Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster Сосин Дмитрий Витальевич

Содержание к диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна результатов исследования

Практическая ценность

Апробация работы

Структура и объем работы

Раздел П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1. Введение 12

2. Дистантная регуляция активности генов у дрозофилы 12

2.1. Инсуляторы дрозофилы 12

1. Характерные особенности 12

2. Элементы scs и scs' локуса теплового шока HSP70 13

3. Инсуляторы ретровируса gypsy 15

4. Инсулятор в локусе гена NOTCH 16

5. Инсуляторы комплекса биторакс 17

2. Промотор-нацеливающие последовательности 18

3. Энхансеры дрозофилы 22

1. Общие свойства эукариотических энхансеров 22

2. Механизм действия эукариотических энхансеров на примере 23 гена Abdominal-B Drosophila melanogaster.

2.4. Polycomb и Trithorax зависимая транскрипция 24

1. Сравнение механизмов эпигенетического сайленсенга у 24 Saccharomyces cerevisiae и Drosophila melanogaster

2. Сборка и распространение комплексов модифицирующих 26 хроматин у Saccharomyces cerevisiae

3. Сборка PcG белковых комплексов на генах-мишенях у 27 дрозофилы и позвоночных

4. Сборка trxG белковых комплексов на генах-мишенях у 30 дрозофилы и позвоночных

5. Посттрансляционные хроматиновые метки связанные с PcG 33 и trxG белками

6. Возможный механизм PcG опосредованного сайленсенга 34

7. Возможный механизм trxG опосредованной активации 39 транскрипции

8. Связь между сайленсингом и РНК интерференцией у 40 дрозофилы

9. Распространенность в геноме и биологическая роль PcG 41 белков

3. Дистантная регуляция активности генов в селекторном локусе cut 43

4. Заключение 46

Раздел III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47

1. Биологические материалы 47

2. Использованные праймеры 48

3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе 48

4. Торможение в геле 48

5. Выделение ядерных белковых экстрактов из мух. 49

6. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 49

7. Приготовление компетентных клеток и трансформация 50

8. Отбор клонов 50

9. Синтез Р-эонда без использования праймеров методом cool PCR 51

10. Секвенирование по Сенгеру 52'

11. Нормализация плазмидных конструкций по концентрации 52

1. Нормализация с использованием Саузерн блоттинга 53

2. Нормализация по бромистому этидию 54 12к> Трансфекция 54

Раздел IV РЕЗУЛЬТАТЫ 55

1. Ядерные белки, взаимодействующие с SaulO богато представлены 55 в ядре

2. Энхансер элемента copia усиливает экспрессию репортерного гена 57

3. SaulO является эффективным сайленсером 58

4. SaulO содержит консенсусные последовательности для 61 связывания как активаторов, так и ингибиторов транскрипции

5. В сочетании с энхансером, SaulO является активатором 62 транскрипции

6. Введение инсулятора подавляет активность энхансера 63

7. SaulO-активатор обладает полярностью действия 64

8. Кооперативный эффект SaulO 65

Раздел V ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 67

1. Использование репортерных конструкций является новым 67 удобным и подходом для исследования механизмов дистантной регуляции транскрипции.

2. SaulO является молекулярным переключателем, сочитающим 67 функции сайленсера и активатора транскрипции

3. Поведение SaulO в присутствии инсулятора и энхансера 68 указывает на наличие третичных петлевых структур.

Раздел VI ВЫВОДЫ 70

Раздел VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 71

БЛАГОДАРНОСТИ 90

Список сокращений.

Abd-A Abdominal-A

Abd-B Abdominal-B

BEAF-32 boundary element associated factor of 32 kDa

bit транспозон bluetail

СЫР метод хроматиновой иммунопреципетации

СММ Cellular Memory Module (Клеточные Модули Памяти)

Esc Extra sex combs

E(z) Enhancer of zeste

fa swb facet straw berry

Fab Front-abdominal

FISH метод флуоресцентной in situ гибридизации

HLH-zip белки, содержащие мотив «лейциновая молния»

НР1 гетерохроматиновый белок 1

HS сайт гиперчувствительности к ДНКазе I

iab infra-abdominal

Mod(mdg4) Modifier of mdg4

MTB Malignant Brain Tumor

ORC origin recognition complex

Pc Polycomb

PcG polycomb group

Ph Polyhomeotic

Pho Pleiohomeotic

PRC Polycomb Repressive Complex (Поликомб-Подавляющий Комплекс)

PRE Polycomb Response Elements

Psc Posterior sex combs

PSS pairing-sensitive silencing

PTS promoter-targeting sequence (промотор-нацеливающая последовательность)

Sir silent information regulator

SPB scs binding protein

Su(Hw) Suppressor of Hairy-wing

Su(z) 12 Supressor of zeste 12

trxG trithorax group

Раздел I Общая характеристика работы.

1. Актуальность проблемы

Элементы генома, оказывающие дистантное влияние на транскрипционную активность изучаются более 10 лет, одноко их механизм действия остается во многом не выясненным. В настоящее время, известно, по крайней мере, четыре типа последовательностей участвующих в дистантной регуляции активности генов: энхансеры, сайленсеры, инсуляторы и промотор-нацеливающие последовательности. Ткань-специфические энхансеры, сила воздействия которых на транскрипцию гена-мишени зависит от числа их копий, выделяют в особый класс элементов дистантной регуляции, называемых локус-контролирующими районами (LCR). Согласно наиболее распространенной- и экспериментально обоснованной точке зрения, воздействие элементов дистантной регуляции на ген-мишень осуществляется через образование петлевых структур, сближающих тот или иной регуляторный элемент с промоторной областью гена-мишени. Тем не менее, имеющиеся данные не позволяют сделать однозначных выводов-относительно функциональной принадлежности известных элементов дистантной-регуляции в живой клетке.-

Обнаружение и исследование дистантных регуляторных элементов генома в значительной степени осложнено из-за удаленности этих участков ДНК от своих генов-мишеней [Bondarenko et al., 2003]. В настоящее время для молекулярного анализа таких последовательностей используются многоступенчатые биохимические и молекулярно-биологические методы, что затрудняет интерпретацию получаемых данных. Как следствие, появилось множество противоречивой информации относительно механизмов работы инсуляторов [Celniker and Drewell, 2007], сайленсеров [Fitzgerald and Bender, 2001; McCall et al., 1996; Boivin and Dura, 1998] и других регуляторных элементов генома. По этой причине, создание эффективных модельных систем, адекватно отражающих реальные транскрипционные механизмы в живой клетке, является важной частью подобных исследований.

Обнаруженные на сегодня элементы дистантной регуляции транскрипционной активности обладают ярко выраженными самостоятельными функциями. Тем не менее, есть целый ряд указаний на возможности координированной работы таких элементов. Результатом этой совместной работы могут быть совершенно новые, ранее не наблюдавшиеся регуляторные эффекты [Lin et al., 2004]. Исследование принципов совместной работы

различных регуляторных элементов ДНК важно как с точки зрения понимания фундаментальных принципов, лежащих в основе функционирования генома, так и с медицинской и биотехнологической точек зрения.

Селекторный локус дрозофилы cut является удобным модельным объектом для исследования дистантных взаимодействий. Длина данного локуса составляет более 200 т.п.н. из которых около 120 т.п.н. приходится на регуляторную часть [Johnson et al., 1979; Чуриков и др. 1986]. Продукт локуса содержит гомеодомен и сочетает в себе функции репрессора и активатора транскрипции ряда генов [Nepveu, 2001]. Участие этого белка в регуляции активности таких генов как dPCNA [Seto et al., 2006] и его аналога у млекопитающих делает понятным, почему выключение локуса приводит к появлению деталей [Tchurikov et al., 1989].

Известно, что большую часть генома эукаритических организмов составляют некодирующие последовательности, функциональное значение которых удается выяснить лишь в некоторых случаях [Polyakov et al., 2006]. По этой причине поиск регуляторных последовательностей, расположенных в некодирующих областях представляет собой сложную и трудоемкую задачу.

Большое количество мутаций в регуляторной части локуса cut, описанных в литературе имеют самые разнообразные фенотипические проявления, [Чуриков и др., 1998]. Таким-образом, эта богатая информация может быть использована для поиска важных, с точки зрения регуляции транскрипции, участков генома. Особый интерес представляют мутации-связанные с инсерциями в регуляторную часть локуса различных мобильных генетических элементов (МГЭ). Известно, что в составе МГЭ обнаружены почти все. известные типы элементов дистантной регуляции транскрипции [Ратнер, 2000]. С этой* точки зрения МГЭ представляют собой удобный природный инструмент поиска и анализа генетически важных областей ДНК. Инсерция мобильного элемента gypsy, содержащего инсулятор, перед недавно описанной областью LCR, удаленной от промотора на 80 т.п.н. приводит к появлению жизнеспособных мутантов [Чуриков и др., 1998]. В то же время встраивание мобильного элемента burdock между доменом, содержащим LCR и промотором, приводит к. выключению транскрипционной активности всего локуса до физиологически незначимого уровня и- гибели эмбрионов на ранних стадиях развития-[Tchurikov et al., 1989]. Этот факт является крайне интересным, т.к. показывает, что генетически сложный локус, работа которого обнаруживается на всех стадиях жизненного цикла, может зависеть от короткой последовательности удаленной от промотора на очень большое расстояние. Недавно, в составе LCR была обнаружена область, способная связываться с ядерными белками [Чуриков и др., 1998]. Принадлежность этого фрагмента

ДНК, названного SaulO, к тому или иному типу регуляторных последовательностей ранее не исследовалась. Тем не менее, эта задача представляется крайне важной, т.к. позволит выяснить одну из причин гибели эмбрионов дрозофилы и млекопитающих на ранних стадиях развития.

2. Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось выявление возможных механизмов действия жизненно важной области LCR локуса cut дрозофилы. Были поставлены следующие задачи: 1. Используя генетические конструкции на базе плазмидных векторов, разработать надежную тест-систему, позволяющую количественно оценивать влияние элементов дистантной регуляции дрозофилы на транскрипцию репортерного гена. 2. Провести количественную оценку связывания ядерных белков imago дрозофилы с SaulO областью локуса cut. 3. С помощью разработанной тест-системы выяснить функциональные свойства области SaulO, входящей в состав LCR локуса cut: исследовать влияние SaulO на экспрессию репортерного гена в присутствии энхансера из мобильного элемента copia, а также исследовать влияние инсулятора gypsy на эффекты, вызываемые SaulO.

3. Научная новизна результатов исследования.

На базе плазмидного вектора pGL3-Enchancer (Promega, AC#U4797) создана простая и эффективная система для функционального анализа дистантных элементов генома в культуральных клетках дрозофилы. В данной системе испытана изучаемая область LCR локуса в присутствии энхансера мобильного элемента copia и инсулятора gypsy. Впервые проведен количественный анализ связывания SaulO области LCR локуса cut с ядерными белками. Согласно полученным данным до 95% меченой ДНК SaulO, вошедшей в гель, участвует в образовании комплексов с широко представленным в клетках имаго дрозофилы ядерными белками. В соответствии с нашими расчетами, на одну клетку дрозофилы приходится примерно 230 белковых молекул, способных специфически взаимодействовать с областью SaulO. Эти данные согласуются с информацией о том, что для генов, кодирующих гомеодоменные белки характерна PcG/TrxG зависимая транскрипция, в геноме D. melanogaster обнаружено более 200 генов, являющихся мишенями для белков группы Polycomb.

