Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 6
1.1. Актуальность проблемы. 6
1.2. Задачи исследования. 8
1.3. Научная новизна результатов исследования . 8
1.4. Практическая ценность 9
1.5. Апробация работы 9
2. Обзор литературы 11
Механизмы подавления экспрессии генов, опосредованного разными классами коротких рнк у животных.
2.1. Введение 11
2.2. Класс siPHK 11
2.2.1. Механизм продукции и функции siPHK 11
2.2.2. Биологическая роль siPHK 15
2.3. Класс miPHK 16
23Л. Механизм продукции и функции miPHK 16
2.3.2. Биологическая роль miPHK 20
2.4. Класс rasiPHK и piPHK 23
2.4.1. rasiPHK 23
2.4.2. rasiPHK и гибридный дисгенез 24
2.4.3. piPHK позвоночных 26
2.4.4. Биологическая роль piPHK 29
2.5. Белки, участвующие в продукции и функции коротких РНК 30
2.5.1. Белки Drosha 30
2.5.2. Белки Dicer 32
2.5.3. Белки, содержащие дцРНК-связывающие мотивы 35
2.5.4. Семейство Argonaute 36
3. Материалы и методы 42
3.1. Биологические материалы 42
3.2. Генетические скрещивания 43
3.3. Продукция терминальных клонов, гомозиготных по мутации в гене dicer-І, с помощью митотической рекомбинации 44
3.4. Гистохимическая окраска органов на активность галактозидазы 45
3.5. Выделение тотальной РНК Drosophila для Northern-блот гибридизации, микрочипа и количественного RT-PCR 46
3.6. Дизайн проб для исследования экспрессии коротких РНК и анализ результатов, полученных с помощью микрочипа 46
3.7. Northern-блот гибридизация коротких молекул РНК 47
3.8. Анализ химической структуры rasiPHK и miPHK 50
3.9. Количественный RT-PCR 51
3.10. Иммунопреципитация коротких молекул РНК, взаимодействующих с Agol, Aubergine и PIWI 52
3.11. Western-блот анализ 53
4. Результаты 55
4.1.Сравнение закономерностей процессинга rasiPHK и siPHK in vivo 55
4.2. Гены, необходимые для биогенеза rasiPHK 59
4.3. Продукция и функция rasiPHK не зависит от активности белка Dicer-1 64
4.4. Характеристика химической структуры rasiPHK 66
4.5. rasiPHK специфически взаимодействуют с PIWI подсемейством белков Argonautc 68
5. Обсуждение результатов 72
5.1. Преимущественное накопление антисмысловых rasiPHK 72
5.2. Роль белков Armitage, Spindle-E, PIWI, Aubergine в продукции и функции rasiPHK 73
5.3. Процессинг rasiPHK 75
5.4. Модификация 3' конца rasiPHK 80
5.5. Биогенез rasiPHK - третий независимый путь действия коротких РНК в терминальной ткани 82
5.6. Природная роль rasiPHK 84
5.7. Общность биогенеза rasiPHK и piPHK 88
6. Выводы 93
7. Литература
- Научная новизна результатов исследования
- Механизм продукции и функции siPHK
- Продукция терминальных клонов, гомозиготных по мутации в гене dicer-І, с помощью митотической рекомбинации
- Продукция и функция rasiPHK не зависит от активности белка Dicer-1
Введение к работе
Последние 8 лет активно изучаются биологические функции и механизм явления РНК-интерференции. В 2006 году открытие РНК-интерференции как бесценного инструмента функциональной геномики, позволяющего специфически выключать активность выбранных генов, было удостоено Нобелевской премии. РНК-интерференция заключается в способности двуцепочечной РНК (дцРНК) специфически подавлять активность генов, нуклеотидная последовательность которых идентична последовательности дцРНК (Jorgensen, 2006; Matzke and Matzke, 2006; Zamore, 2006). РНК-интерференция - эволюционно консервативное явление, обнаруженное у многоклеточных и некоторых одноклеточных эу-кариот. Активное начало РНК-интерференции - короткие РНК дуплексы размером 21-28 нт., образуемые в результате процессинга дцРНК предшественника, осуществляемого РНКаза-111 подобными белками семейства Dicer (Tomari and Zamore, 2005b). Одна из цепей дуплекса коротких РНК внедряется в состав эф-фекторного комплекса, содержащего белки семейства Argonaute. Этот комплекс приобретает способность найти и осуществить трансляционную супрессию или деградацию мРНК-мишени, комплементарной коротким РНК, что приводит к подавлению экспрессии гена на посттранскрипционном уровне в цитоплазме. В ряде случаев короткие РНК могут подавлять транскрипцию гомологичных генов в ядре, за счет изменения структуры хроматина, содержащего ДНК с комплементарной им последовательностью (Verdel and Moazed, 2005). Механизм подавления активности генов, опосредованный короткими РНК, подвергся детальному исследованию у ряда организмов, в том числе и у дрозофилы.
