Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ- 5
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 6
-
Актуальность проблемы 6
-
Задачи исследования 7
-
Научная новизна результатов исследования 7
-
Практическая ценность 7
-
Апробация работы 8
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ВВЕДЕНИЕ 9
ГЛАВА I. МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ У ДРОЗОФИЛЫ 9
-
Классификация 11
-
Ретроэлементы 13
LTR-содержащие элементы 13
LTR-несодержащие элементы 15
2.3. F-элемент 17
- транскрипция F-элемента 18
-
SINE 19
-
Пары LINE/SINE 20 ГЛАВА И. СУФФИКС - ПРИМЕР НЕОБЫЧНОГО SINE 21
-
Некоторые свойства суффикса 21
-
Гомология с F-элементом и другими LINE дрозофилы 23
-
Места интеграции в геноме 23 ГЛАВА III. РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ - ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ
ПОСТТРАНСКРИПЦИОННОГО САЙЛЕНСИНГА 24
2.9. Малые РНК 25
2.10. Механизм и ферменты 26
процессинг dsPHK предшественников 27
объединение в эффекторный комплекс, осуществляющий РНК
сайленсинг 27
- разрезание мРНК и репрессия трансляции 31
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34
-
Линии Drosophila melanogaster 34
-
Штаммы E.coli 34
-
Используемые праймеры 34
-
Стандартные молекулярно-биологические методы 35
создание векторов для эффективной экспрессии в культуре клеток дрозофилы 35
приготовление компетентных клеток и трансформация 35
отбор клонов и выделение плазмидной ДНК 35
выделение плазмидной ДНК для сиквенса и трансфекции в культуру
клеток дрозофилы 36
синтез Р-эонда без использования праймеров методом cool PCR 36
конструкции для поиска промоторной активности 37
секвенирование по Сенгеру 37 3,5.3'RACE 38
-
Выделение тотальной, поли(А)+ и поли(А)" РНК из эмбрионов, личинок, куколок и имаго дрозофилы 3 9
-
Нозерн-блоттинг и гибридизация 40
-
Трансфекция ДНК-конструкций в культуру клеток Schneider 2 дрозофилы 41
-
Primer-extention 41
3.10. ПААГ-электрофорез и электроблоттинг для анализа siPHK 41
3.11 In situ гибридизация с DIG-мечеными РНК-пробами на терминальных
тканях дрозофилы 42
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 44
-
Паттерны транскрипции суффикса и F-элемента различны 44
-
Обнаружен короткий транскрипт суффикса в куколках 48
-
Обе цепи суффикса и F-элемента транскрибируются 49
-
Суффикс-специфические siPHK обнаружены только в куколках 49
-
Обнаружены транскрипты F-элемента без области суффикса 50
-
Паттерн транскрипции суффикса меняется со временем 52
-
F-элемент имеет 3'-концевой внутренний промотор 53
-
Старт транскрипции суффикса с 3'-концевого промотора в F-элементе совпадает с началом суффикса 58
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 61
5.1. Суффикс - представитель семейства SINE, а не 5'-усеченная копия F-элемента 61
-
Обратная транскриптаза F-элемента обладает высокой процессивностью 61
-
Инсерции суффикса могут сопровождаться образованием дупликаций сайтов-мишеней 61
-
Суффикс участвует в механизме РНК-интерференции 62
-
РНК-интерференция регулируется в развитии 63
-
Модель концертной регуляции работы генов с помощью SINE 64
-
Гипотеза о происхождении SINE с помощью РНК полимеразы И,
стартующей с внутреннего промотора на 3' конце LINE 64
6. ВЫВОДЫ 64
7.ЛИТЕРАТУРА 68
БЛАГОДАРНОСТИ 82
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
LINE - long interspersed nucleotide element - длинные диспергированные повторы
SINE - short interspersed nucleotide element - короткие диспергированные повторы
PR-IN-RT-RH - домены в открытой рамки считывания для гена рої в геноме ретровирусов и ретротранспозонов, соответственно имеющие протеазную, интегразную активности, активность обратной транскриптазы, активность РНК-азы Н
ORF - открытая рамка считывания
LTR - long terminal repeat - длинный концевой повтор
Ьр - пар оснований
kb - тысяч пар оснований
