умеренные бактериофаги и влияние фаговой инфекции на популяции бактерий ограничено [Letarov and Kulikov, 2009; Clookie et al., 2011; Letarov, 2012], в толстом кишечнике лошадей преобладают вирулентные бактериофаги [Letarov and Kulikov, 2009]. Это обстоятельство делает данную экосистему весьма привлекательным модельным объектом для изучения механизмов взаимодействия, взаимной адаптации и микроэволюции фагов и бактерий в микробном сообществе кишечника животных. Для успешного осуществления этих исследований прежде всего необходимы данные о внутривидовом разнообразии индивидуальных популяций колиформных бактерий и надёжные методы типирования штаммов, позволяющие дифференцировать, в том числе, и очень близкородственные изоляты, которые могут, тем не менее, различаться по чувствительности к индигенным бактериофагам.
Целью данной работы является исследование внутривидового разнообразия колиформных бактерий и лактобацилл симбиотических микробных сообществ.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.
-
Разработать надежную и удобную в использовании ПЦР-систему геномного типирования штаммов кишечной палочки и близких к ней видов и сравнить дифференцирующую способность нового метода с существующими методами типирования бактерий.
-
Исследовать внутривидовое разнообразие колиформных бактерий в индивидуальных популяциях кишечных колиформных бактерий лошадей.
-
Оценить применимость масс-спектрометрического метода MALDI-TOF идентификации бактерий для целей видовой и внутривидовой дифференциации изолятов вагинальных лактобацилл и разработать на его основе методику их внутривидовой дифференциации.
-
Сформировать коллекцию изолятов лактобацилл, выделенных из биоматериала здоровых женщин и женщин с нарушением биоценоза половых путей, и охарактеризовать видовое и внутривидовое разнообразие индивидуальных популяций этих бактерий.
-
Исследовать коллекцию изолятов лактобацилл для обнаружения лизогенных штаммов.
-
Оценить изменчивость состава индивидуальных популяций лактобацилл влагалища во времени.
Научная новизна. Создана новая система геномного IS-типирования колиформных бактерий. Система IS-типирования апробирована на серии полевых изолятов колиформных бактерий. Показано, что по дифференцирующей способности, производительности и воспроизводимости новая система превосходит существующие методы геномной дифференциации изолятов энтеробактерий, основанные на ПЦР.
Применение новой системы позволило обнаружить высокое внутривидовое разнообразие колиформных бактерий, населяющих кишечник лошадей.
Разработаны и апробированы на обширной коллекции клинических изолятов подходы к внутривидовой дифференциации вагинальных лактобацилл на основе масс-спектров цельноклеточных лизатов. Анализ индивидуальных популяций лактобацилл выявил низкий уровень их внутривидового разнообразия у большинства женщин, что не было ранее показано другими исследователями.
Практическая значимость работы. 1. Дифференцирующая способность разработанной нами системы IS-типирования штаммов энтеробактерий, сравнимая с фаготипированием, делает ее наиболее предпочтительным методом при исследовании микроэкологии бактериофагов энтеробактерий в естественных микробных системах, таких, как кишечник животных или сточные воды. 2. Дифференцирующая способность ISl-системы, наряду с хорошей воспроизводимостью результатов, могут быть крайне полезны и для целого ряда других задач, например, при прослеживании эпидемиологических цепочек распространения штаммов патогенных энтеробактерий среди людей или животных. 3. Разработанный нами способ внутривидовой дифференциации лактобацилл на основе анализа их белковых спектров (MALDI-TOF) существенно превосходит описанные в литературе методы ПЦР-типирования этих бактерий по производительности, и не уступает им по разрешающей способности. 4. Полученные нами данные об уровнях внутривидового разнообразия индивидуальных симбиотических популяций колиформных бактерий и лактобацилл будут востребованы в дальнейших исследованиях по экологии подобных микробных систем, включая экологию бактериофагов, а также при разработке новых пробиотических и лечебных фаговых препаратов, и стратегий их применения.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: I, II, III, V,VII Молодежных школах конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2003, 2005, 2007, 2011 гг.); Международной научной конференции "Микроорганизмы и биосфера" (Москва, 2007 г.); 18-й Международной конференции «Биология фагов» (18th Evergreen international phage biology meeting) (США, Эвергрин, 2009 г.); 109 Съезд Американского общества микробиологов (The American Society for Microbiology 109th General Meeting) (США, Филадельфия, 2009 г.); Конференции и семинары по научным направлениям Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2011 г.); Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010 г.), Международная научно-практическая конференция «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Автор выражает благодарность и признательность своему научному руководителю к.б.н. Летарову А.В. за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов, к.б.н. Куликову за ценные советы и помощь в освоении молекулярно-биологических методов, д.б.н., доценту Ильиной Е.Н. (НИИ ФХМ) за помощь в проведении отдельных экспериментов и анализе результатов, д.м.н., профессору Анкирской А.С. и к.б.н. Муравьевой В.В. (НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова МЗ РФ) за научные консультации, помощь при выполнении работы и поддержку, д.б.н., профессору Плакунову В.К. за ценные рекомендации, помощь в планировании и выполнении эксперимента, Голомидовой А.К., Прохорову С.Н., к.б.н. Тарасян К.К. за поддержку и полезные советы на протяжении всего выполнения работы.
Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на .... страницах и включают .... рисунков и .... таблиц. Список литературы содержит .... источников.