У Drosophila melanogaster было обнаружено три класса коротких РНК, участвующих в подавление экспрессии генов: 21-23 нк. siPHK(small interfering RNA) (Elbashir et al., 2001), miPHK (micro RNA) (Lagos-Quintana et al., 2001) размером 21-23 нк. и rasiPHK длиной 24-29 нк. (repeat-associated small interfering RNA) (Aravin et al., 2003). Природная роль siPHK заключается в защите клетки от вызванной РНК-вирусами инфекции, в ходе которой часто образуются длинная дцРНК вируса, являющаяся предшественником siPHK (Galiana-Arnoux et al., 2006; van Rij et al., 2006; Wang et al., 2006). miPHK закодированы в геноме многоклеточных организмов в виде шпилечного предшественника (pre-miPHK), включающего 75 нк., и регулируют активность клеточных генов (Bartel, 2004). Предшественником rasiPHK являются смысловые и антисмысловые транскрипты мобильных элементов и гетерохроматиновых повторов генома, которые потенциально могут образовывать дцРНК (Aravin et al., 2003). Показано, что rasiPHK подавляют экспрессию идентичных им по нуклеотидной последовательности мобильных элементов, поддерживая тем самым стабильность генома (Aravin et al., 2004; Aravin et al., 2001; Sarot et al., 2004; Savitsky et al., 2006).
Механизм образования и посттранскрипционного действия siPHK и miPHK хорошо изучен на молекулярном уровне у дрозофилы. Биогенез siPHK и miPHK удивительно похожи и контролируются паралогичными генами: dicer-2, r2d2 (кодирует дцРНК связывающий белок) и ago2, кодирующий белок семейства Argonaute, нужны для продукции и функции siPHK, тогда как dicer-1, loqs (кодирует дцРНК связывающий белок) и agol, кодирующий другой белок семейства Argonaute, участвуют в продукции и функции miPHK (Forstemann et al., 2005; Lee et al., 2004b; Okamura et al., 2004; Pham et al., 2004; Saito et al., 2005; Tomari and Zamore, 2005b). siPHK как и miPHK в составе комплекса с белками Argonaute способны вызывать посттранскрипционное эндонуклеазное разрезание мРНК-мишени, если обнаружит участок нуклеотидной последовательности, полностью комплементарный коротким РНК. Неполная комплементарность коротких РНК и участка мРНК-мишени приводит к трансляционному подавлению экспрессии гена или к экзонуклеазной деградации (более подробное описание биогенеза siPHK и miPHK см. раздел 2.2. и 2.3.)
Научная новизна результатов исследования
Данный литературный обзор будет посвящен механизмам РНК-интерференции и родственных явлений, активным началом которых являются короткие РНК. За последние десятилетие было открыто несколько консервативных путей подавления экспрессии генов, опосредованного короткими РНК (Tomari and Zamore, 2005b). Все они обладали общими свойствами: - короткие РНК вырезаются из дцРНК предшественника белком Dicer - имеют размер 21 -3 0 нк. - входят в состав эффекторного комплекса, содержащего белки семейства Argonaute, осуществляющего специфическое подавление экспрессии гена.
Было показано, что короткие РНК могут вызывать как посттранскрипциионное, так и транскрипционное подавление генов (Bartel, 2004). Настоящий обзор литературы будет посвящен механизмам образования и действия разных классов коротких РНК у животных: siPHK, miPHK и piPHK/rasiPHK, а также их биологическим функциям. Будет проведено сопоставление механизмов продукции и действия разных классов коротких РНК. Наконец, мы опишим семейства консервативных белков, необходимых для образования и функционирования коротких РНК.
Наибольший прогресс в изучение биогенеза siPHK был достигнут при изучении эмбриональных экстрактов Drosophila. Механизм образования и действия siPHK подразделяется на два этапа: процессинг коротких РНК и включение их в эффекторный комплекс, который вызывает нарезание комплементарной мРНК (Bartel, 2004; Tomari and Zamore, 2005b). На первом этапе клеточная эндорибо нуклеаза третьего типа Dicer-2 связывается с концом длинной дцРНК и нарезает ее на siPHK дуплексы длиной 21-23 нк. (Carmell and Harmon, 2004; Lee et al., 2004b; Liu et al, 2003; Pham et al., 2004; Zamore et al., 2000) (рис. 2). Для процес-синга дцРНК необходим гидролиз АТФ, истощение АТФ в экстрактах приводит к подавлению процессирующей активности (Zamore et al., 2000). Рекомбинант-ный Dicer-2 in vitro нарезает дцРНК без каких либо дополнительных белковых кофакторов (Liu et al., 2003). Однако, в клеточных экстрактах Dicer-2 обнаружен в составе 230 кДа. комплекса, активнопроцессирующего дцРНК (Forstemann et al., 2005; Liu et al., 2003). Учитывая, что размер Dicer-2 150 кДа., можно предположить, что в клетке для процессинга дцРНК помимо Dicer-2 нужны дополнительные белки. Интересно, что энзиматическая активность человеческого Dicer возрастает при частичном протеазном гидролизе (Zhang et al., 2002). Возможно, активность Dicer регулируется шаперонными белками в клетке.
siPHK дуплекс является типичным продуктом эндорибонуклеаз третьего типа: имеет два выступающих нуклеотида на 3 концах дуплекса, каждая цепь дуплекса содержит монофосфатную группу на 5 конце и две свободные гидро-ксильные группы на 3 конце (Amarasinghe et al., 2001; Bass, 2000; Elbashir et al., 2001). Характерные черты дуплекса siPHK важны для функционирования siPHK, siPHK дуплексы без монофосфатной группы или двух неспаренных нуклеотидов не способны вызывать специфического подавления экспрессии генов (Elbashir et al., 2002; Elbashir et al, 2001).