тРНК - транспортная РНК
рРНК - рибосомная РНК
dsPHK - двухцепочечная РНК
RISC - RNA induced silencing complex - РНК зависимый комплекс репрессии
siPHK - short interfering RNAs - малые интерферирующие РНК
1. Общая характеристика работы
1.1. Актуальность проблемы
Существует две точки зрения на роль мобильных элементов в геномах эукариот. Одна из них предполагает, что они являются геномными паразитами и клетка вынуждена защищаться от них и их нежелательной экспрессии. Согласно другой, мобильные элементы привносят в геном повторяющиеся последовательности, необходимые для образования гетерохроматиновых областей, а также различные регуляторные последовательности, находящиеся в их составе, такие как промоторы, инсуляторы и другие, которые клетка использует для регуляции своих генов. Обе точки зрения подкреплены фактами. С одной стороны, накопление мобильных элементов может причинить вред хозяйской клетке, а с другой стороны они могут использоваться клеткой для регуляции работы генов и служить материалом и фактором эволюции.
В геноме дрозофилы обнаружено более десяти семейств LINE и только один короткий ретроэлемент (SINE) - суффикс. Поэтому исследование свойств суффикса, в частности, его транскрипции и возможного происхождения, представляет большой интерес. Ранее по поводу происхождения коротких ретроэлементов в разных геномах было высказано два предположения. Согласно первому из них, ДНК-интермедиаты обратной транскрипции LTR-содержащих ретроэлементов, использующих в качестве праймера тРНК, были внедрены в 3' концевые области LINE (Ohshima et al„ 1996). Вторая гипотеза, подкрепленная некоторыми экспериментальными данными, предполагает, что при обратной транскрипции РНК LINE обратная транскриптаза "перепрыгивает" на тРНК или на 5S РНК матрицы (Szafranski et al, 2004). Но полной ясности в этом вопросе пока нет.
Транскрипция мобильных элементов часто осуществляется в двух противоположных направлениях - или из-за присутствия внутренних смысловых и антисмысловых промоторов, как в случае с F-элементом (Minchiotti and Di Nocera, 1991), или в результате инсерции мобильного элемента в различных ориентациях так, что его транскрипция попадает под контроль какого-то внешнего промотора. Тем самым появляется возможность образования дсРНК и, следовательно, запуска РНК-интерференции.
Сама РНК-интерференция, регулирующая экспрессию многих генов, тоже может регулироваться, что впервые обнаружено в ходе настоящей работы. Недавно обнаружено, что паттерн экспрессии miPHK меняется как в развитии, так и во время физиологических процессов (Не and Hannon, 2004). Это согласуется с нашими данными о регуляции РНК-интерференции. В пользу возможности регуляции РНК-интерференции также свидетельствуют недавние данные о ее ингибировании в растениях (Baulcombe and
Molnar, 2004). Данные о регуляции РНК-интерференции в животных клетках важны как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения, так как в настоящее время активно ведутся исследования по использованию РНК-интерференции в генотерапии различных болезней человека.
1.2. Задачи исследования
F-элемент и суффикс - первый известный пример родства LINE/SINE (Tchurikov et al, 1986; Di Nocera and Casari, 1987), 3' область F-элемента соответствует короткому ретроэлементу суффиксу. Позже были описаны многочисленные примеры пар LINE/SINE в разных геномах (Okada N. et al, 1997).
Целью настоящей работы было изучение на разных стадиях развития транскрипции короткого ретроэлемента - суффикса - из генома Drosophila melanogaster. Были поставлены следующие задачи:
-
Провести анализ транскриптов с обеих цепей суффикса на разных стадиях развития дрозофилы и сравнить их с соответствующими паттернами транскрипции F-элемента.
-
Выяснить, имеет ли F-элемент 3'-концевой промотор, с которого мог бы исходно транскрибироваться суффикс.
