Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о листериозе 17
1.1. Краткий исторический очерк изучения возбудителя листериоза 17
1.2. Эколого-эпидемические аспекты листериоза 18
1.3. Микробиология листериоза 30
1.4. Факторы патогенности L.monocytogenes и их участие в развитии инфекционного процесса 38
1.4.1. Факторы патогенности L.monocytogenes, участвующие в адгезии, инвазии эукариотических клеток и внутриклеточном выживании 38
1.4.2. Продукция бактериальных экзоферментов и их вклад в инфекционный процесс 48
1.5. Молекулярно-генетическая организация листерий 52
1.6. Клинико-патогенетические особенности листериоза 59
1.6.1. Патогенез листериозной инфекции 59
1.6.2. Клинические варианты листериозной инфекции 63
Собственные исследования 72
Глава 2. Материал и методы 72
2.1. Материалы 72
2.1.1. Материал 72
2.1.2. Микроорганизмы 72
2.1.3 Животные 76
2.1.4. Среды для культивирования и идентификации бактерий 76
2.1.5. Аппаратура 78
2.2. Методы исследования 79
2.2.1. Микробиологические методы 79
2.2.2. Молекулярно-генетические методы 82
2.2.3. Статистические методы 89
Глава 3. Биологические свойства листерий, изолированных на Дальнем Востоке 97
3.1. Подбор оптимальных питательных сред, схемы выделения, культивирования и изучения биологических свойств листерий 97
3.2. Микробиологическая характеристика листерий, изолированных в Дальневосточном регионе 110
3.2.1. Микробиологическая характеристика листерий, изолированных из биотических объектов 110
3.2.2, Микробиологическая характеристика листерий, изолированных из абиотических объектов 114
3.3.Сравнительный анализ микробиологических свойств L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европей ской части России 118
3.4. Факторы патогенности у L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке 121
3.5. Гены патогенности у L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке 124
3.6. Сравнительный анализ патогенных свойств L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России 127
3.7. Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных в различных регионах России (Дальнем Востоке и Европейской части) 132
Глава 4. Генетическая вариабельность штаммов L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке России 139
4.1. Спектр генов, кодирующих белки - интерналины у L.monocytogenes 139
4.2. Полиморфизм гена общего метаболизма prs у L.monocytogenes 145
4.3. Сравнительный анализ полиморфизма генов, кодирующих белки интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE), и гєна. prs у штаммов monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и в Европейской части России 152
4.3.1. Структура гена inlB у дальневосточных изолятов L.monocytogenes 159
Глава 5. Филогенетическая характеристика популяции L.monocytogenes, распространенной на Дальнем Востоке Российской Федерации 167
5.1. Серологическая принадлежность изолятов L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке 167
5.2. Фаготипическая принадлежность штаммов L.monocytogenes 173
5.3. Новая система типирования на основании полиморфизма пяти маркерных генов: inlA, MB, inlC, inlE, prs для анализа филогенети ческого положения изолятов L. monocytogenes 176
5.4. Анализ филогенетической принадлежности изолятов L.monocytogenes в зависимости от региона и источника выделения 181
5.4.1. Анализ специфичности филогенетического положения изолятов L.monocytogenes в зависимости от региона выделения 181
5.4.2. Анализ специфичности филогенетического положения изолятов L.monocytogenes и распределения аллелей генов, кодирующих белки-интерналины, в зависимости от источника выделения 183
5.4.3. Анализ аминокислотных замен у изолятов L.monocytogenes, связанный с филогенетическим происхождением и источником выделения 187
5.5. Анализ филогенетического положения изолятов L. monocytogenes, полученных от беременных женщин и мертворожденных плодов на Дальнем Востоке России 190
5.5.1. Филогенетическое разделение среди клинических изолятов L.monocytogenes 191
5.5.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов inlA, inlB nprs у изолятов L. monocytogenes 196
