Введение к работе
Актуальность темы
Известно, что нейродегенеративные заболевания - паркинсонизм, ишемический инсульт и др - важнейшие социальные заболевания, одни из существенных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте Широкое распространение при лечении этих заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием клеток, с модифицированными генами, обеспечивающими терапевтический эффект Особенно перспективна возможность использования региональных стволовых клеток самого пациента, индуцированных к развитию в нужном направлении Наилучшим трансплантационным материалом служат собственные стволовые клетки из красного костного мозга и других тканей, содержащих мезенхимальные стволовые клетки Однако, так как у интактных региональных стволовых клеток существуют ограничения потенциала дифференцировок, существенное значение имеет разработка способов управления специализацией трансплантируемых клеток и повышения их жизнеспособности, а также способов предотвращения образования рубцовой ткани в местах трансплантации
Главными факторами, определяющими природу и рост афферентных и эфферентных волокон трансплантатов, являются среда, в которой находятся трансплантаты мозга, ростовые способности трансплантата, наличие или отсутствие рубца на границе между трансплантатом и мозгом хозяина Однако уже в течение первой недели после операции астроциты реципиента начинают мигрировать в трансплантат и замещать раневой канал глиальным рубцом При этом в глиальных септах и в участках глиального рубца густота врастающих в имплантат капилляров существенно ниже таковой в окружающей ткани мозга реципиента Это может привести к весьма недолгому переживанию трансплантата и его полному отмиранию в результате нехватки питательных веществ уже в течение нескольких месяцев после операции, что, в конечном итоге, сводит эффект к нулю Для достижения лучшей эффективности нейротрансплантации необходима максимальная интеграция трансплантата с мозгом реципиента, что возможно только при отсутствии глио-мезодермальной капсулы (Корочкин, 2000)
Для достижения максимального клеточно- и генно-терапевтического эффекта и обеспечения безопасности для пациента необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в нужном для лечения направлении В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей В разрабатываемых
конструкциях следует предусмотреть возможность управления экспрессией трансгенов В состав этих конструкций не должны входить неприменимые в настоящее время в клинике вирусные элементы
Разработка генных конструкций, сдвигающих дифференцировку стволовых и прогениторных клеток в нейральном направлении, и благоприятно влияющих на приживляемость трансплантата, а также исследование функционирования полученных конструкций в трансфицированных клетках в культуре до и после трансплантации имеют решающее значение для развития клеточной и генной терапии Этому и посвящена настоящая работа
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является поиск путей управления дифференцировкой стволовых клеток, использование трансгенных клеток для трансплантаций в мозг млекопитающих, а также улучшения приживляемое трансплантата Центральным был вопрос исследования с помощью методов молекулярной генетики и клеточной биологии, возможных способов предотвращения формирования рубцовой ткани при нейрохирургических операциях Образование рубца в этих случаях является бичом нейрохирургии и зачастую сводит на нет усилия хирургов по лечению пациентов, страдающих, например, болезнью Паркинсона, хореей Гентингтона, болезнью Альцгеймера и др
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи
1 Получить трансгенные линии дрозофилы, экспрессирующие нейротрофические
факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический
анализ полученных линий
Изучить влияние экспрессии чужеродного нейрального гена на трансгенные клетки дрозофилы
Исследовать воздействие полученных трансгенных клеток на клетки или ткани млекопитающих при кокультивации
Провести ксенотрансплантацию и проанализировать влияние трансгенных клеток, экспрессирующих нейротрофические факторы, на приживляемость трансплантата и на образование глиального рубца
Изучить возможность использования промотора гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 в клетках млекопитающих
Получить трансгенные линии НЕК293, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий
7 Провести трансплантацию клеток трансгенной линии НЕК293 в мозг крысы
Проанализировать влияние нейротрофического фактора на образование глиального рубца
Научная новизна и практическая ценность работы
Несмотря на обилие в мировой литературе экспериментальных данных, показывающих перспективность применения аутологичных стволовых клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний мозга, публикации, посвященные практическим вопросам подготовки и клинического применения этих клеток немногочисленны Данная работа поможет перевести клшпиеское применение новых клеточных технологий при лечении нейродегенеративных заболеваний на систематическую научную основу Нейродегенеративные заболевания - паркинсонизм, ишемический инсульт и др -важнейшие социальные заболевания, одни из главных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте В данной работе предлагается новый подход к лечению нейродегенеративных заболеваний посредством трансплантации клеток носителей нейротрофических факторов Были разработаны различные способы генноинженерных манипуляций с клетками и последующей трансплантацией полученного материала в мозг
1 Создана оригинальная модель доставки нейротрофического фактора в поврежденный участок
мозга млекопитающих с помощью клеток трансгенных линий дрозофилы Экспрессия
чужеродного гена, проходит лишь в промежутке времени, определенном укороченным
жизненным ресурсом клеток дрозофилы в чужеродной ткани млекопитающих При этом данные
клетки-носители не склонны к делению В результате был разработан метод трансплантации
смеси стволовых клеток человека и дифференцированных нервных клеток трансгенных
линий дрозофилы, несущих ген фактора роста под контролем промотора гена теплового
шока
Обнаружено, что присутствие в ко-трансплантанте нейральных эмбриональных клеток дрозофилы, продуцирующих нейротрофический фактор, противодействует образованию глиального рубца. Данный результат имеет значение для разработки терапевтических методов борьбы с глиозом - одной из основных проблем при нейрохирургических операциях
Перед мировой практикой стоит серьезная проблема в связи с использованием вирусных векторов Исследователи пытаются заменить данные вектора более безопасными для человека носителями В нашей лаборатории разрабатывается применение плазмидных векторов для трансфекции Также предложен новый промотор для регуляции экспрессии гена введенного в клетки реципиента. Данный промотор имеет невирусное происхождение и является регулируемой структурой, что позволяет управлять активацией чужеродного гена в клетках Возможность использования невирусных регулируемых структур позволяет включать активность
чужеродных генов лишь в определенные необходимые промежутки времени, что важно для безопасности их клинического применения
4 Для ряда заболеваний необходима постоянная экспрессия определенного гена Для таких случаев была создана модель на основе родственных человеку трансгенных клеток, способных экспрессировать чужеродный ген постоянно Данная модель обладает рядом преимуществ Использование человеческих клеток обеспечивает длительное их переживание и постоянное продуцирование терапевтического белка.
Полученные результаты имеют практическое и теоретическое значение Появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей В связи с данной работой открывается возможность выработки ряда практических рекомендаций по применению стволовых и прогениторных клеток в хирургии и трансплантологии
Предлагаемые подходы к фундаментальным исследованиям стволовых клеток являются оригинальными и основываются на предложении новой техники анализа и управления поведением стволовых клеток
Апробация работы
Основные результаты докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях, семинарах, в том числе на 16th European Drosophila Research Conference Zurich, 1999, 41th Annual Drosophila Research Conference Pittsburgh, 2000, e^East European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, Moscow-Puschino, 2000, Conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS, Novosibirsk, 2000, Progress m biotechnology and neurobiology - Integrative medicine, Egypt, Hurtada, 2004r, ELSO, Nice, 2004, Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ, Сочи-Дагомыс, 2005
Публикации По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 268 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы Библиография включает в себя 289 источников Работа иллюстрирована 99 рисунками и 6 таблицами
