Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ 2
ВВЕДЕНИЕ 7
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 10
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
I. АППАРАТ ТРАНСКРИПЦИИ У ЭУКАРИОТ 12
-
Транскрипция у эукариот. РНК-полимеразы 12
-
РНК-полимеразы 13
-
Области контроля транскрипции 14
-
Инициация транскрипции РНК-полимеразой II 21
И. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ 25
1 .Компоненты транскрипционного аппарата 25
-
Общие факторы транскрипции 27
-
Активаторы и репрессоры 31
-
Корегуляторы транскрипции 34
III ХРОМАТИН 43
-
Участие хроматина в процессе транскрипции 43
-
Гетерохроматин и эухроматин 46
-
Хроматин-ремоделирующие комплексы 51
-
Комплексы, модифицирующие хроматин 56
-
Взаимодействие хроматин-ремоделирущих и модифицирующих комплексов ....71 IV. ПРИНЦИПЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АППАРАТА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ II 72
-
Стадии транскрипции. Модель последовательной сборки РІС 72
-
Модульная структура транскрипционного аппарата 76
PHD 78
AT-hook 80
3.Комбинаторная модель регуляции транскрипции. Синергизм действия и контекст-
зависимая активность факторов транскрипции 81
-
Регуляция транскрипции 85
-
Регуляция активности транскрипционных факторов 88
-
Репрессия транскрипции 90
-
Инициация транскрипции in vivo 92
-
Организация ядра и транскрипция 98
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 103
-
Объекты и задачи исследования 103
-
Материалы и методы 107
1. Реактивы 107
-
Работа с линиями Drosophila melanogaster 107
-
Программное обеспечение. Базы данных 109
-
Работа с ДНК ПО
-
Работа с РНК 115
-
Работа с белками 117
-
Гибридизация in situ и иммуноокрашивание 121
-
Эксперименты в двугибридной системе дрожжей 122
-
Работа с культурами клеток 122
III. РЕЗУЛЬТАТЫ 124
III. 1. Характеристика гена e(y)l/taf9, его мутантных аллелей и белка,
кодируемого этим геном 124
Клонирование гена е(у)1 и создание нового метода клонирования генов Drosophila melanogaster, маркированных высоко копийным мобильным
элементом 124
Изучение структуры гена е(у)1 129
Характеристика экспрессии геноа е(у)1 и dd4 у D. melanogaster 131
Изучение молекулярной природы мутации е(у) 1и1 136
Фенотипические проявления мутации e(y)lul 139
Исследование последствий инактивации транскрипции гена e(y)l/taf9 140
Изучение влияния аминокислот С - конца белка TAF9 на активацию
транскрипции гена yellow in vivo 142
Изучение влияния мутации е(у)1и1 на действие энхансеров remyellow 144
Исследование участия TAF9 в энхансер-промоторных взаимодействиях 147
Ш.2. Изучение TFTC комплекса D. melanogaster 150
Введение.... 150
Анализ траснкрипции генов Ada2a и Ada2b у D. melanogaster. 151
Анализ комплексов, в состав которых входят ADА2а и ADA2b 152
Характеристика TFTC комплексов у D. melanogaster 154
ІІІ.З. Структура гена е(у)3, характеристика его мутантных аллелей и белка SAYP,
кодируемого геном е(у)3 157
Клонирование гена е(у)3 и определение его первичной нуклеотидной последовательности. Метод получения перекрывющихся фрагментов
для последующего секвенирования 157
Характеристика структуры гена е(у)3 159
Определение доменной структуры SAYP и его гомологов у различных
видов 162
Изучение экспрессии гена е(у)3. Новый метод увеличения уровня
транскрипции с CMV-промотора 164
Молекулярная характеристика мутаций гена е(у)3 171
Иммунноокрашиваниеполитенныххромосомі), melanogaster 173
Исследование влияния SAYP на экспрессию трансгенов, расположенных
в гетерохроматине 175
Изучение функций SAY-домена in vivo 177
Изучение функцийPHD-доменаin vivo ,...„.;..-.-..,.. 179
Исследование участия SAY-домена SAYP в активации транскрипции
в двугибридной системе дрожжей 180
Определение комплекса, в состав которого входит SAYP 182
IV. ОБСУЖДЕНИЕ 184
Ген е(у)1 кодирует белок TAF9 184
Биологическая функция TAF9 185
Участие TAF9 в транскрипции in vivo 187
Роль аминокислотных остатков C-KOHuaTAF9 in vivo 188
Характеристика состава TFTC-комплекса у D. melanogaster 190
TFTC комплексен D. melanogaster 191
Ген е(у)3 D. melanogaster кодирует новый транскрипционный фактор
SAYP: структура белка 192
Биологическая функция SAYP 193
SAYP является ко-регулятором РНК-полимеразы II, функция
которого зависит от структуры хроматина 194
SAYP является компонентом большого мультибелкового комплекса 196
Модель участия доменов SAYP в активации и репрессии тарнскрипции 197
ВЫВОДЫ 199
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 201
БЛАГОДАРНОСТИ 229
Введение к работе
Одним из важнейших молекулярно-биологических процессов является транскрипция, которая представляет собой первый этап реализации генетической информации. В связи с этим изучение транскрипции у эукариот является одной из главных проблем молекулярной генетики. В настоящее время факторы транскрипции принято делить на три большие группы: активаторы и репрессоры (специфичные регуляторы), корегуляторы и общие факторы транскрипции (General Transcription Factors, GTF). Назначение первых - контроль работы определенного гена или группы генов на определенной стадии развития или при наличии определенных сигналов. Корегуляторы связываются с энхансерами и затем вовлекают GTF, которые необходимы для транскрипции всех генов. Общие факторы транскрипции представляют собой белки и комплексы, участвующие в транскрипции большинства генов. В частности, в области промотора собирается большой преинициаторный комплекс, в свою очередь состоящий из нескольких мультибелковых комплексов, основным из которых является комплекс TFIID. TFIID-комплекс содержит в своем составе белок ТВР и ассоциированные с ним белки TAF (ТВР associated factors). TAF-белки условно подразделяют на основные компоненты TFIID, присутствующие в каждом комплексе, и на TAF, которые входят в состав только части комплексов TFIID, участвуя в регуляции транскрипции определенных групп генов. Наконец, некоторые TAF присутствуют и в других белковых комплексах, помимо TFIID.