5.5.3. Анализ вариабельности генов инвазии и гена общего метаболизма у клинических изолятов L. monocytogenes внутри филогенетических линий 198
Глава 6. Влияние абиотических факторов на вирулентность штаммов L.monocytogenes 202
6.1. Изменение адгезивных свойств бактерий рода Listeria под влиянием абиотических факторов 203
6.1.1. Изменение адгезивных свойств листерий под влияние температуры 204
6.1.2. Изменение адгезивных свойств листерий под влияние рН среды 210
6.1.3. Изменение адгезивных свойств листерий под влияние экзогенной нуклеиновой кислоты 215
Заключение 221
Выводы 250
Рекомендации для внедрения результатов исследования 252
Список литературы 255
- Микробиология листериоза
- Подбор оптимальных питательных сред, схемы выделения, культивирования и изучения биологических свойств листерий
- Сравнительный анализ полиморфизма генов, кодирующих белки интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE), и гєна. prs у штаммов monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и в Европейской части России
- Изменение адгезивных свойств листерий под влияние температуры
Микробиология листериоза
Согласно определителю бактерий Берджи (9-е издание) род Listeria относится к 19-й группе микроорганизмов - грамположительные не спорообразующие палочки правильной формы [73]. Листерии филогенетически наиболее близки к роду Brochotrix и, вместе с этим родом, занимают промежуточное положение между бациллами и лактобациллами, несколько более удалены от стрептококкоков, Kurthica, Gemella и Erysepilothrix [161]. В настоящее время выделяют 6 видов бактерий, относящихся к роду Listeria — L.monocytogenes, L.innocua, L.ivanovii, L.seeligeri, L.welshimeri, L.grayi.
Микроорганизмы рода Listeria являются мелкими полиморфными грам-положительными палочками с закругленными концами (0,4-0,5 х 0,5-2 мкм), реже встречаются клетки со слегка изогнутыми концами [8], иногда почти кокки, овоиды [80]. В старых культурах листерии окрашиваются по Граму отрицательно. В мазках из инфицированных объектов окружающей среды, например, из силоса, гниющей растительности и почвы, встречаются листерии, имеющие нитчатую форму, длина которых может превышать 350 р. [27]. В литературе встречается описание клеток с утолщениями на концах, чем листерии морфологически напоминают коринебактерии [88, 238]. В мазках из инфицированного патологического материала или жидкой среды встречаются кокковые формы, которые могут быть ошибочно приняты за стрептококки [8, 238]. Листерии могут существовать и в виде L-форм, поэтому бактериологи нередко испытывают трудности при идентификации листерии [83].
В мазках листерии располагаются поодиночке, парами, реже короткими цепочками, в виде частокола или римской цифры V. Могут располагаться группами, параллельно вдоль оси клеток.
Листерии не кислотоустойчивы, не образуют спор и капсул, аэробы, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Растут в широком температурном диапазоне - от 1С до 40С, остаются жизнеспособными и при более высоких температурах - до 70-71С. Оптимальная температура роста - 25 - 37С. Способность размножаться при температуре +4С раньше широко использовалась при индикации листерии из загрязненного материала (метод «холодового обогащения») [238, 239, 372]. При 20 - 25С листерии подвижны за счет образования немногочисленных перитрихиальных жгутиков. При 37С встречаются лишь малочисленные жгутики, обычно один полярный жгутик, редко два-четыре, иногда ни одного и тогда листерии неподвижны.
В препаратах «висячая капля» отмечается кувыркательное и вращательное движение бактерий, которое может чередоваться с периодами относительного покоя. По данным А.А.Триполитовой, Г.В. Борисовой (1965), отличительной особенностью культур листерии является наличие характерных «кувыркающихся» клеток [108].
В литературе описаны наблюдения, что листерии, выделенные от грызунов, подвижны, хотя иногда подвижность выражена очень слабо и приближается к броуновской. Листерии, выделенные при заболевании человека листерио-зом, часто имеют слабую подвижность, и лишь при дальнейшем их культивировании на питательных средах подвижность у молодых культур становится активной [88].