В результате исследования данной короткой регуляторной области гомеотического гена cut обнаружено, она сочетает противоположные свойства эффективного сайленсера и активатора транскрипции. Для> таких коротких регуляторных элементов предложено название «оксюморон».

Найденные в составе оксюморона локуса cut функциональные консенсусные последовательности для связывания белков групп поликомб и триторакс объясняют ранее описанную способность локуса к его периодической активации в процессе онтогенеза [Иванов и Чуриков, 2001]. Впервые описано присутствие функционально активных PRE и TRE последовательностей в пределах одного короткого (268 н.п.) фрагмента ДНК. На основе полученных данных, предложена модель, объясняющая механизм работы обнаруженного оксюморона в присутствии активного энхансера и инсулятора. Данная модель описывает возможные механизмы взаимодействия между оксюмороном и другими элементами дистантной регуляции транскрипции (энхансером и инсулятором) через образование петлевых структур.

4. Практическая ценность.

Разработанная модельная система может быть эффективно использована как при исследовании индивидуальных элементов генома, влияющих на транскрипцию, так и в исследованиях, изучающих взаимодействие нескольких различных регуляторных элементов. Полученные данные позволяют приступить к детальному исследованию белковых факторов, взаимодействующих с регуляторной областью SaulO (оксюмороном). Уникальные свойства обнаруженного оксюморона могут быть использованы в биомедицинских целях, в том числе при создании конструкций в которых необходимо переключать активность гена-мишени.

5. Апробация работы.

Работа апробирована на лабораторном семинаре в Лаборатории организации генома ИМБ РАН им. В.А.Энгельгардта. Результаты работы были представлены:

1. на Международной конференции «Experimental Biology 2006», посвященной 100-летию журнала J. Biol. Chem, Сан Франциско, США, 1-5 апреля 2006 года;

2. на 8-ой Международной Энгельгардтовской конференции, Сергиев-Посад, Россия, 19 -24 августа 2006 года;

3) на Межинститутском семинаре «Хромосома», Москва, Россия, 21 марта 2007 года.

4) на конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН
«Молекулярная и клеточная биология», Москва, Россия, 2 апреля 2007 года;

5) приняты для представления на 20-ом Международном генетическом конгрессе, Берлин,
Германия, 12-17 июля 2008 года.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

6. Структура и объем работы

Диссертация изложена на 90 страницах, содержит 15 рисунков и 2 таблицы, состоит из вводной части, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения и выводов. Список литературы цитирует 154 работы.

Раздел II Обзор литературы

Введение к работе

Согласно наиболее распространенной на сегодня модели, точный контроль активности генов осуществляется за счет взаимодействий между транскрипционной «машиной» в области промотора и различными дистантно расположенными регуляторными элементами. В настоящий момент времени механизмы действия дистантно расположенных цис-регуляторных элементов, таких как энхансеры, сайленсеры, локус контролирующие районы и др. достоверно неизвестны и находятся на стадии активного изучения. Предполагается, что такой тип регуляции может осуществляться путем образования петель ДНК, в результате чего далеко расположенные регуляторные последовательности оказываются пространственно сближенными с промоторными областями генов [Chambeyron et al 2004]. Энхансеры и сайленсеры способны регулировать, активность генов на больших расстояниях независимо от их положения и ориентации. В то же время инсуляторы способны ограничивать зоны активности энхансеров и сайленсеров, в связи с чем, появилось их другое название - граничные элементы. Формально к инсуляторам принято относить последовательности ДНК, обладающие следующими свойствами: 1) способность изолировать взаимодействия между промотором и энхансером в тех случаях, когда инсулятор расположен между указанными последовательностями [Geyer et al 1992]; 2) предотвращать распространение близлежащих гетерохроматиновых участков а также воздействие позитивных или негативных эффектов положения на экспрессию гена [Kellum et al 1991].

2. Дистантная регуляция активности генов у дрозофилы
2.1. Инсуляторы дрозофилы

2.1.1. Характерные особенности

В геноме дрозофилы обнаружено большое количество инсуляторных последовательностей, в том числе: Мер, Fab-б, Fab-7 и Fab-8, входящие в состав комплекса биторакс (bithorax complex) [ Barges et al 2000, Hagstrom et al 1996, Mihaly et al

1998, Zhou et al 1996], элементы scs и scs', фланкирующие локус гена теплового шока 87А7 [Kellum et al 1991, Kellum et al 1992], инсулятор gypsy в составе gypsy ретротранспозона [Geyer et al 1992, Holdridge et al 1991], а также инсулятор в составе even-skipped промотора, который содержит сайт связывания для GAGA белка [Ohtsuki et al 1998]. Все перечисленные инсуляторы имеют ряд общих свойств, что позволяет сделать предположение о наличии общего для этих последовательностей механизма работы. В то же время специфические свойства каждого граничного элемента свидетельствуют об уникальной роли каждого инсулятора в организации хроматина и регуляции генной активности.

2.1.2. Элементы scs и scs' локуса теплового шока HSP70

Первые экспериментальные свидетельства о существовании последовательностей ДНК, обладающих свойствами инсулятора, были получены при исследовании scs и scs' элементов генома дрозофилы. Предполагалось, что указанные последовательности, обнаруженные на границах 87А7 пуфа теплового шока, ограничивают область хроматина, который переходит в деконденсированое состояние при индукции транскрипции повышением температуры [Udvardy et al 1985]. Scs и scs' последовательности содержат два сайта гиперчувствительных к нуклеазе, между которыми расположен участок ДНК не чувствительный к нуклеазной активности. Вокруг этого участка на расстояниях соответствующих длине нуклеосомы также располагаются сайты с пониженной чувствительностью к нуклеазе. Похожая схема расположения сайтов гиперчувствительности наблюдается и в области предполагаемого /?-глобинового 5'-концевого граничного элемента [Chung et al 1993], а также в инсуляторе, входящем в состав ретровируса gypsy [Chen et al 2001]. Предполагается, что описанная организация хроматина играет непосредственную роль в осуществлении граничной функции. Структура инсуляторов в составе scs и scs' последовательностей ДНК различается и для осуществления работы указанных инсуляторов необходимы разные белки. В scs, последовательности, соответствующие участкам гиперчувствительности к ДНКазе I необходимы для полного блокирования энхансера, в то время как центральный А/Т богатый участок, не чувствительный к нуклеазной активности, не влияет на активность энхансера. Делеция последовательностей, соответствующих некоторым сайтам ограниченной чувствительности к ДНКазе I приводит к неполной блокировке энхансера, но увеличение числа указанных последовательностей полностью устраняет этот эффект и

приводит к полному восстановлению функций граничного элемента [Vazquez et al 1994]. Дальнейшие успехи в исследовании граничных элементов дрозофилы связаны с обнаружением продукта zeste-white 5 (zw5) гена - белка SPB (scs binding protein) [Gaszner et al 1999]. SPB способен связываться in vitro с фрагментом ДНК, состоящим из 24 пар оснований (п.о.), в то время как множественные копии этого фрагмента обладают инсуляторной функцией, то есть обладают способностью блокировать взаимодействия между энхансером и промотором in vivo. Мутации в составе фрагмента ДНК, специфически связывающегося с SPB, приводят к нарушению инсуляторной функции этой последовательности. Аналогичный эффект наблюдается при возникновении мутаций в гене zw5. В структуре ZW5 белка присутствуют мотивы «цинковых пальцев», без которых клетки теряют жизнеспособность. Нуль-мутации в гене являются рецессивными леталями, в то время как гипоморфные аллели приводят к разнообразным плейотропным эффектам в развитии крыльев, щетинок и глаз, что согласуется с данными об участии белка ZW5 в организации структуры хроматина [Gaszner et al 1999]. Последовательности, отвечающие за граничную функцию scs' элемента также, были детально изучены. Группы CG|ATA повторов специфически взаимодействующие с BEAF-32 белками (boundary element associated factor of 32 kDa) отвечают за инсуляторную активность scs' последовательностей [Cuvier et al 1998, Zhao et al 1995]. Мутации в этих повторах, влияющие на способность связываться с BEAF-32 снижают инсуляторную активность scs', в то время как увеличение копийности повтора восстанавливает граничную функцию. Схожие данные, полученные при исследовании инсуляторных последовательностей scs и gypsy свидетельствуют о том, что граничньш- элемент оказывает влияние на транскрипцию только при связывании определенного порогового количества белковых молекул, что в свою очередь приводит к изменению структуры хроматина.

Было обнаружено, что два родственных 32 кДа белка, BEAF-32A и ВЕАЕ-32В, выделенные из ядрышек клеток дрозофилы, способны связываться с scs' последовательностями [Hart et al 1997, Zhao et al 1995]. Эти белки с высокой афинностью связываются с участками ДНК, содержащими три копии CGATA мотива, фланкирующими два участка гиперчувствительности к нуклеазе в составе scs'. ДНК связывающей активностью обладают N-концевые области белковых молекул, имеющие у двух рассматриваемых белков существенные отличия. С-концевые фрагменты у этих белков одинаковы и участвуют в образовании гетеромерного комплекса. Последовательность, содержащая сайт связывания с BEAF-32, обладает свойствами типичного граничного элемента и способна блокировать энхансеры активируемые как

тепловым шоком, так и экдизоном в стабильных трансфектантах [Zhao et al 1995]. Иммуноколокализация BEAF-32 показывает наличие данного белка в специфических районах клеточного ядра и его отсутствие в ядрышке. Также BEAF-32 обнаруживается между полосками окрашенных политенных хромосом дрозофилы у личинок третьего возраста. Не окрашиваемые участки политенных хромосом содержат меньше ДНК чем окрашиваемые и предположительно содержат частично развернутые 30-нм фибриллы. Как ожидается, BEAF-32 присутствует на границе scs'-содержащего хромомера 87А7 а также на одном из краев пуфов, обнаруживаемых на политенных хромосомах у личинок третьего возраста [Zhao et al 1995]. Данное исследование свидетельствует о том, что BEAF-32 возможно играет главную структурную и функциональную роль в распознавании многих граничных элементов в различных участках генома дрозофилы. Недавние исследования свидетельствуют о том, что белки BEAF-32 и ZW5 могут взаимодействовать друг с другом in vitro, что является подтверждением возможного влияния инсуляторов scs и scs' на транскрипцию за счет образования специфических хроматиновых доменов высшего порядка [Blanton et al 2001]. Недавно был обнаружен еще один белок способный связываться с эндогенными инсуляторами scs' [Hart et al 1999]. Этот белок был идентифицирован как транскрипционный фактор DREF, связывающийся с участком ДНК, частично перекрывающимся с последовательностью, узнаваемой BEAF. То есть in vivo указанные белки, возможно, конкурируют за сайт связывания с ДНК. DREF участвует в регуляции активности гена, кодирующего белок необходимый для репликации ДНК и пролиферации клеток. Вытеснение BEAF из центра связывания белком DREF возможно происходит в период быстрой пролиферации и конкуренция белков за связывания с инсулятором показывает возможный механизм регуляции граничной функции.