Белки-регуляторы транскрипции (транскрипционные факторы) исключительно важны для жизнедеятельности организма. Это подтверждает тот факт, что более 5 % генов высших эукариот кодирует транскрипционные факторы. У дрожжей их количество составляет около 300 (в среднем один фактор на 20 генов), у дрозофилы -1000 (один фактор на 14 генов), у человека - около 3000 (один фактор на 10 генов).
Ядро клетки высших эукариот содержит нескольких десятков тысяч структурных генов, каждый из которых обладает определенным набором цис-регуляторных последовательностей, определяющих его функционирование на различных этапах развития организма, в определенных условиях внешней и внутренней среды. Аппарат транскрипции, обеспечивающий функционирование подобной сложной системы, представляется в настоящее время как чрезвычайно сложная многоуровневая система взаимодействующих факторов и их комплексов, тесно интегрированная с другими системами клетки. Однако механизмы действия аппарата транскрипции in vivo до сих пор остаются во многом неизученным, в частности, очень мало известно о деталях механизма активации и репрессии конкретных генов.
ДНК эукариот упакована в хроматин, который препятствует взаимодействию транскрипционных факторов с ДНК и тем самым блокирует транскрипцию генов. В клетке имеется целый ряд комплексов, которые, изменяя структуру хроматина, участвуют в регуляции транскрипции. Такие комплексы можно подразделить на две основные группы: АТФ-зависимые комплексы, локально изменяющие физическую структуру хроматина (ремоделирующие комплексы) и комплексы, осуществляющие различные химические модификации N-концов гистонов (модифицирующие комплексы).
В общем случае для инициации транскрипции необходимы модификация и ремоделирование хроматина в области промотора и регуляторных последовательностей, что обеспечивает доступность ДНК-матрицы для основных факторов транскрипции и разнообразных активаторов.
Ацетилирование высоко консервативных N-концов гистонов гистонацетилтрансферазами (Histone Acethyl Transferase, HAT) является одной из наиболее хорошо изученных модификаций.
Существуют две теории, объясняющие, как ацетилирование гистонов может влиять на активность транскрипции. Первая теория предполагает, что ацетилирование нейтрализует положительный заряд гистонов, ослабляя таким образом их взаимодействие с ДНК и делая хроматин более «рыхлым», а ДНК - доступной для транскрипционных факторов. Вторая гипотеза не исключает первую, но предполагает также, что существует «гистоновый код» и рисунок ацетилирования может служить эпигенетическим маркером для экспрессии гена, создавая сайты узнавания для факторов, вовлеченных как в активацию, так и в репрессию транскрипции.
Результаты многочисленных исследования продемонстрировали прямую связь между ацетилированием гистонов и активацией транскрипции. Таким образом, исследование белков и комплексов, обладающих НАТ-активностью, имеет большое значения для понимания процессов, проходящих при активации транскрипции у эукариот.
Одним из наиболее хорошо изученных комплексов является SAGA-комплекс дрожжей, содержащий в своем составе гистонацетилтрансферазу GCN5 (GCN5 HAT), белки Ada, Spt, а также некоторые из белков TAF, которые, как было указано выше, одновременно являются компонентами TFIID - основного преинициаторного комплекса. Комплекс, содержащий гистонацетилтрансферазу GCN5 (TFTC), бьш охарактеризован у человека. Недавно были получены данные, что GCN5 НАТ-комплекс, подобный TFTC существует и у дрозофилы.
Настоящая работа посвящена изучению факторов транскрипции РНК-полимеразы II и характеристике TFTC-комплекса у Drosophila melanogaster.