Некоторые виды листерии (L.monocytogenes, L.ivanovii, L.seeligeri) вызывают р-гемолиз на кровяном агаре с эритроцитами барана, коров, лошадей, кроликов и человека. Однако кровь некоторых животных, особенно овечья, содержит антитела против L.monocytogenes. Поэтому в работе рекомендуется использовать эритроциты, отмытые солевым буферным раствором. Штаммы Listeria не агглютинируют отмытые эритроциты человека, кролика, морской свинки, барана.
Необходимо отметить, что L.monocytogenes и L.seeligeri образуют на кровяном агаре узкую зону гемолиза (не более 1 мм) вокруг выросшей культуры, которая может быть усилена с использованием КАМП-теста (метод Christie-Atkins-Munch-Peterson) [158, 418, 454]. У некоторых штаммов L.monocytogenes гемолитическая активность может быть настолько мала, что просветление кровяного агара отмечается только после снятия бактериальной культуры с агара петлей. У L.ivanovii зона гемолиза значительно шире (до 10 мм) и более четкая. Иногда у отдельных штаммов листерий этого вида может наблюдаться выраженный гемолиз с двойными или тройными зонами, если их выращивать на агаре с кровью овец или лошадей [418, 419]. В КАМП-тесте у L.monocytogenes и L.seeligeri отмечается усиление гемолиза в зоне, прилегающей к Staphylococcus aureus, продуцирующего Р-токсин, а у L.ivanovii — в зоне, прилегающей к Rhodococcus eque [392]. В то же время необходимо отметить, что в литературе появилось сообщение о выделении не гемолитического штамма L.seeligeri [457].
Листерий способны размножаться в питательных средах с широким диапазоном рН (5,3-10,3), но оптимальной для них является рН 7,2 - 7,4 [27]. В работах других исследователей чаще указывают на диапазон рН 6 - 9 [417]. По данным MX. Grayi некоторые штаммы растут при рН 9,6, но все, как правило, гибнут при рН ниже 5,5 [238].
Листерий хорошо растут на питательных средах с добавлением NaCl до 10%, а также на многих питательных средах, основу которых составляет мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера, мясо-пептонный агар, картофельный агар, мозговой агар, сердечно-мозговой агар, триптиказо-соевый агар [27, 108, 103, 238]. Рост листерий усиливается при добавлении в среду глюкозы (0,2 -1%). Культуры, выращенные на средах, содержащих глюкозу, имеют характерный кисломолочный запах, который особенно заметен при выращивании их на плотной среде. В исследованиях, проведенных А.А.Триполитовой, Г.В. Борисовой (1965), было отмечено, что повышенные содержания глюкозы в средах не приводят к интенсивному росту листерий, а сдвиги реакции среды в кислую сторону, за счет ферментации глюкозы, неблагоприятно влияют на культуру [108,211].
При выращивании на питательном агаре колонии листерий имеют размер 0,5-1,5 мм в диаметре, круглые, в виде полупрозрачных колоний, похожих на капельки росы, не сильно выпуклые, с тонкоструктурированной поверхностью и сплошным (ровным) краем. Культуры листерий при нормальном освещении имеют голубовато-серый цвет и показывают характерное голубовато-зеленое свечение в косо-проходящем свете. При удалении с агаровой чашки колонии могут быть липкими (прилипать к агару), но легко эмульгируются. После удаления с агара колонии могут оставлять на нем отпечатки. Старые культуры (3-7 дней) являются более крупными (3-5 мм в диаметре) с более темным центром, могут развиваться шероховатые формы колоний [27, 88, 108].