2.1.3. Инсуляторы ретровируса gypsy

Еще один инсулятор, обнаруженный в геноме дрозофилы находится в ретровирусе gypsy. Инсулятор длиной 350 п.о. расположен в 5' транскрибируемой нетранслируемой области gypsy перед началом открытой рамки считывания gag [Gdula et al 1996]. Инсерция gypsy в некодирующую область генов приводит к появлению ткань специфических мутантных фенотипов из-за неспособности специфических энхансеров связаться с промотором [Geyer et al 1992, Holdridge et al 1991, Jack et al 1991]. Инсулятор gypsy не инактивирует примыкающий энхансер, по этому он сохраняет способность активировать транскрипцию

генов расположенных с другой стороны [Cai et al 1995, Scott et al 1995]. Инсулятор gypsy также может оградить экспрессию трансгена от эффекта положения вызванного прилегающими последовательностями генома [Roseman et al 1993] и защищает от аналогичного эффекта положения точку начала репликации генов хориона дрозофилы [Lu et al 1997]. Этот инсулятор содержит 12 копий последовательности, состоящей из 26 п.о. и являющейся сайтом связывания для цинковых пальцев Su(Hw) белка (Suppressor of Hairy-wing). Сила инсулятора зависит от числа копий повторяющегося элемента. Было показано, что существует линейная зависимость между количеством копий повтора и ингибированием активности энхансера [Scott et al 1999, Spana et al 1990]. Как и другие граничные элементы инсулятор gypsy содержит повторяющиеся участки ДНК с тремя сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I, указывающие на специфичность организации хроматина [Chen et al 2001]. Недавно было показано, что инсулятор gypsy успешно функционирует в геноме S. Cerevisiae [Donze et al 2001].

Инсулятор gypsy возможно является наиболее изученной системой с точки зрения наличия информации о белковых компонентах взаимодействующих с ДНК инсулятора. Одним из этих компонентов является белок Su(Hw), содержащий двенадцать «цинковых» пальцев, участвующих в связывании с ДНК, а также альфа-спиральные районы гомологичные участкам со вторичными спиралями основных HLH-zip белков необходимых для функционирования инсулятора [Harrison et al 1993]. Эти домены опосредуют взаимодействие между Su(Hw) и другим компонентом инсулятора gypsy - белком Mod(mdg4) (Modifier of mdg4), содержащим BTB домен [Dorn et al 1993, Gerasimova et al 1995]. BTB домен необходим для димеризации белка Mod(mdg4) после чего полученный димер взаимодействует с лейциновой молнией Su(Hw) через С-концевой участок Mod(mdg4) [ Ghosh et al 2001].

2.1.4. Инсулятор в локусе гена NOTCH

Обнаружено, что одна из мутаций в локусе гена Notch, facet straw berry (fa swb), приводит к нарушению целостности границы домена, находящейся в междиске ЗС6_ЗС7 и разделяющей диски ЗС7 и дуплет ЗС5,6. В результате мутации удаляется последовательность ДНК, которая в норме служит защитой от эффекта позиции. Этот фрагмент размером 880 п.о. в трансгенных исследованиях, проведенных на системах генов white и hsp70 lacZ, проявляет свойства инсулятора, но не обладает активностью сайленсера. Аналогично scs и scs', на системе максигена и минигена white показано, что

fasvvb последовательность защищает от позитивного и негативного эффекта положения. Молекулярно-генетический анализ также показал наличие трех гиперчувствительных к нуклеазам участков ДНК в составе faswb последовательности [Vazquez et al 2000].

2.1.5. Инсуляторы комплекса биторакс

Парасегментный тип экспрессии генов группы биторакс Ultrabithorax (Ubx), Abdominal-A (Abd-A) и Abdominal-B (Abd-B) осуществляется с помощью сложного набора регуляторных последовательностей расположенных линейно на участке более 300 кб соответственно порядку экспрессии вдоль передне-задней оси.

Эти специфические для парасегментации регуляторные последовательности видимо, разделены граничными элементами обнаруженными исходно в качестве характерной особенности фенотипа усиления функции, наблюдаемого у мутантов с делецией граничных элементов. Результатом мутации является слияние двух соседних парасегмент-специфичных регуляторных элементов в общий функциональный блок [Mishra et al 1999]. Наиболее хорошо изученным из рассматриваемых граничных элементов является Front-abdominal(Fab)-7, расположенный между регуляторными последовательностями infra-abdominal(iab)-6 и iab-7, контролирующими экспрессию Abd-B гена в парасегментах (ПС)Н и ПС12 [Hagstrom et al 1996, Mihaly et al 1998, Zhou et al 1996]. Делеция? граничного элемента в хромосомной ДНК приводит к взаимным помехам между регуляторными участками iab-6 и iab-7 и появлению гомеотического фенотипа у взрослых мух. Эти данные свидельствуют о том, что Fab-7 фрагмент содержит инсулятор регулирующий в норме экспрессию гена Abd-B. В настоящий момент молекулярные механизмы работы этого инсулятора еще не вполне ясны. Было показано, что область Fab-7 инсулятора содержит один слабый, и три сильных сайта гиперчувствительности к ДНКазе I (HS1, HS2 и HS3) [Galloni et al., 1993; Hagstrom et al 1996, Mihaly et al 1998]. Функционально активный инсулятор расположен на участке 1.2 т.п.н., включающем слабый сайт гиперчувствительности к ДНКазе I, а также HS1 и HS2 [Hagstrom et al., 1996; Zhou et al 1996]. HS1 область содержит шесть сайтов связывания для GAGA фактора, расположенных парами. Эти сайты связывания являются важным элементом регуляции транскрипционной активности многих генов, включая гомеотические гены [Lehmann et al., 2004]. Введение в последовательность Fab-7 транспозона bluetail (bit) в области HS1 фрагмента приводит к нарушениям в последовательностях сайтов связывания GAGA фактора [Schweinsberg and Schedl, 2004]. Образующиеся мутанты способны изначально

формировать автономные домены между iab-6 и iab-7, но не способны поддерживать автономность этих доменов в процессе дальнейшего развития. То есть инсулятор Fab-7 содержит подобласти, функционально активные на разных стадиях развития и для нормального и постоянного функционирования Fab-7 необходима совместная работа этих подобластей инсулятора. HS1 фрагмент не является необходимым для инициации активности Fab-7, но его присутствие является критичным для поддержания автономности соответствующих регуляторных iab доменов [Schweinsberg and Schedl, 2004]. Эти данные согласуются с данными о том, что функционально активные сайты связывания GAGA фактора необходимы для энхансер-блокирующей активности Fab-7 [Schweinsberg and Schedl, 2004]. Функциональная активность HS2 области пока не исследовалась.

В комплексе биторакс, функция инсуляторов, разделяющих различные парасегмент-специфичные последовательности заключается в предотвращении взаимодействий между этими последовательностями и поддержании правильной экспрессии генов в каждом сегменте. Тем не менее, описанная структура не объясняет, как регуляторные элементы могут нивелировать действие инсуляторов и активировать транскрипцию гена Abd-B в положенный срок. Возможно, решением этой проблемы является недавно описанная последовательность PTS (promoter-targeting sequence). Эта последовательность, обнаруженная в составе Fab-8 элемента, также содержащего инсулятор, позволяет дистально расположенным энхансерам преодолеть блокирующий эффект Fab-8 инсулятора [Barges et al 2000, Zhou et al 1999].

2.2. Промотор-нацеливающие последовательности

Большинство эпигенетических хроматиновых меток приобретенных во время жизненного цикла, работают только в соматических клетках и не передаются зародышевым клеткам. Считалось, что все эпигенетические изменения хроматина будущего зародыша стираются во время гаметогенеза и оплодотворения, за счет чего и обеспечивается тотипотентность гамет [Rakyan et al. 2001]. Тем не менее, появляется все больше свидетельств того, что специфические хроматиновые маркеры сохраняются в процессе гаметогенеза и передаются следующему поколению [Rakyan and Whitelaw, 2003]. В качестве примеров можно привести обусловленный метилированием сайленсинг локусов agouti и axin-fused у мышей [Morgan et al., 1999], л^/б-опосредованный сайленсинг локуса типа спаривания у

дрожжей [Nakayama et al., 2000], и транскрипционную память, осуществляемую Клеточными Модулями Памяти дрозофилы (Cellular Memory Module (СММ)) [Cavalli and Paro, 1998; Bantignies et al. 2003] в области Fab-7 локуса Abd-B.

Еще одним типом последовательностей, сохраняющих эпигенетические маркеры во время мейоза, являются недавно открытые промотор-нацеливающие последовательности (PTS) из Abdominal-B локуса, входящего в состав Bithorax комплекса дрозофилы [Hendrickson andSakonju, 1995; Hopmann et al., 1995].

Abd-B имеет протяженную 3' регуляторную область, состоящую из четырех регуляторных доменов: iab-5, iab-6, iab-7, и iab-8. Каждый из них контролирует развитие соответствующего абдоминального парасегмента. Например, iab-5 регулирует функцию Abd-B в ПС10 (приблизительно пятый абдоминальный сегмент или А5), іаЬ-б контролирует развитие А6 и т.д. [Mihaly et al., 1998] Соседние iab разделены инсуляторами, такими как Fab-7 и Fab-8. В трансгенных мухах оба инсулятора обладают энхансер-блокирующей активностью, в связи с чем появилось предположение: о существовании дополнительного механизма, позволяющего обеспечить правильные энхансер-промоторные взаимодействия и преодолеть активность инсулятора. Исследование области, расположенной в 15 т.п.н. ниже; промотора [Hendrickson and; Sakonju, 1995; Hopmann et al., 1995] привело к открытию PTS (рис. 1A). PTS представляют собой короткие (порядка 290 н.п.) последовательности, которые позволяют энхансерам: активировать промотор несмотря^ на: наличие активного инсулятора. Они способны усиливать энхансер-промоторные взаимодействия и в большинстве случаев ограничивают область действия энхансера единственным промотором в трансгенных эмбрионах дрозофилы [Lin et al., 2004]. В Abd-B локусе PTS обеспечивают высокоспецифичные промотор-энхансерные взаимодействия на больших расстояниях и позволяют преодолевать активность инсулятора в составе Fab-8 [Zhou and Levine, 1999].

При использовании трансгенов, содержащих PTS и инсулятор и вводимых-в геномі с помощью Р-элементов, обычно получают три типа трнасгенных линий: I) .энхансер нацелен на проксимальный промотор II) энхансер нацелен на дистальный промотор III) энхансер блокируется инсулятором; и не активирует ни один из промоторов (Рис. 1Б). Хотя, эффективность нацеливания промотора варьирует в разных линиях, эффект стабильно поддерживается в последующих поколениях в пределах отдельно взятой линии [Lin et al., 2004]. Этот факт привел к предположению о том, что нацеливание на промотор наследуется эпигенетически. Было выдвинуто два предположения относительно возможного механизма такого наследования. Согласно первой модели, транскрипционная

взаимодействия энхансера с

промотором⁴

локальные

регуляторные

взаимодействия

_Б

Типі

Типі!

Тип II

активация энхансера

^{3 г»}

\

Рисунок 1 Цис-реїуля іорные взаимодействия в Abd-B. (А) 3' регуляторная область Abd-B. (Б) Три типа энхансер-промоторных взаимодействий в трансгенных линиях, содержащих PTS (пояснения в тексте). (В) Возможные механизмы эпигенетического наследования нацеливания на промотор (пояснения в тексте^.

память наследуется за счет особых модификаций ДНК или хроматина (Рис 1В, часть а) способных сохраняться в процессе гаметогенеза и восстанавливать нацеливание на промотор в соматических клетках (Рис 1В, часть с). Согласно второй модели PTS образует стабильную хроматиновую петлю между ДНК в области энхансера и промотором (Рис 1В, часть Ь). Такие петли могут сохраняться в процессе мейоза и за счет этого передаваться следующему поколению (Рис 1В, часть с).