1.3. Научная новизна результатов исследования
Обнаружены смысловые и антисмысловые транскрипты суффикса и F-элемента на разных стадиях развития дрозофилы. Впервые обнаружено, что РНК-интерференции регулируется в развитии. В результате поиска промоторной активности во фрагментах ДНК, расположенных на границе F-элемента и присутствующего на его 3'-конце суффикса, обнаружен внутренний промотор, по силе сопоставимый с промотором LTR-содержащего ретропозона дрозофилы burdock, и впервые показано, что короткие ретроэлементы (SINE) могут происходить из родственных им длинных элементов (LINE) путем транскрипции их З'-концевых областей с помощью РНК полимеразы II с внутренних промоторов, расположенных на стыке LINE-SINE.
1.4. Практическая ценность
Обнаруженная в работе суффикс-специфическая РНК-интерференция дает возможность предположить наличие концертного механизма регуляции работы генов, в результате действия которого клетка, за счет присутствия диспергированных копий суффикса на З'-концах некоторых генов, имеет возможность одновременно выключать
интерференции свидетельствуют о том, что не всегда следует ожидать безусловного сайленсинга соответствующих генов, что необходимо учитывать при решении задач генной терапии, направленной на саиленсинг генов, вовлеченных в развитие той или иной патологии.
1.5. Апробация работы
Данные, представленные в работе, докладывались на симпозиуме "Molecular Evolution" (Сорренто, 13-16 июня, 2002), на XIX International Congress of Genetics (Мельбурн, Австралия, 6-11 июля, 2003), на рабочих совещаниях CRDF: "Design of DNA constructs for silencing of HIV-1 genes" (Москва, 16 августа, 2004) и "Use of RNA Interference for Development of Efficient AIDS Therapies" (Москва, 15 ноября, 2004), а также были представлены на 7-ой международной энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Суздаль, Россия, 28 ноября - 2 декабря, 2004).
"...другие трудились, а вы
вошли в труд их."
(Ев. от Иоанна, гл. 4, 38)
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Огромное число людей, избравших сферой своей деятельности науку о живом, исследуют окружающую природу в ее поражающем воображение разнообразии. И это совсем нелегкий труд.
Требуются усилия многих и многих, каждого в своей области, чтобы стал более или менее понятен какой-либо механизм функционирования живого организма. Прорываясь через бесконечное число ошибок, научный мир вырывает крупицы знания, которые остаются по-прежнему бесконечно, пренебрежительно малым перед непознанным. Жизнь во всех ее проявлениях всегда будет оставаться тайной для человека. И все-таки научная деятельность привлекает людей - стремление к познанию даровано человеку Творцом.
Поражает обилие статей в научных журналах по молекулярно-биологической тематике. Конечно, требуется неординарное умение отделять пшеницу от плевел, схватывать главное, чтобы быть в курсе современного состояния интересующей тематики, и не только ее, а и многих смежных дисциплин. В действительно океане научных статей компетентный ученый должен выбирать ключевые, основополагающие, несущие новое знание. К сожалению, автор еще недостаточно преуспел в этом, а вернее, совсем неопытен и растерян в подборе литературы. Поэтому я с благодарностью читала обзорные статьи, помогающие систематизировать разрозненные результаты.
Проблемы, связанные с эпигенетической регуляцией работы генов, с генным сайленсингом, основанном на РНК-интерференции, являются сейчас теми, что находятся в центре усиленного внимания молекулярно-биологической науки.
Мобильные элементы, в силу присутствия в них различных регуляторных последовательностей, рассматриваются как эпигенетические метки. А возможность образования двухцепочечных РНК мобильного элемента из-за транскрипции или с двух разнонаправленных внутренних промоторов, или в разных направлениях с внешних промоторов в месте внедрения делает мобильные элементы активными участниками РНК-интерференции.
Таким образом, вряд ли мобильные элементы, в частности, LINE и SINE, должны рассматриваться как какой-то эгоистический компонент генома. Их регуляторная составляющая, важная для всего генома, доминирует над функцией самоподдержания.