При культивировании листерий в питательном бульоне при 37С через 24 - 48 ч возникает слабое помутнение среды, при встряхивании которой появляются так называемые муаровые волны. В дальнейшем на дне пробирки может возникать слизистый осадок, который при встряхивании поднимается в виде нежной косички, а при сильном встряхивании разбивается и превращается в равномерную взвесь.
Все виды листерий каталазоположительны, оксидазоотрицательны, образуют цитохромы. Некоторые штаммы могут давать отрицательную реакцию на каталазу при культивировании их на средах, содержащих мясной или дрожжевой экстракт. M.E.Friedman, W.L. Aim (1962) отмечали в своих исследованиях, что каталазная активность подавляется в среде, содержащей высокие (до 10%) концентрации глюкозы [211]. В последнее время появились сообщения о выделении каталазонегативных штаммов L.monocytogenes от больных листериозом [143,194,437].
Необходимо отметить, что выделенным культурам листерий присуще непостоянство их биохимических и биологических признаков. Возможно, это связано с тем, что листерий обладают высокими адаптационными свойствами, позволяющие им обитать в разнообразных экологических нишах, в результате чего они способны изменить свою ферментативную активность в зависимости от условий их обитания [27].
Установлено, что практически все тесты по ферментации листериями углеводов, кроме эскулина, не дают 100% идентификации микроорганизма до вида. Листерии ферментируют большинство Сахаров до кислоты, без образования газа. Отечественные ученые рекомендуют при идентификации листерии учитывать их способность разлагать глюкозу, салицин, рамнозу, маннозу и мальтозу, при отсутствии разложения дульцита, инулина и арабинозы [8].
Подбор оптимальных питательных сред, схемы выделения, культивирования и изучения биологических свойств листерий
Первоначально нами была поставлена задача подбора оптимальных питательных сред для изоляции, культивирования листерий, ингибиторов для приготовления селективной дифференциальной среды с целью эффективного выделения культур листерий из разнообразных объектов окружающей среды, клинического материала, что было связано с отсутствием стандартных отечественных сред, а использование сред, предложенных зарубежными авторами, было затруднено из-за дороговизны и дефицита входящих в их состав компонентов.
Для этих целей были разработаны и апробированы на большом количестве материала «Дифференциально-диагностическая среда для листерий» (патент РФ № 2184782 от 10 июля 2002 г., НИИЭМ СО РАМН) (рис. 3), «Комплексная индикаторная среда для дифференциации листерий» (патент РФ № 2303060 от 20 июля 2007 г., НИИЭМ СО РАМН) (рис. 4), модифицирована среда с использованием 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого не только для определения подвижности листерий, но и как тест для определения наличия у листерий фермента дегидролазы (рис. 5). Кроме того модифицированы среды для определения ДНКазы (рис. 6) и липазы (рис. 7) у листерий,
Разработаны питательные среды для культивирования бактерий рода Listeria и других микроорганизмов на основе молок рыб - жидкая (заявка на изобретение № 2008111691 от 26.03.2008, НИИЭМ СО РАМН) (рис. 8) и плотная (заявка на изобретение № 2008132232 от 4.08.2008, НИИЭМ СО РАМН) (рис.9). Как показали исследования, данные питательные среды способствуют быстрому начальному росту бактерий, они просты в приготовлении, используется местное сырье, что значительно удешевляет их стоимость, а по показателям чувствительности и скорости роста бактерий они не уступают современным отечественным и зарубежным средам (рис. 10). Кроме того, экспериментально доказана стабильность сохранения биологических свойств листерий и других микроорганизмов при культивировании их на разработанных на основе молок питательных средах.
Анализируя результаты проведенных экспериментов, мы пришли к выводу, что жидкая питательная среда на основе молок лососевых рыб может быть использована для выращивания тест-штаммов листерий в процессах культивирования с целью накопления большого количества биомассы. Это особенно важно в связи с развитием исследоваїшй в области медицинской биотехнологии и необходимостью создания широкого спектра иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики листериоза.