Позже было выяснено, что один PTS может сонацеливать одновременно несколько энхансеров, активных в разное время и в разных тканях, на один и тот же промотор. Более того, эксперименты с эмбриональными энхансерами дрозофилы NEE, HI и IAB5, вводимыми в трансгены в различных комбинациях, показали, что нацеливание не зависит от особенностей энхансера и взаимодействующих с ним белков [Lin et al., 2004]. Помимо этого сонацеливание на один и тот же промотор эмбрионального энхансера IAB5 и энхансера имаго glass подтверждает существование эпигенетического механизма PTS-опосредованной транскрипционной памяти [Lin et al., 2004].

Также было показано, что для первичного нацеливания на промотор необходимо присутствия инсулятора, но в последующих поколениях нацеливание сохраняется и в отсутствие инсулятора. Интересным является и тот факт, что, что нацеливание промотора¹ сохраняется даже после транспозиции Р-элемента на другую хромосому [Lin et al., 2004]. Было предложено несколько моделей, объясняющих подобное поведение инсулятора. Одна из них заключается в том, что инсулятор необходим для перемещения трансгена в определенный компартмент ядра, совместимый с работой PTS. Например, инсулятор suHw связывает трансген с ядерной оболочкой [Gerasimova et al., 2000], а /?-глобиновый инсулятор позвоночных HS4 способен связываться с ядрышком [Yusufzai et al., 2004]. Также известно, что искусственно пришитые к ядерным порам трансгены ведут себя аналогично тому как если бы в их составе присутствовал инсулятор [Gerasimova et al., 2000]. Тем не менее, эта модель не объясняет, почему наличие инсулятора не обязательно после первичного нацеливания энхансера на промотор. Согласно другой модели присутствие инсулятора приводит к образованию особой структуры ДНК или хроматина, узнаваемой PTS и только после этого происходит образование связи между энхансером и промотором. Таким образом, помимо функции разграничения регуляторных доменов, инсуляторы Abd-B локуса необходимы для обеспечения дистантных энхансер-промоторных взаимодействий. Без инсулятора PTS не может произвести первичное нацеливание удаленных энхансеров IAB5 и IAB7 к промоторам [Lin et al., 2004]. Схожие данные были получены при исследовании saHw инсулятора. Было показано, что

спаренный инсулятор скорее активизирует удаленные энхансеры, чем подавляет их активность [Cai and Shen, 2001; Muravyova et al, 2001].

Описанные особенности механизма работы PTS, свидетельствует о том, что функциональная активность целого ряда последовательностей ДНК может быть обнаружена только в модельных системах, учитывающих возможность взаимодействия между различными регуляторными элементами генома.

2.3. Энхансеры дрозофилы

2.3.1. Общие свойства энхансеров

Транскрипция является одним из важнейших процессов, протекающих в живой клетке. Большинство известных регуляторных механизмов транскрипции нацелено на ее первую стадию - инициацию. Зачастую, эта регуляция осуществляете^ при помощи ДНК последовательностей, которые удалены от области воздействия на значительное расстояние. Последовательности, способные активировать транскрипцию на больших расстояниях принято называть энхансерами.

Способность энхансеров активировать транскрипцию гена-мишени in vivo на расстояниях, превышающих 100 т.п.н., является уникальным свойством энхансеров [Bondarenko et al., 2003b]. По всей видимости, активность энхансеров осуществляется через образование петлевых структур, позволяющих осуществить прямое взаимодействие между белками ^ связанными с энхансером и промотором-мишенью [Dean, 2004; Studitsky, 1991]. То есть эффективность действия энхансера во многом определяется особенностями структуры и динамических изменений хроматина, образующего петлю, которые в настоящий момент времени плохо изучены. Точный механизм действия энхансеров на больших расстояниях не выяснен, но имеющиеся данные свидетельствуют о наличии специализированного механизма, позволяющего эффективно связываться с промоторами на больших расстояниях [Studitsky, 1991].

На данный момент, проведено очень небольшое количество in vitro исследований механизмов работы эукариотических энхансеров, действующих на расстоянии. Это связано с низкой эффективностью транскрипционных эукариотических систем, зависимых от РНК полимеразы II [Knezetic et al., 1988]. Восстановление дистантных взаимодействий энхансера в таких системах происходит довольно редко [Laybourn and Kadonaga, 1992]. Имеющиеся модельные системы для прокариотических организмов намного эффективней.

Хотя возможность эффективной работы прокариотических энхансеров на больших расстояниях (по крайней мере, 3.5 т.п.н.) была неоднократно подтверждена [Bondarenko et al., 2003а], мы не можем считать механизм работы таких энхансеров соответствующим тому, который существует у эукариот. Не смотря на целый ряд общих свойств, обнаруживаемых у энхансеров эу- и прокариотических организмов [Bondarenko et al., 2003b], достоверные данные о схожести механизмов работы этих регуляторных последовательностей могут быть получены только после создания эффективных эукариотических модельных систем.

2.3.2. Механизм действия эукариотических энхансеров на примере гена Abdominal-B Drosophila melanogaster

Известно, что каждый регуляторный элемент iab содержит по крайней мере один энхансер, участвующий в сегмент-специфической экспрессии Abd-B в развивающихся эмбрионах дрозофилы. Считается, что взаимодействие этих энхансеров с Abd-B промотором контролируется набором цис-регуляторных элементов и связано с образованием хроматиновых петель [Mihaly et al., 2006; Akbari et al., 2006]. Совсем недавно, впервые была показана in vivo способность эукариотического промотора к физическому взаимодействию с одним из уделенных участков генома [Cleard et al., 2006]. По всей видимости, энхансеры Abd-B не способны самостоятельно формировать петлевые структуры для взаимодействия с промотором и эта функция выполняется другими регуляторными элементами. Наиболее вероятными кандидатами на эту роль являются инсуляторы и PTS. Как именно происходит формирование петлевых структур и связывание энхансеров с промотором Abd-B пока не ясно. Известно, что петли, образуемые между PTS и промотором и инсулятором Fab-7 и промотором имеют существенные различия [Lin et al., 2004]. Не смотря на обилие гипотез, на сегодняшний день есть только одна модель, которая не противоречит имеющимся данным о регуляторных элементах Abd-B. Согласно этой модели Fab-7 работает своего рода переключателем. Будучи связанным с промотором Abd-B, инсулятор Fab-7 изолирует промотор от возможных взаимодействий с активаторами расположенными на энхансере. Когда промотор свободен от инсулятора, энхансер может связаться с промотором. При этом PTS выступает в качестве стабилизатора этого взаимодействия. Данные о том как именно инсулятор покидает промотор противоречивы. Согласно одной из версий это происходит при взаимодействии двух инсуляторов. И такие взаимодействия

действительно обнаруживаются, но далеко не во всех исследованиях [Bantignies et al., 2003].

2.4. Polycomb и Trithorax зависимая транскрипция

Специализация клеток, определяемая уникальным для каждой клетки набором экспрессирующихся генов, основана на наследуемой эпигенетической памяти генной активности, сохраняющейся на протяжении множества клеточных циклов. Наиболее ярким примером такого механизма регуляции являются продукты генов групп Polycomb (PcG) и Trithorax (trxG) дрозофилы, которые способны поддерживать активированное или репрессированное состояние гомеотических генов посредством взаимодействия со специфическими последовательностями J\HK(Polycomb/Trithorax Response Elements (PRE/TRE)) обнаруживаемыми в составе соответствующих генетических комплексов. [Kennison 1995; Simon 1995; Hagstrom and Schedl 1997; Pirrotta 1998].

2.4.1. Сравнение механизмов эпигенетического сайленсенга у Saccharomyces cerevisiae и Drosophila melanogaster

У большинства модельных биологических организмов, в механизмах эпигенетического сайленсенга и активации транскрипции задействованы эволюционно консервативные белки семейств PcG и trxG. В частности, представители trxG семейства белков обнаруживаются в грибах, растениях и животных, что согласуется с представлением о важной роли этих белков в регуляции транскрипционной активности генома. Тем не менее, PcG и trxG белки не были обнаружены в таких хорошо изученных модельных объектах как Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe. Это тем более интересно, что явление сайленсинга было открыто именно на дрожжах.

Рисунок 2 Мозаичность окраски колоний дрожжей и глаз дрозофилы связана с метастабильным состоянием хроматина в генах, определяющих пигментацию. У дрожжей (слева) репрессированное состояние Sir вызывает красную пигментацию; у дрозофилы (справа), репрессированное состояние белков группы поликомб приводит к появлению белой окраски.

Хотя Saccharomyces cerevisiae не используют PcG и trxG белки для регуляции транскрипции, мы решили учесть возможность конвергентной эволюции механизмов саиленсинга у дрожжей и насекомых, т.е. рассмотреть известные на настоящий момент механизмы саиленсинга на наиболее хорошо изученном с этой точки зрения объекте. Транскрипционный сайленсинг подавляет экспрессию генов за счет образования хроматиновых комплексов, выключающих работу не только определенного промотора, но целого домена в котором этот промотор расположен. В пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae, такие комплексы образуются с помощью белков семейства Sir (silent information regulator), а у Drosophila melanogaster с помощью белков группы поликомб (PcG, polycomb group). Как показано на рисунке 2, мозаичный сайленсинг репортерных генов, определяющих пигментацию глаза дрозофилы или колонии дрожжей приводит к схожим фенотипическим проявлениям.

В обоих случаях подавление транскрипционной активности связано с метастабильным состоянием хроматина, которое в большинстве случаев наследуется клетками-потомками, продуцирующими характерное неоднородное окрашивание. То есть способность к эпигенетическому наследованию является общей чертой механизмов саиленсинга у дрозофилы и дрожжей. Тем не менее, есть и существенное отличие. Если у дрожжей сайленсинг осуществляется по принципу «все или ничего», то у дрозофилы выключение транскрипционной активности носит некий накопительный характер, снижая экспрессию до физиологически незначимого уровня.

Как Sir так и PcG опосредованный сайленсинг может происходить только в определенных доменах, содержащих специфические цис-регуляторные последовательности. У дрожжей эти последовательности называются сайленсерами и представляют собой короткие (около 150 н.п.) фрагменты ДНК фланкирующие локус регуляции типа спаривания и содержащие сайты связывания для сиквенс-специфических факторов Rapl, Abfl и ORC (origin

recognition complex). Эти белки запускают образование репрессированного состояния хроматина путем согласованного связывания с комплексом, состоящим из Sir2, Sir3 и Sir4. При других условиях Rapl, Abfl и ORC могут способствовать репликации ДНК или участвовать в активации транскрипции. Аналогичный механизм наблюдается при сайленсенге теломерных участков где Sir2/3/4 комплекс собирается с участием Rapl и уКи70 белков.

Схожим образом, PcG-опосредованный сайленсинг осуществляется с помощью PRE последовательностей ДНК. Эти последовательности могу иметь длину до нескольких сотен н.п. и содержат сайты связывания для PcG белков. Многие ДНК связывающие белки, такие как GAGA-фактор, РНО и Zeste способны связываться с PRE последовательностями, хотя их роль в образовании PcG комплексов пока не ясна. Как и факторы, связывающиеся с сайленсерами дрожжей, перечисленные белки способны-связываться и со многими другими сайтами ДНК, не имеющими отношения к сайленсенгу. В ряде случаев результатом такого связывания является активирующий эффект. Более того, образование Sir и PcG комплексов может происходить только, в результате согласованной кооперативной работы рекрутирующих белков, причем- часть, этих белков должна присутствовать в избыточном количестве.