Во время работы была подобрана оптимальная схема исследования различных проб для выделения листерий (рис.11). Чаще всего прямой высев исследуемого материала (особенно при исследовании проб из объектов окружающей среды - вода, почва - и биологических образцов - клинический материал, органы грызунов) на селективную среду не позволял сразу выявить колонии листерий, что, возможно, было связано с низкой концентрацией бактериальных клеток листерий и значительным числом колоний других видов бактерий в пробе. Поэтому была использована комбинация селективного (при температуре 35 - 37С) и холодового обогащения (4 - 8С) исследуемого материала.
Предварительно исследуемую пробу (измельченного или гомогенизированного образца, в разведении 1:10) помещали в жидкую питательную среду (с селективными питательными компонентами или без них), культивировали при 37С в течение 18-24-48 час с высевом материала через 24 — 48 час, а затем выдерживали при 4 - 6С в течение 1 месяца. Периодически проводили высевы исследуемых проб из холодового обогащения на селективную среду каждые 7 дней.
Было отмечено, что после предварительной инкубации проб при 37С в течение 18-24 час не выявлялся рост листерий в течение 7 дней от начала культивирования, что, возможно, было обусловлено присутствием значительного числа посторонней микрофлоры. Удлинение времени культивирования проб при температуре 4 - 6С до одного месяца приводило к обнаружению листерий на селективных средах, что, было связано со способностью штаммов листерий расти при низкой температуре, а также снижением количества посторонней микрофлоры, связанным с ее гибелью при инкубации в условиях низкой температуры. Присутствие антимикробных препаратов в значительной степени усиливало селективные возможности сред в отношении выделения листерий.
На основании отработанной схемы (рис. 11) было изолировано 238 культур листерий, из них 112 - относились к виду L.monocytogenes (табл. 9).
В ходе исследований выявлено, что на Дальнем Востоке выделяются разнообразные виды бактерий рода Listeria - L.monocytogenes (47,1% от общего числа изолятов), L. innocua (19,7%), L.ivanovii (1,2%), L.seeligeri (2,9%), L.welshimeri (0,8 %) (рис.12).
Бактерии, принадлежащие к роду Listeria, были обнаружены в различных объектах окружающей среды на Дальнем Востоке - в речной воде, наземных растениях, водорослях, изолированы из органов грызунов, морских гидробио-нтов, клинического материала, пищевых продуктов (мясных, молочных, рыбных, мясе птицы), а также из смывов с оборудования на производственных предприятиях. У беременных женщин культуры L.monocytogenes вьщелены из плаценты, секционного материала, отделяемого из влагалища.
Анализ источников исследования показал, что наиболее контаминирова-ны бактериями рода Listeria продукты питания (6,3%). Чаще всего патогенный вид L.monocytogenes выделяли из мясных (12,7 % от числа исследованных образцов), куриных (2,9 %), рыбных (1,6 %), реже - овощных (1,2 %), молочных (0,9%) продуктов. Наряду с L.monocytogenes (2,8 %), часто пищевые продукты были контаминированы и бактериями вида L.innocua (2,7 %), особенно мясные (13,3% от числа исследованных образцов; отечественного и импортного производства), овощи (8,1%), реже рыбные (1,2%).
Таким образом, применив разработанные схему исследования проб, современные селективные и питательные среды, а также среды в авторской разработке, была получена коллекция, включающая 238 изолятов листерий, которую использовали в данной работе.
Сравнительный анализ полиморфизма генов, кодирующих белки интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE), и гєна. prs у штаммов monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и в Европейской части России
В работе провели сравнительный анализ генов, кодирующих белки ин-терналины (inlA, inlB, inlC, inlE) и тона prs, у L.monocytogenes, изолированных в двух географических регионах из разных источников. В исследование были включены 50 изолятов, выделенных на Дальнем Востоке (включая города Владивосток и Хабаровск), и 17 из Европейской части России (включая город Москва, Владимирскую и Тульскую области).
Для проведения сравнения все изоляты были разделены на 3 группы: к первой отнесены L.monocytogenes, выделенные из мертворожденных плодов (п=17), во вторую - культуры л истерий, полученные из органов грызунов (п=13), к третьей - культуры, выделенные из морских гидробионтов (п=13). В контрольной группе находились культуры листерий, изолированные от людей без клинических проявлений листериоза - носители (п=10) и изоляты смешанного происхождения (п=14), которые включали культуры L.monocytogenes, выделенные из объектов окружающей среды, пищевых продуктов и млекопитающих (кроме грызунов). Вся коллекция состояла из изолятов L.monocytogenes, выделенных из клинического материала и органов животных, принадлежащих в большинстве к серовариантам 4Ь и 1/2а. У всех используемых культур первоначально было определено наличие генов, кодирующих интерналины inlA, inlB, inlC, inlE, и для исследования были выбраны внутренние фрагменты этих генов - LRR-домены, непосредственно вовлеченные в процесс взаимодействия листерий со специфическими рецепторами эукариот. Кроме генов, кодирующих интерналины, был секвенирован внутренний фрагмент renaprs (табл. 6 26).
Как видно из табл. 26, фрагменты генов inlE и MB продемонстрировали значительную изменчивость, которая давала 45 и 37 синонимичных, 46 и несинонимичных замен соответственно. Фрагменты генов inlA и inlC были более консервативны (14 и 17 - синонимичных, б и 8 - несинонимичных замен соответственно). У гена prs все замены (24), кроме одной, были синонимичны. Необходимо отметить, что у одного штамма L. monocytogenes (VIMHA009, изолирован из мертворожденного плода) фрагмент гена inlE был укорочен на 69 нуклеотидов.
Число аллелей было сопоставимо для генов inlA, inlC и inlE (11, 12и 11 аллелей соответственно), для фрагмента гена inlB значительно выше (18 аллелей). Самое низкое число аллелей было найдено для гена/?га (6 аллелей). Определенное число аллелей обнаружено для каждого гена у культур L. monocytogenes, изолированных в разных географических регионах Российской Федерации (табл. 26).
Для каждого генного фрагмента были построены дендрограммы, отражающие степень сходства их аллелей (рис. 18, 20 а, б, в, г). На дендрограммах всех фрагментов генов изоляты L. monocytogenes также распределились на 2 ветви, соответствующие их филогенетическому происхождению и коррелирующие с принадлежностью к определенной серогруппе. Единственное исключение наблюдалось на дендрограмме для фрагмента гена inlA (рис. 20 а), где среди изолятов L.monocytogenes 1 филогенетической группы встречались изоляты, относящиеся ко 2 филогенетической группе, которые на дендрограмме сформировали независимые подгруппы (аллели 4, 5 и 6) (рис. 20 а).
Отмечено, что среди дальневосточных изолятов листерий наблюдались специфические для данного региона аллели гена inlA — 1, 2, 10 (рис. 20 а). Исключение составил изолят VIMPR212, полученный из органов шиншиллы в 1970 г. в Европейской части России. Среди изолятов L.monocytogenes с Европейской части специфичными были 5 аллелей гена inlA — 4, 5, 6, 8, 11 (рис. 20 а).
Специфичные аллели гена inlB отмечены для дальневосточных изолятов L.monocytogenes (аллели 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 13, 17, 18) и для изолятов из Ев ропейской части РФ (аллели 7, 11, 12, 15, 16) (рис. 20 б). Кроме того, среди дальневосточных изолятов L.monocytogenes отмечено специфичных для гена inlC 7 аллелей (аллели 1, 3, 4, 8, 9, 10, 12), для гена inlE — 4 аллеля, для гена общего метаболизма prs - 1 аллель. Среди изолятов из Европейской части РФ у этих генов таких аллелей было 3, 4 и 3 соответственно (рис. 18, 19, 20 в, г).