2.4.2. Сборка и распространение комплексов модифицирующих хроматин у Saccharomyces cerevisiae

У дрожжей сайленсеры работают как платформа на которой собирается белковый комплекс. Сначала с сайленсером связывается Sir2/4 комплекс, к которому затем присоединяется Sir3. Далее комплекс расширяется за счет образования сети* мультивалентных взаимодействий между Sir3 и Sir4 и деацетилироваными лизинами'на-N-конце гистонов НЗ и Н4. Деацетилирование Н4 К16, по-видимому, является критической стадией в расширении комплекса, которое происходит при последовательном циклическом деацетилировании катализируемом Sir2 - консервативной NAD+-3aBHCHMofi гистоновой деацетилазой [Rusche et al 2003]. Sir3 и Sir4 возможно играют дополнительную роль в формировании высших уровней организации хроматина и в заякоревании транскрипционно неактивной ДНК у периферии ядра, где сконцентрированы белки семейства Sir. Перинуклеарное заякоревание требует участие одного или двух белков способных связываться с Sir4: yKu70 или Escl, хотя ни тот, ни другой, не являются необходимыми компонентами при сайленсинге [Gartenberg et al

2004]. Интересно, что Sir2 ортологи были обнаружены в составе E(Z) комплексов у дрозофилы и млекопитающих [Furuyama et al 2004], что свидетельствует о наличии связи между механизмами Sir и PcG опосредованного сайленсинга.

Распространение Sir комплекса блокируется промоторами полимеразы II и полимеразы III, возможно за счет связывания активаторов на которых аккумулируются главные транскрипционные факторы и коактиваторы [Rusche et al 2003]. Ацетилирование гистонов также может выполнять роль барьера и белки подобные Bdfl, которые защищают Н4 АсК16, препятствуют распространению Sir2/3/4. Было показано, что в блокировании распространения Sir комплекса участвуют и другие гистоны, в частности, разновидность Н2А гистона Htzl [Meneghini et al 2003] и гистон НЗ метилированый в положениях К4 или К79. PcG опосредованный сайленсинг может выключать работу генов, удаленных на десятки т.п.н. Тем не менее, в отличие от Sir комплексов, PcG белки остаются локализованными в области PRE последовательности [Ringrose et al 2004]. То есть в основе сайленсинга с участием белков группы поликомб, по-видимому, лежит образование петлевых структур. Это предположение также подтверждается тем фактом, что инсуляторы подобные Su(Hw) или scs могут служить барьерами для PcG опосредованного сайленсинга.

2.4.3. Сборка PcG белковых комплексов на генах-мишенях у дрозофилы и позвоночных

PcG белки могут образовывать 3 разных типа комплексов (см. табл. 1). Поликомб подавляющий комплекс 2 (Polycomb Repressive Complex 2, PRC2) содержит четыре базовых компонента: E(z) (Enhancer of zeste), Esc (Extra sex combs), Su(z)12 (Supressor of zeste 12) и Nurf-55 (у человека EZH2, EED, SUZ12 и RbAp46/48 соответственно). Субъединица E(z), содержащая SET домен, триметилирует лизин 27 гистона НЗ (H3K27me3) [Cao et al., 2004]. Эта метка может специфически распознаваться хромодоменом Polycomb (Рс) [Cao et al., 2004], являющимся субъединицей комплекса типа PRC1. PRC1 состоит из белков Рс, Ph (Polyhomeotic), Psc (Posterior sex combs) и dRing, а также нескольких других компонентов, в частности ТВР-ассоциированных факторов [Saurin et al., 2001].

Таблица 1. PcG комплексы

Недавно, был открыт еще один комплекс, вовлеченный в сайленсинг гомеотических генов - RhoRC [Klymenko et al., 2006]. В состав RhoRC комплекса входят ДНК-специфический белок Pho (Pleiohomeotic) а также белок dSfmbt, кодируемый ЗЬя-подобным геном, содержащим четыре МТВ (Malignant Brain Tumor) домена. Наличие МТВ доменов позволяет dSfinbt специфически связываться с моно- и диметилированными НЗК9 и Н4К20.

Базовые компоненты PRC2 и PRC1 комплексов не содержат специфически связывающихся с ДНК белков. Тем не менее было показано, что Pho способен связываться с субъединицами PRC2 и индуцировать накопление PRC2 комплексов на bxd PRE гена Ubx Дрозофилы [Wang et al., 2004b]. Была предложена простая модель сборки PcG комплексов в соответствии с которой Pho и Pho-подобный белки постепенно рекрутируют компоненты PRC2, после чего происходит связывание PRC1 с НЗК27теЗ метками образованными PRC2. Тем не менее, процесс образования и взаимодействия PcG

комплексов оказался сложнее. Помимо способности связываться с PRC2, Pho может напрялгую взаимодействовать с Рс и Ph субъединицами PRC1 in vitro [Mohd-Sarip et al., 2002]. Присутствие Pho инициирует способность базового комплекса PRC1 (БК) к специфическому связыванию с короткими мотивами, присутствующими в PRE, без участия PRC2 [Mohd-Sarip et al., 2005].

Причем, ДНК в тройном комплексе, образованном PRE участком ДНК, Pho и БК, по-видимому, не содержит гистонов. В этом in vitro восстановленном комплексе, ДНК, содержащая Pho и Рс сайты связывания, обернута вокруг белкового компонента системы и содержит около 400 н.п., что возможно только в том случае, если она не содержит гистонов [Mohd-Sarip et al., 2006]. Отсутствие сердцевинных гистонов в PRE элементах гена Ubx также подтверждается in vivo исследованиями с использованием метода хроматиновой иммунопреципетации (ChIP) [Kahn et al., 2006; Mohd-Sarip et al., 2006]. To есть, H3K27me3 метки, по-видимому, не участвуют в рекрутировании PcG белков на PRE. Наличие Pho-связывающих сайтов не является самодостаточным для связывания- PcG белков с ДНК in vivo, даже в мультимеризованном состоянии и при расположении сайтов аналогично тому, как они расположены в геноме [Dejardin et al., 2005]. Действительно, Pho может образовывать второй комплекс с компонентами INO80 комплекса, отвечающего за ремодделинг нуклеосом, и возможно выполняет другие функции помимо связывания и накопления PcG белков. Выполнение этих функций, по-видимому, опосредовано семейством геномных Pho-связывающих сайтов [Klymenko et al., 2006]. Более того, мутанты дрозофилы, лишенные Pho и Pho-подобного белков погибают на поздней стадии развития и в мутантных слюнных железах большинство PcG сайтов окрашиваются нормально на политенных хромосомах, несмотря на отсутствие Pho в детектируемых количествах [Brown et al., 2003]. Эти данные могут свидетельствовать о том, что рекрутирование PcG факторов может выполняться другими белками в отсутствие Pho и Pho-подобного белков. В качестве кандидатов на эту роль рассматривали такие белки как GAGA фактор, Pipsqueak, Dspl, Grainyhead и семейство Spl/KLF белков [Muller and Kassis, 2006]. Тем не менее, мутации в генах, соответствующих этим белкам не имеют четко выраженного PcG фенотипа, не смотря на их участие как в сайленсинге, так и в активации транскрипции. Можно предположить, что связывание PcG белков с ДНК in vivo обеспечивается комбинацией нескольких ДНК-связывающих факторов, включая уже известные на сегодня белки.

На сегодняшний день, PRE последовательности охарактеризованы только в геноме дрозофилы. Сейчас, к PRE последовательностям принято относить участки ДНК необходимые и достаточные для связывания PcG комплексов и PcG-зависимого

сайленсенга фланкирующих промоторов. Многие из PcG-связывающих сайтов, обнаруженных у позвоночных с помощью СЫР, по-видимому, соответствуют данному определению PRE, но точно проверить это позволят исследования на трансгенах. Эти последовательности ДНК, скорее всего, отличаются от PRE дрозофилы, т.к. три из ДНК-связывающих факторов, вовлеченных в рекрутирование PcG белков (GAGA фактор, Pipsqueak и Zeste) не являются консервативными у млекопитающих.

2.4.4. Сборка trxG белковых комплексов на генах-мишенях у дрозофилы и позвоночных

О сборке trxG комплексов на ДНК известно значительно меньше, чем о формировании PcG комплексов. Белки группы trxG представляют собой довольно гетерогенную группу (таблица 2). Один класс trxG белков состоит из доменных факторов SET аналогичных Тгх и Ashl дрозофилы и MLL позвоночных, а также ассоциированным с ними белками. Второй класс trxG белков состоит из компонентов АТФ-зависимого комплекса подобного¹ SWI/SNF или NURF, то есть комплекса, отвечающего за ремоделлинг хроматина. Механизм сборки на Нох генах белкового комплекса, содержащего Тгх и Ashl белки дрозофилы, а также аналогичных комплексов у позвоночных, в настоящий момент неизвестен [Hughes et al., 2004; Wysocka et al., 2003]. У дрозофилы, Тгх способен связываться с минимальным Fab 7 в слюнных железах в отсутствие транскрипционной" активации [Dejardin and Cavalli, 2004]. В других работах есть указания на то, то второй элемент ДНК, перекрывающийся с bxd PRE выше Ubx, вовлечен в Тгх-зависимое поддержание активированного состояния Ubx [Tillib et al., 1999].

Более того, было показано, что в имагинальных дисках личинок дрозофилы Тгх способен связываться с этим элементом независимо от уровня Ubx экспрессии [Рарр and Muller, 2006], т.е. специфические сайты связывания ДНК рекрутируют Тгх независимо от активности транскрипционных факторов.

В эмбрионах дрозофилы Тгх связан с промоторной областью Ubx гена и bxd элемента постоянно. Но в этой же работе было показано, что Тгх связывается с транскрибированными областями Ubx только после активации [Petruk et al., 2006]. Таким образом, данные о локализации Тгх варьируют в разных статьях. Тем не менее, в первой работе были использованы антитела против С-концевой области Тгх, в то время как во второй использовались антитела к N-концевой области белка. Тгх был протеолитически

Таблица 2. trxG комплексы

расщеплен с помощью Таспазы [Hsieh et al., 2003], и части белка могли ассоциироваться с различными областями хроматина. Для связывания других компонентов trxG с ДНК-мишенью по-видимому необходима ативация. Например, после активации Ubx происходит немедленное связывание Ashl с областью расположенной ниже области старта транскрипции [Рарр and Muller, 2006].

Рисунок 3 PRE и TRE как платформа для связывания белков.

Многие ДНК-связывающиеся белки, такие как Pho (Р), Dspl (D), SP1/KLF (S), Zeste (Z), GAGA фактор (G), Pipsqueak (PQ) и Grainhead (G) участвуют в сборке PcG комплексов на PRE. Сборка PcG и trxG белковых комплексов на PRE не зависит от транскрипционной активности гена. Основные транскрипционные факторы такие как ТВР и Spt5 постоянно связаны с PRE. Дальнейшая активация или сайленсинг гена зависят от дополнительных сигналов связанных с триметилированием гистона НЗ по лизину 4 или 27 соответственно.

Компонент SWI/SNF комплекса Brm также связывается с политенными хромосомами после активации трансгеном, содержащим минимальный Fab-7 элемент [Dejardin and Cavalli, 2004]. Причем мутации сайтов Zeste в Fab-7 предотвращают связывание с Brm, но не с Тгх. То есть множественные сайты связывания на ДНК кооперативно рекрутируют trxG белки необходимые для активации гена.