Учитывая большое число специфических аллелей, присущее гену inlB среди культур L.monocytogenes, выделенных на территории Дальнего Востока, мы остановились на рассмотрении этого вопроса более подробно.
Изменение адгезивных свойств листерий под влияние температуры
Одним из важнейших факторов окружающей среды, который оказывает влияние на скорость ферментативных процессов, характер метаболизма бактерий и темпы их размножения, является температура [92, 93, 94, 96]. Установлено, что при низких температурах среды культивирования (6-8С) адгезия к клеткам макроорганизма может усиливаться у разных видов бактерий, увеличивая их патогенный потенциал [93, 94, 96, 106, 107, 300].
Листерий, как факультативные психрофилы, могут расти в широком температурном диапазоне (1 - 45С). Нашей задачей было изучение влияния температуры на адгезивные свойства листериозного микроба. Для этого L.monocytogenes культивировали при разных температурах: холодильника (6-8С), комнатной (20-22С) и температуре человеческого тела (37С).
В качестве модели для изучения адгезивных свойств мы остановились на эритроцитах, так как известно, что они имеют на своей поверхности идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток вещество - гликофорин, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов. Адгезивные свойства листерий оценивали с помощью следующих показателей: 1) среднего показателя адгезии (СПА) - среднего количества микробных клеток, прикрепившихся к одному эритроциту; 2) индексу адгезивности микроорганизма (ИАМ) - среднему количеству микробных клеток на одном участвующем в адгезии эритроците [17].
В ходе экспериментов было установлено, что все виды бактерий рода Listeria способны к взаимодействию с эритроцитами человека, а температура культивирования по-разному оказывает влияние на адгезивные свойства листерий (рис. 27).
Температура 6-8С у одних видов листерий {L.monocytogenes, L.seeligeri, L.welschimeri) усиливала адгезию по сравнению с контролем (20-22С), тогда как при 37С эти свойства у них ослабевали. Наиболее выражены эти проявления у «диких» штаммов L.monocytogenes (СПА 4,0), L.seeligeri (СПА 4,0), L.innocua (СПА = 4,0). У других видов листерий (L.ivanovii, L.grayi, L.innocua) холодная температура культивирования вызывала незначительное усиление способности адгезироваться к эритроцитам человека по сравнению с температурой 37 С.
Анализ адгезивных свойств у бактерий вида L.monocytogenes различных серовариантов, культивируемых при 6-8С, 20-22С и 37С, показал, что низкая температура усиливает адгезивные свойства у серовариантов 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, 4а, 4c, 4d. Особенно этот эффект выражен у L. monocytogenes серовариантов 1/2а, 1/2с, 4а и 4с (СПА от 4,24 до 4,53) (табл. 38).
При оценке среднего показателя адгезии у Холодовых вариантов листерий мы выделили две группы, которые имели различия между собой. В первую группу вошли штаммы, показавшие наиболее высокие уровни адгезии (СПА) при температуре 6-8С. К ним относились сероварианты - 1/2а, 1/2с, 4а и 4с. По сравнению с температурой 37 С, СПА у Холодовых вариантов L.monocytogenes данных серовариантов возросли в 1,8 раз, 1,5 раз, 1,35 и 2,2 раз соответственно. Во вторую группу были отнесены сероварианты L. monocytogenes со средним уровнем адгезии (СПА находился в пределах от 2,97 до 3,52) - 1/2Ь, За, 4b, 4d.
Необходимо отметить, что у L. monocytogenes сероварианта За при 6-8С произошло снижение показателей СПА (СПА = 2,97±0,11; р 0,05), а у 4Ь и 7 -они остались на том же уровне, что и при температуре 37С.