Суммируя все вышеизложенное, можно сказать, что связывание PcG и trxG белков происходит при участии комбинаторных сигналов от множественных сайтов ДНК. Одновременное связывание множества активирующих и подавляющих транскрипцию

факторов на PRE/TRE предполагает, что они образуют своего рода переключаемые регуляторные платформы (Рис. 3), которые возможно способны считывать сигналы, управляющие развитием на ранних стадиях и модифицировать их в наследуемую форму транскрипционного статуса того или иного гена.

2.4.5. Посттрансляционные хроматиновыс метки связанные с PcG и trxG белками

Известно, что PRC2 комплексы обладают НЗК27-специфической триметилазной активностью [Cao and Zhang, 2004], в то время как trxG комлексы обладают НЗК4 триметилазной активностью [Byrd and Shearn, 2003]. Тем не менее, остается невыясненным, являются ли эти две триметиловые метки элементами одного механизма. Недавний геномный скрининг распространенности обеих меток позволил прояснить их эпигенетическую роль. Компоненты PRC2 комплекса у дрозофилы, мыши и человека обычно обнаруживаются в областях триметилированных по НЗК27 [Boyer et al., 2006]. Напротив, H3K4me3 обнаруживаются в геноме в областях наиболее активно работающих промоторов [Kim et al., 2005].

Исследования Ubx гена дрозофилы с помощью СЫР показали, что Тгх и PcG белки способны специфично связываться с PRE последовательностями Ubx гена в активном и репрессированном состоянии соответственно. Причем, в активном состоянии весь Ubx ген маркирован НЗК27, а в репрессированном НЗК27теЗ обнаруживаются только выше гена и не обнаруживаются в области промотора и кодирующих областей. Отсутствие НЗК27 триметилирования в определенной части гена коррелирует с немедленным связыванием Ashl белка с промотором и триметилированием НЗК4. Тгх воспроизводимо связывается с PRE при отсутствии детектируемых НЗК4шеЗ в области PRE, что было показано с помощью антител к С-концевой области белка. Гомолог Тгх у млекопитающих МЕЫ также отвечает за НЗК4 триметилирование в локусе НОХА9 [Dou et al., 2005], но-нокаут SET домена МП мыши приводит к специфическому уменьшению монометилированных НЗК4 [Terranova et al., 2006] в Hoxd4 и Нохс8 генах. То есть роль Тгх и MLL1 в метилировании гистонов может быть ген-специфичной и, возможно, требует участия других гистоновых метилаз для производства НЗК4теЗ меток связанных с экспрессией генов.

В триметилирование НЗК4 могут быть вовлечены и другие компоненты. Например, у дрожжей, НЗК4 триметилирование требует предварительного моноубиквитинилирования гистона Н2В по лизину 123 с помощью Rad6/Brel [Sun and Allis,2002]. Хотя данные по

участию dBrel дрозофилы в trxG-опосредованной активации отсутствуют, было показано, что образование комплекса между USP7 и ГМФ-синтетазой влияет на PcG-опосредованный сайленсинг путем деубиквитинилирования гистона Н2В [van der Knaap et al., 2005]. To есть гистоны являются своего рода посредниками между активирующим НЗК4 триметилированием, стимулируемым убиквитинилированием Н2В, и выключающим триметилированием НЗК27, требующим деубиквитинилирования Н2В. Помимо НЗК27 триметилирующей активности, PRC2 комплекс содержит изоформу EED белка, который предположительно катализирует триметилирование лизина 26 в гистоне HI (HlK26me3) [Kuzmichev et al., 2004]. Тем не менее, схожие эксперименты на рекомбинантных комплексах с ди- и олигонуклеосомами не подтвердили это предположение [Martin et al., 2006]. Возможно, различие в результатах связано с различием условий проведенных экспериментов, повлиявших на специфичность PRC2 комплексов.

PcG комплексы типа PRC1 обладают эволюционно консервативной гистон-модифицирующей активностью, проявляющейся в убиквитинилировании лизина 119 гистона Н2А (H2AK119ubl) [de Napoles et al., 2004; Wang et al., 2004a]. Это убиквитинилирование необходимо для PcG-опосредованного сайленсинга Ubx гена дрозофилы [Wang et al., 2004а] и НохСІЗ гена мыши [Сао et al., 2005]. Механизм распознавания этих меток в настоящее время не выяснен. Хотя имеются данные и о других модификациях гистонов, ассоциированных с PcG и trxG белками, их роль в настоящее время не ясна. В частности есть данные о том, что триметилирование НЗК9 и Н4К20 сопутствует НЗК27теЗ меткам [Рарр and Muller, 2006].

2.4.6. Возможный механизм PcG опосредованного сайленсенга

Хотя репрессия транскрипции является основным результатом деятельности PcG белков, мы крайне мало знаем о том, как именно это достигается. Не смотря на простоту и широкое распространение модели конденсированного состояния хроматина, существует очень мало прямых свидетельств в поддержку этой точки зрения. И выделенные нативно и восстановленные из компонентов PRC1 комплексы из клеток дрозофилы и человека подавляют АТФ-зависмый ремоделлинг хроматина и транскрипцию in vitro [Shao et al., 1999; Levine et al., 2002; Francis et al., 2001; King et al., 2002]. Недавно было показано in vitro, что комплекс PRC1, восстановленный из базовых компонентов Рс, Psc, dRing и Ph вызывает компактизацию нуклеосомного участка, не содержащего модифицированных

гистонов, что свидетельствует о его возможной репрессивной активности [Francis et al., 2004]. Тем не менее, не ясно, на сколько эти эксперименты отражают процессы, происходящие in vivo, т.к. ни один из компонентов базового PRC1 комплекса не способен к ДНК-специфическому связыванию и для связывания с хроматином пришлось использовать высокие концентрации PRC1. Будет ли PRE-связывающийся комплекс подавлять ремоделлинг при физиологических концентрациях неизвестно. То же относится и к in vitro экспериментам по обнаружению участков компактизации хроматина [Francis et al., 2004]. Не существует четких подтверждений, что PcG комплексы индуцируют компактизацию хроматина. Конденсированное состояние основных известных PcG сайтов в политенных хромосомах D. melanogaster можно объяснить недореплицированностью данных участков [Moshkin et al., 2001; Zhimulev et al., 2003]. Более того, в отличие от гетерохроматинового белка 1(НР1), который в ядрах диплоидных клеток колокализован преимущественно с конденсированными перицентромерными участками (так называемый перицентромерный гетерохроматин), ни один из белков PcG видимо не колокализуется с участками плотной укладки ДНК в диплоидных клетках [Buchenau et al., 1998; Ficz et al., 2005]. В любом случае, до сих пор не ясно может ли конденсированный хроматин подавлять транскрипцию или конденсированное состояние является следствием инактивации транскрипции. Несколько попыток выявить уменьшение доступности участков конденсированного хроматина в генах подвергнутых PcG сайленсенгу дали противоречивые результаты. Даже в тех случаях, где эффект удалось продемонстрировать, первопричиной инактивации генов, по-видимому, являлись другие механизмы [Schlossherr et al., 1994; McCall et al., 1996; Boivin and Dura, 1998; Fitzgerald and Bender, 2001]. Образование стабильно конденсированного хроматина с помощью PcG комплексов довольно проблематично сравнивать с помощью in vivo экспериментов по фотообесцвечиванию, которые показывают динамическое связывание Рс и Ph белков с хроматином в течение нескольких минут [Ficz et al., 2005]. То есть, если PcG белки не компактизуют хроматин и не предотвращают доступ транскрипционной машины к выключаемым генам, должен существовать другой механизм инактивации транскрипции. Эксперементы с генетическими конструкциями, содержащими репортерные гены показывают, что в процесс инактивации вовлечены первичные хроматиновые фибриллы, а не более высокие уровни организации хроматина. Например, когда хорошо охарактеризованный PRE из Ubx гена D. Melanogaster, поместили в конструкцию с репортерным геном lacZ под контролем промотора hsp26 , индуцируемого тепловым шоком, не было найдено значительной корреляции между сайленсингом и связыванием РНК полимеразы II (RNA POL II), ТВР или хит шокового фактора, но зато такая

корреляции была обнаружена с инициацией синтеза РНК Полимеразой II [Dellino et al., 2004]. Хитшоковые промоторы относятся к классу «предустановленных» промоторов в том смысле, что постоянно находятся в конформации способной к связыванию RNA POL П. Схожие эксперименты с другими видами промоторов и на других системах помогут решить вопрос об универсальности полученных результатов.

Еще одна особенность PcG-опосредованного сайленсинга заключается в том, что он может быть заблокирован инсуляторами аналогично тому, как это происходит с энхансерами [Sigrist and Pirrotta 1997; Smith et al., 2004; Mallin et al., 1998; Comet et al., 2006]. To есть один инсулятор встроенный между PRE и промотором блокирует сайленсинг, но два инсулятора расположенные тандемно позволяют преодолеть эту блокировку и приводят к выключению промотора [Comet et al., 2006; Muravyova et al., 2001]. Эти данные свидетельствуют о том, что протяженные ДНК взаимодействия не являются необходимыми для сайленсинга и PcG комплексы связанные с PRE образуют петлевые структуры для взаимодействия со своим промотором. Возможность образования таких петлевых структур была показана в экспериментах по пришиванию Dam метилтрансферазы к Fab-7 области дрозофилы [Cleard et al., 2006]. Также об образовании петлевых структур свидетельствует наличие в составе нативного PRC1 дрозофилы ТВР-связанных факторов [Breiling et al., 2001; Saurin et al., 2001]. В двух недавних исследованиях была непосредственно показана возможность взаимодействия PcG белков с промотором Ubx гена в культуральных клетках эмбрионов дрозофилы [Comet et al., 2006; Kahnetal.,2006].

Известно, что функциональные PRE могут располагаться как непосредственно в области промотора, так и за десятки т.п.н. от него [Negre et al., 2006].

Воздействие таких удаленных PRE на гены-мишени за счет образования петлевых структур представляется наиболее логичным и обоснованным объяснением на сегодня. Тем не менее, детальный механизм выключения транскрипционной активности невполне понятен. Согласно одному из объяснений E(z), связанный с PRE, формирует НЗК27теЗ метки на обширной области, содержащей промотор гена-мишени. Эти метки так или иначе приводят к сайленсенгу соответствующего гена. Другое объяснение заключается в том, что PcG, связанные с PRE за счет образования петель ДНК могут взаимодействовать с компонентами транскрипционной машины, формируемой на промоторе. Связь между выключением сайленсинга и способностью инсулятора предотвращать распространение НЗК27 триметилирования от участка PRE свидетельствует о том, что указанная модификация хроматина может быть прямо или косвенно вовлечена в подавление сайленсинга [Kahn et al., 2006], но в чем именно заключается роль этой

модификации не вполне ясно. Комплексы типа PRC-2 очень консервативны у эукариот, включая такие организмы у которых не обнаружено следов PRC-1 комплексов, например, растения. Растительный гомолог E(z) образует НЗК27теЗ метки по всей длине больших доменов, что приводит к сайленсенгу соответствующего гена-мишени [Schubert et al., 2006]. Каким образом достигается выключение транскрипции гена в отсутствие PRC-1 остается невыясненным. Одно из объяснений состоит в том, что функции PRC-1 берут на себя другие белковые факторы. Например, белок LHP1, который необходим для поддержания эпигенетически репрессированного состояния некоторых эухроматиновых генов [Sung et al., 2006]. Другое объяснение состоит в том, что НЗК27теЗ подавляет транскрипцию непосредственно, например, за счет ингибирования одной из стадий активации транскрипции, предотвращая размещение гистоновых меток связанных с активацией генов, таких как ацетилирование, убиквитинилирование гистона Н2В или триметилирование НЗК4.