При оценке индекса адгезивности (среднему количеству микробных клеток на одном участвующем в адгезии эритроците, ИАМ) L.monocytogenes Холодовых вариантов нами также были выделены две группы. Первая - с высоким адгезивным уровнем самого микроба (ИАМ выше 4) - объединила шесть серо-вариантов - 1/2а, 1/2с, 4а, 4с, 4d и 7. Во вторую группу вошли штаммы со средним уровнем (ИАМ от 2,51 до 4) - 1/2Ь, За, 4Ь. Низких значений СПА и ИАМ у Холодовых вариантов L.monocytogenes не наблюдалось.
Необходимо отметить, что температура 37С повышала адгезию к эритроцитам лишь у L.monocytogenes сероварианта За (СПА = 4,02±0,11; р 0,01), по сравнению с температурой 6-8С, тогда как остальные (кроме 7 сероварианта, СПА = 4,31±0,15; р 0,01) исследованные штаммы L.monocytogenes показали при данной температуре средние значения СПА (от 2 до 4) - 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, 4а, 4Ь, 4с и 4d (табл. 38).
Следовательно, низкая температура (6-8С) усиливала адгезию к эритроцитам большинства серовариантов L.monocytogenes, лишь у 7 сероварианта адгезивные свойства усиливались под влиянием двух температур (6-8С и 37С).
Кроме того, нами было отмечено, что различная температура культивирования никак не повлияла на изменение адгезивных свойств у штамма L.monocytogenes сероварианта 4Ь. Полученные данные позволяют предположить, что температура, при которой длительно находится микроб данного сероварианта, не влияет на его адгезивные свойства на начальных этапах инфекционного процесса.
Следующим этапом наших исследований было установление связи между уровнем адгезии и вирулентностью (LD50) штаммов L.monocytogenes. Для этого заражали мышей внутрибрюшинно разными дозами культур L.monocytogenes серовариантов 1/2а, 1/2Ь, 4а, 4Ь, которые культивировали при температурах 6-8С и 37С. Наблюдения за животными вели в течение 30 дней, с последующим определением LD50 для каждого штамма (табл.39).
Нами отмечено, что у штамма L.monocytogenes сероварианта 4b (NCTC 10527) со средними показателями адгезивной способности LD5o «холодового» варианта составила 2,5х108 КОЕ/мл, а у «теплового» варианта (37С) этот показатель снизился на 2 порядка - 6,3x10б КОЕ/мл. У второго штамма L.monocytogenes сероварианта 4Ь температура 37С привела к изменению LD50 только на один порядок (3,9хЮ КОЕ/мл).
В то же время, при заражении животных «Холодовым» штаммом L.monocytogenes сероварианта 1/2Ь отмечалось снижение LD5o на четыре порядка (6,3x104 КОЕ/мл) по сравнению с «тепловым» штаммом (2,5x108 КОЕ/мл). Похожие результаты отмечались и у штамма L.monocytogenes сероварианта 4а.
Таким образом, полученные данные показали, что температура 6-8С усиливает адгезивные свойства некоторых видов листерий (L. monocytogenes, L.seeligeri, L.welshimeri), что, возможно, будет способствовать более активному проникновению возбудителей в макроорганизм.
При анализе взаимодействия листерий с эритроцитами с помощью светового микроскопа на поверхности эритроцитов выявляли как отдельные бактериальные клетки, так и группы клеток, «соединенных (объединенных)» между собой (рис. 28).
Такая картина наблюдалась у среднеадгезивных и высокоадгезивных листерий при культивировании их в Холодовых условиях. Если культуры листерий были слабоадгезивными, то на поверхности эритроцитов обнаруживались единичные бактерии или они совсем не выявлялись (рис. 28).
Таким образом, полученные нами данные позволяют акцентировать значение влияния температуры на усиление адгезивных свойств листериозного микроба, что создает этим бактериям определенные преимущества и в дальнейшем это может сказаться на инициации инфекционного процесса. Однако необходимо учитывать, что степень адгезии микроба не всегда отражает потенциал вирулентности возбудителя, его способность к инвазии, размножению и выживанию в различных органах и тканях животных [267].