Еще одной интересной особенностью НЗК27 триметилирования является распространение этой метки на очень протяженных участках генома, иногда включающих несколько сотен т.п.н. Этот факт, возможно, лежит в основе эпигенетического наследования PcG-зависимого сайленсинга во время деления клеток. Даже если PcG белки диссоциируют из комплекса с ДНК во время репликации и митоза [Buchenau et al., 1998], они способны быстро восстанавливать позиционную связь с исходно неактивным хроматином через взаимодействия с PRE областями. Этот процесс обеспечивается за счет взаимодействия между Рс хромодоменом и НЗК27теЗ. Те же метки могут предотвращать локальное распространение активационных меток и несвоевременную активацию генов. Связывание компонентов PRC2 с PRE могло бы быстро восстановить триметилирование НЗК27 нарушенное во время репликации.

Хотя гистоновые метки могут непосредственно отвечать за PcG-опосредованный сайленсинг, важно отметить, что некоторые PcG-зависимые гены должны быть надежно выключены на протяжении многих клеточных делений. Такой гарантированный сайленсинг возможно требует участия других механизмов, включая рассмотренные выше. Об этом же свидетельствует и тот факт, что выключение транскрипционной активности генов с помощью PcG белков происходит не по принципу «все или ничего», а носит некий накопительный характер, снижая экспрессию до физиологически незначимого уровня. В этой связи логично предположить, что выключение генов с участием PcG белков является результатом координированной работы нескольких механизмов.

В частности, свой вклад в активность PcG и trxG белков могут вносить некодирующие РНК (нкРНК), хотя данные по этому вопросу носят противоречивый характер. В ранних

работах было выдвинуто предположение, что нкРНК, синтезируемая на регуляторных областях Нох генов, может способствовать PcG-зависимому сайленсенгу [см. обзор Schmitt and Paro, 2006]. Дальнейшие подтверждения активирующей роли нкРНК были получены при исследовании регуляторної! области bxd из Ubx гена дрозофилы. В этих исследованиях было показано, что транскрипты bxd обеспечивают связывание Ashl белка с этой областью [Sanchez-Eisner et al., 2006]. Тем не менее, эти данные не соответствуют более ранним, согласно которым Ubx не транскрибируется в тех же клетках что и bxd и эмбриональные bxd транскрипты по-видимому участвуют в PcG-опосредованном сайленсенге, а не в активации Ubx [Petruk et al., 2006]. В частности, не смотря на активно транскрибирующийся bxd, эктопическая активация экспрессии Ubx не была обнаружена. Далее было показано, что репрессия Ubx транскрибирующимся bxd наблюдается в цис положении за счет транскрипционной интерференции и не связано с механизмами РНК интерференции и малыми интерферирующими РНК. Также нкРНК bxd не были обнаружены на личиночных стадиях [Petruk et al., 2006], что говорит о маловероятное вовлечения нкРНК в поддержание репрессированного состояния. В этой связи важной задачей является анализ распределения PcG белков на Ubx гене с транскршщионно активным и выключенным bxd, что позволит прояснить вопрос о влиянии транскрипции bxd на распределение PcG компонентов. Конкретные молекулярные механизмы вовлечения нкРНК в сайленсенг в настоящий момент не выяснены.

На стабильность подавления транскрипции также может оказывать влияние образование субъядерных отделов сайленсенга. Распределение PcG белков дрозофилы в ядре носит неравномерный характер [Grimaud et al., 2006] и количество точек скопления PcG белков (так называемых «PcG телец») прогрессивно уменьшается в процессе развития до уровня значительно меньшего чем количество геномных сайтов связывания, обнаруживаемых с помощью сочетания техник СЫР и микроэррэй (СЫР on chip) [Schwartz et al., 2006; Tolhuis et al., 2006]. Совместное использование техник иммунофлуоресцентного окрашивания и ДНК FISH показало, что множество генов-мишеней PcG белков собраны в один компартмент для увеличения эффективности сайленсинга [Bantignies et al., 2003]. Собирание генов-мишеней PcG белков в PcG тельца могло бы усиливать сайленсинг за счет изолирования кластера от РНК полимеразы.

Метилирование ДНК в клетках млекопитающих также, по-видимому, используется для стабилизации PcG-опосредованного сайленсинга. EZH2 может непосредственно рекрутировать метилтрансферазы (DNMTs) на генах-мишенях [Reynolds et al., 2006; Vire et al., 2005], a DNMT1 в свою очередь способна связываться и накапливать Bmi-1 в PcG тельцах [Hernandez-Munoz et al., 2005]. В двух недавних исследованиях было показано,

что маркированные PcG белками гены являются основными мишенями для метилтрансфераз, что приводит к метилированию de novo генов-мишеней PcG белков и аномальному и перманентному сайленсингу в раковых клетках [Schlesinger et al., 2006]. Для раскрытия механизма, запускающего Р11С2-опосредованное связывание метилтрансфераз во время канцерогенеза необходимы дополнительные исследования.

2.4.7. Возможный механизм trxG опосредованной активации транскрипции

О механизмах активации транскрипционной активности trxG белками известно относительно немного.

Как было сказано выше, роль модифицированных гистонов в PcG опосредованном сайленсинге и trxG опосредованной активации транскрипции не вполне ясна. НЗК4шеЗ может узнаваться PHD доменом типа «цинковый палец» белка Nurf-301 [Li et al., 2006., Wysocka et al., 2006]. NURF комплекс, связанный с trxG-зависимыми промоторами, по-видимому, способствует сборке транскрипционной машины через АТФ-зависимый ремоделлинг нуклеосом. НЗК4теЗ также может способствовать элонгации во время транскрипции. В частности, об этом свидетельствует обнаружение НЗК4теЗ и Ashl ниже промотора [Рарр and Muller, 2006]. Было показано, что НЗК4теЗ способствует транскрипционной'элонгации в генах теплового шока [Smith* et al., 2004]. Также есть данные о том, что компонентом, способствующим элонгации транскрипции, является ТАС1 белок, входящий в состав trxG комплексов дрозофилы [Petruk et al., 2006]. МП, являющийся мышиным аналогом Тгх белка дрозофилы также расположен- вдоль всей кодирующей части гена-мишени, содержащего гомеодомен и мутации МП существенно влияют на способность РНК-полимеразы II к элонгации [Milne et al., 2005]. Суммируя вышеизложенные данные, полученные преимущественно на Д melanogaster, можно сделать заключение, что баланс между сайленсингом и активацией транскрипции генов-мишеней Peg и trxG белков регулируется прямыми взаимодействиями этих белков с транскрипционной машиной, положением специфических эпигенетических меток на гистонах и ДНК, транскрипцией некодирующих РНК и компартментализацией ядра.

2.4.8. Связь между сайленсингом и РНК- интерференцией у дрозофилы.

РНК интерференция (РНКи) является одним из наиболее изученных процессов сиквенс-специфического транскрипционного сайленсинга у дрозофилы на уровне хроматина. Белки группы поликомб PcG консервативны у всех эукариот и являются одним из главных компонентов транскрипционного сайленсинга гомеотических генов необходимых для правильного развития организма. PcG белки специфически связываются с PRE последовательностями ДНК которые могут располагаться как непосредственно в промоторе, так и за десятки т.п.н. от гена репрессию которого они обеспечивают [Negre et al., 2006]. У дрозофилы Fab-7 последовательность содержит граничный элемент и PRE последовательность, регулирующие экспрессию Abdominal-B расположенного в комплексе биторакс - локусе активность которого обнаруживается на разных стадиях развития. Инсерция Fab-7 перед репортерным геном является достаточным условием для сборки PcG комплекса и приводит к транскрипционному сайленсингу. Причем, при наличии двух копий трансгена происходит усиление сайленсинга. Этот феномен известен как PSS (pairing-sensitive silencing). PSS зависит от наличия- эндогенной копии Fab-7. С помощью метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) было показано, что трансгены Fab-7 физически сближены с эндогенным локусом, даже когда располагаются, на разных хромосомах [Bantignies et al., 2003]. Образование хромосомных пар зависит, по крайней мере, от одного белка группы поликомб, что предполагает важность высших порядков взаимодействия* внутри PcG комплекса для осуществления сайленсинга. Было показано, что обязательный компонент системы РНК интерференции - dicer-2 , являющийся одним из двух генов семейства Dicer у дрозофилы, наряду с такими генами семейства Argonaute какрім>і, argonautel и aubergine, совершенно необходим для-работы PSS и дистантных хромосомных взаимодействий PRE элемента в составе Fab-7. Более того, мутации в spindle-E не влияют на PSS или спаривание хромосоми-запуск механизма РНК интерференции не приводит к существенному связыванию белков группы поликомб с PRE последовательностью Fab-7 фрагмента или другими PRE сайтами генома. Таким образом, зависимые от РНК интерференции механизмы сайленсинга и образования центромерного гетерохроматина существенно отличаются друг от друга. В настоящее время, вопрос о том, как именно компоненты системы РНК интерференции способствуют пространственному сближению PRE-содержащих локусов остается не вполне ясным [Grimaud et al 2006].

Очевидно, в большинстве случаев компоненты клетки, участвующие в РНК-интерферениции не нужны для заякоревания PcG белков на эндогенных PRE. Тем не менее, человеческий гомолог AG01, нацеливаемый на промотор выключаемого гена с помощью коротких интерферирующих РНК, может запускать транскрипционный сайленсинг генов, рекрутируя E(z)H2 белки, относящиеся к группе поликомб [Kim et al., 2006].

Описанные фенотипы, исследованные с помощью внесения нарушений в механизм РНК интерференции, отличаются от фенотипов, наблюдаемых в PcG мутантах. То есть компоненты системы РНК интерференции, по-видимому, могут действовать кооперативно с PcG белками при связывании с различными генами-мишенями.

2.4.9. Распространенность в геноме и биологическая роль PcG. белков

Недавние исследования показывают, что PcG белки широко распространены в. геномах дрозофилы, мыши и' человека. Хотя прямое сравнение между вышеуказанными организмами невозможно- из-за проведения исследований на разных типах, клеток и разных PcG белках, появилось множество убедительных данных о различиях и сходствах механизма эпигенетического сайленсинг у дрозофилы и позвоночных. На всех исследованных биологических объектах показана четкая взаимосвязь между связыванием PcG белков и распространением НЗК27теЗ меток, которые могут располагаться как в очень небольших областях, так и образовывать протяженные домены. Примером таких доменов могут служить Нох содержащие генетические кластеры, длина которых превышает сотни т.п.н. [Boyer et al., 2006; Bracken et al., 2006; Lee et al., 2006; Negre et al., 2006; Schwartz et al., 2006; Tolhuis et al., 2006]. Связывание PcG белков отрицательно коррелирует с присутствием РНК полимеразы II, то есть РНК полимераза II отсутствует в области генов подверженных сайленсингу. Основной мишенью PcG белков являются транскрипционные факторы, в том числе многие гены, кодирующие гомеодоменные белки. Причем, большинство генов-мишеней являются общими для дрозофилы и позвоночных. Отсюда можно сделать вывод, что основной функцией PcG белков является регуляция транскрипционной активности. Функциональные сайты связывания для PcG белков обнаруживаются в генах, отвечающих за морфогенез, органогенез и общий план строения организма. В некоторых из этих процессов роль PcG белков видна особенно ярко. Например, 55%- транскрипционных факторов вовлеченных в формирование сегментов тела у эмбрионов дрозофилы содержат консенсусные PRE последовательности.

Аналогичная картина наблюдается при исследовании генов вовлеченных в формирование глаз и конечностей дрозофилы [Schuettengruber et al., 2007]. То есть PcG белки в этих процессах, возможно, выполняют некую координирующую функцию. Так ли это на самом деле будет ясно только после исследования функциональности обнаруженных PRE последовательностей в клетках различных типов.

Не смотря на сходства в биохимии PcG комплексов и идентичности генов-мишеней у разных организмов, были обнаружены и существенные отличия. В частности, PRC2 человека и мыши связывается с ДНК в областях H3K27me3 [Bracken et al., 2006; Lee et al., 2006] в то время как у дрозофилы местами связывания PRC2 являются не обширные НЗК27шеЗ домены, присутствующие в геноме, а локальные области, предположительно PRE [Рарр and Muller, 2006; Schwartz et al., 2006]. To есть, механизм, с помощью которого H3K27me3 размещаются на хроматине может отличаться у мух и позвоночных. В 90% случаев у млекопитающих сайты связывания с PcG белками расположены близко к промотору проксимального гена [Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006], что намного выше, чем PRE, обнаруживаемые у дрозофилы [Negre et al., 2006]. То есть у дрозофилы PcG белки работают на большем расстоянии от промотора, чем у млекопитающих. Большинство PRE дрозофилы, способны связывать PcG белки на протяжении всего онтогенеза. У позвоночных наблюдается другая картина, способность к связьшанию PcG белков одним и тем же сайтом сильно варьирует в зависимости от стадии жизненного цикла [Negre et al., 2006]. Таким образом, у млекопитающих PcG белки часто вовлечены в, обратимое подавление транскрипции. Стабильный транскрипционный сайленсинг в этом случае может обеспечиваться другими механизмами, такими как ДНК метилирование. Эти данные согласуются с высоким уровнем экспрессии PcG белков и их важной ролью в поддержании идентичности стволовых клеток у млекопитающих.

Временная универсальность PcG белков (а возможно и trxG белков) в качестве эпигенетических регуляторов указывает на их огромную важность в изучении и понимании механизмов распределения активности генов в онтогенезе.

3. Дистантная регуляция экспрессии в селекторном локусе cut

Локус cut дрозофилы является интересным примером сложного генетического локуса эукариот, определяющего развитие многих тканей и органов. Он расположен в районе 7В1-8 в Х-хромосоме и имеет размеры более 200 т.п.н. Хотя локус cut является одним из наиболее изученных локусов дрозофилы, механизм регуляции экспрессии локуса до конца

ёУР^У.

«

burdock

рг-1 рг-2

ATG^V » ТАА

Ї657 3

SaulO

Рисунок 4 Положение LCR на генетической карте локуса (а). Инсерции элементов gypsy и burdock вызывают мутации в локусе. Ниже представлен EcoRI фрагмент длиной около 8.3 kb, в котором расположен локусконтролирующий район (LCR) (нумерация по последовательности AC U96440). Область LCR, связывающая ядерные белки, показана черным (фрагмент SaulO). Указанный фрагмент в экспериментах по торможению ДНК в геле активно связывается с ядерными белками

не выяснен. Отчасти это связано с крайне протяженной регуляторной частью локуса, содержащей большое количество разнообразных цис-регуляторных последовательностей. На рис 4 приведена генетическая карта локуса на которой показано расположение одного

из известных транскриптов [Blochlinger et al 1988] а также инсерции мобильных элементов gypsy и burdock [Tchurikov et al 1989]. Впервые локус был клонирован Чуриковым и др. в 1986 г. Повреждения локуса в разных областях могут приводить к многообразным фенотипическим проявлениям — перекрутам бедер (kf — kinked femur) вырезками на крыльях (ct - cut, отсюда происходит название локуса данное Морганом, Бриджесом и Стертевантом в 1925 г), а также к проявлению эмбриональных или личиночных деталей [Johnson et al 1979, Liu et al 1991, Jack et al 1991]. Обнаружено, что инсерции разных мобильных элементов могут быть причиной мутаций [Blochlinger et al 1988, Tchurikov et al 1989, Lim et al 1983]. Продуктом локуса является гомеодоменный белок, локализованный в ядрах и являющийся транскрипционным фактором. Этот белок регулирует работу ряда генов, отвечающих за дифференцировку клеток. Бьша показана важная роль локуса в развитии периферической и центральной нервной системы эмбрионов, в развитии механорецепторов на передней кромке крыльев и задних щетинок крыльев, антенно-максилярных чувствительных органов, мальпигиевых сосудов, а также мышц, яичников, капсулы головы, передних и задних дыхалец [Blochlinger et al 1988, Liu et al 1991, Jack et al 1991, Jack et al 1995, Blochlinger et al 1993].

До сих пор не понятны тонкие механизмы регуляции локуса, с помощью которых экспрессия регулируется с точностью до ткани, групп клеток и даже одной клетки. Из ранних генетических экспериментов следует, что большая часть локуса - область длиной более 120 т.п.н. вовлечена в эти механизмы [Чуриков и др. 1986, Johnson et al 1979]. В последние годы на основании изучения экспрессии локуса в разных с/-мутантах, имеющих инсерции gypsy, предложена гипотеза, согласно которой каждой ткани соответствует свой энхансер [Jack et al 1995]. Предполагается, что инсерции-элемента gypsy,имеющего инсулятор [Gerasimova et al 1996], изолируют от промотора вышерасположенные энхасеры. Отсюда, чем далее от промотора расположен gypsy в мутанте, тем меньшее число органов и тканей должны иметь нарушения в экспрессии локуса. И наоборот, чем ближе к промотору расположена вставка gypsy, тем большее количество энхансеров отсечено и тем большая часть органов и тканей развивается неправильно вследствие нарушения тканьспецифической экспрессии локуса в них. Эта точка зрения подтверждается также данными по экспрессии чужеродного репортерного гена lacZ под контролем фрагментов ДНК локуса длиной от 0.8 до 6.5 т.п.н. из двух районов регуляторной части локуса в трансформированных линиях дрозофилы [Jack et al 1991, Jack et al 1995]. Область ct" длиной около 2.7 т.п.н. содержит «крыльевой» энхансер, включающий репортерный ген в клетках, где в норме локус экспрессируется и где обнаруживается белок Cut [Jack et al 1991]. В другой области, длиной около 30 т.п.н., в

основном выявлены эмбриональные тканьспецифические энхансеры. Однако большой район локуса, расположенный между с/"-энхансером и эмбриональными энхансерами, имеющий длину около 40 т.п.н. и включающий в себя группу личиночных деталей, остается пока малоизученным. Особый интерес представляет дистальная часть этого района локуса в которой было описано большое количество инсерций gypsy, вызывающих мутации [Чуриков и др. 1986, Lim et al. 1983, Tchurikov et al 1989], что указывает на его важность в регуляции локуса. Действительно, в сДрайоне расположенном на расстоянии около 80 т.п.н. перед промотором cut, была обнаружена интересная энхансерная область. Она отличается по своим свойствам от соседней сАобласти и области эмбриональных энхансеров [Jack et al 1991, Jack et al 1995]. Некоторые свойства обнаруженной энхансернои области, в частности ее активность на всех стадиях развития и ее влияние на экспрессию локуса cut во многих тканях и органах делает ее похожей на так называемый локусконтролирующий район позвоночных (LCR). LCR как известно обеспечивают тканьспецифическую экспрессию расположенных на значительном расстоянии от них генов, содержат участки связывания регуляторных белков и имеют сайты гиперчувствительности к ДНКазе I[Engel 1993]. Недавние исследования показали, что один из участков предполагаемого LCR, названный SaulO, действительно способен связываться с богато представленным в ядре белком или группой белков [Чуриков и др. 1998]. Дальнейшее изучение удаленных от промотора цис-регуляторных областей локуса cut и в частности области обнаруженного LCR, должно прояснить роль высших уровней пространственной организации генома в регуляции генетической активности.

4. Заключение

Исследования последних лет позволили сделать значительный прогресс в понимании важной роли некодирующих последовательностей ДНК в регуляции транскрипционной активности генома. Помимо функций компартментализации [Grimaud et al., 2006], то есть разделения внутриядерного пространства на относительно независимые функциональные блоки, некодирующая ДНК принимает непосредственное участие в регуляции генетической активности внутри этих блоков.

Большинство элементов, участвующих в регуляции транскрипции удалены от своего гена-мишени на значительное расстояние [Bondarenko et al., 2003b]. Очевидно, такое пространственное разобщение позволяет, вовлекать в регуляцию транскрипции значительно большее число регуляторных элементов, чем при тандемном расположении в непосредственной близости от промотора. То есть, с одной стороны, последовательное взаимодействие различных регуляторных элементов (разобщение по времени действия) позволяет не перегружать область промотора множеством белковых факторов, а с другой, позволяет использовать функции некоторых регуляторных элементов более рационально. То есть, один и тот же регуляторный элемент может принимать участие во взаимодействиях с несколькими другими регуляторными элементами. Примером такого взаимодействия могут служить PTS, способные нацеливать сразу несколько энхансеров на один и тот же промотор [Lin et al., 2004].

Модель взаимодействия элементов дистантной регуляции с геном-мишенью через образование хроматиновых петель [Cleard et al., 2006; Dean, 2004], является наиболее обоснованной и распространенной на сегодняшний день. Тем не менее, четкие данные о существовании таких петлевых структур для большинства регуляторных элементов отсутствуют. Интерпретация данных, полученных с помощью современных методик исследования трехмерной структуры генома, таких как ЗС и СЫР связана с большим количеством ошибок и противоречий [Petruk et al., 2006; Рарр and Muller, 2006]. Хотя возможности для косвенного анализа механизмов взаимодействия различных регуляторных элементов далеко не исчерпаны, не вызывает сомнений необходимость создания новых эффективных подходов для обнаружения и анализа функций элементов генома, участвующих в дистантной регуляции.

Похожие диссертации на Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster

Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogasterКотельников Роман Николаевич

Изучение функций различных доменов нового транскрипционного коактиватора SAYP (E(y)3) Drosophila melanogaster и поиск взаимодействующих с ним белковНиколенко Юлия Владимировна

Изучение белка E(y)2P Drosophila melanogaster, являющегося паралогом фактора транскрипции E(y)2Марданов Павел Владимирович

Регуляция экспрессии гетерохроматических генов Stellate y Drosophila melanogasterАравин Алексей Алексеевич

Ретротранспозон МДГ4 и его роль в генетической нестабильности в мутаторной линии Drosophila melanogasterЛюбомирская Наталия Вениаминовна

Изучение транскрипционного фактора TRF2 у Drosophila melanogasterКопытова Дарья Владимировна

Новый TRITHORAX-ассоциированный регуляторный элемент в промоторной области гена fork head в Drosophila melanogasterРяховский Алексей Алексеевич

Характеристика биогенеза rasiPHK в герминальной ткани Drosophila melanogasterВагин Василий Владимирович

Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование "инсуляторных телец" в ядрах клеток Drosophila melanogasterВолков Илья Алексеевич

Цис- и транс-эффекты положения гена у Drosophila melanogaster: влияние хромосомных перестроек на репликацию и экспрессию геновАбрамов Юрий Александрович