После процессинга siPHK дуплекс узнается дцРНК связывающим белком R2D2 (Liu et al., 2003; Liu et al., 2006). Только дуплексы коротких РНК, несущих монофосфат на 5 конце и не имеющих неспаренных нуклеотидов по середине, стабильно связываются с R2D2 (Liu et al., 2006; Pham et al., 2004; Pham and Sontheimer, 2005; Tomari et al., 2004a) (Tomari Y., личное сообщение). «Двойной» комплекс (R2D2 и siPHK дуплекс) приобретает способность связываться со свободным Dicer-2 (Liu et al., 2006) (Tomari Y., личное сообщение). Образовавшийся «тройственный» комплекс (Dicer-2, R2D2, дуплекс siPHK) получил название RLC (RISC Loading Complex) (Tomari et al., 2004a; Tomari et al, 2004b). Положение дуплекса коротких РНК в RLC определяет какая из цепей дуплекса siPHK будет попадать в эффекторный комплекс RISC (RNA interfering silencing Complex). Цепь короткой РНК, формирующая менее стабильную дцРНК структуру на 5 конце,
преимущественно загружается в RISC и называется «guide», цепь которая не попадает в RISC - «passenger», быстро деградирует (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Оказалось, что R2D2 выполняет роль молекулярного сенсора «ассиметричной» загрузки цепей в RISC: R2D2 связывается с наиболее стабильным концом дуплекса коротких РНК, определяя какая из цепей будет «guide» и «passenger» (Tomari et al., 2004b). Если оба конца siPHK образуют одинаково стабильную дцРНК структуру, то обе цепи с равной вероятностью загружаются в RISC (Schwarz et al., 2003).
Предполагают, что основной компонент RISC, белок семейства Argonaute -Ago2 (Carmell et al., 2002; Hammond et al., 2001; Liu et al., 2004; Martinez and Tuschl, 2004; Okamura et al., 2004) связывается с «ассиметрично» ориентированным в RLC дуплексом siPHK. Ago2 разрезает «passenger» цепь дуплекса напротив 10-11 нуклеотида «guide» цепи (Matranga et al., 2005; Miyoshi et al., 2005). Неизвестная АТФ-зависимая хеликаза участвует в диссоциации разрезанной «passenger» цепи (Nykanen et al., 2001) (Matranga С, личное сообщение). «Созревший» RISC (siPHK RISC) содержит Ago2, связанный с одноцепочечной «guide» siPHK, которая помогает ему специфически найти и вызвать эндонуклеазное расщепление мРНК между 10 и 11 нуклеотидом дуплекса с siPHK и мРНК (Elbashir et al., 2002; Elbashir et al., 2001; Liu et al., 2004; Martinez and Tuschl, 2004; Schwarz et al., 2004; Song et al., 2004). Образовавшийся продукт нарезания содержит две свободные гидроксильные группы на 3 конце и монофосфат на 5 конце (Martinez and Tuschl, 2004; Schwarz et al., 2004). Диссоциация siPHK RISC и мишени - АТФ зависимый процесс, в результате чего образуется свободный siPHK RISC (Nykanen et al., 2001), 5 и 3 продукты нарезания мРНК, которые быстро деградируют. Распад продуктов нарезания RISC - активный процесс: 5 продукт подвергается экзонуклеазной деградации с помощью экзосомного комплекса, содержащего белки, Ski2p, Ski3p и Ski8p, тогда как 3 конец подвергается расщеплению с помощью 5 -3 экзонуклеазы XRN1 (Orban and Izaurralde, 2005).
siPHK RISC способен осуществлять около 10 циклов нарезания и диссоциации с мРНК (multiple turnover) (Hutvagner and Zamore, 2002) (рис. 7в). Одиночные неспаренные нуклеотиды siPHK в положение с 15 до 23 нк. с мРНК оказывают незначительное влияние на функцию siPHK. Неспаренные нуклеотиды siPHK в положение 2-Ю нк., в последствии получившие название «seed» сиквенса (Lewis et al., 2005), нарушают функцию коротких РНК. siPHK, имеющая неспаренные нуклеотиды в положение 10-11 нк. (напротив которых происходит разрезание мРНК) не способна вызывать какое-либо нарезание мРНК-мишени (Haley and Zamore, 2004).
Механизм продукции и функции siPHK
Биогенез miPHK у дрозофилы удивительно напоминает механизм образования siPHK, более того у млекопитающих одни и те же белки вовлечены в биогенез siPHK и miPHK. Предшественники miPHK закодированы (pri-miPHK -primary miPHK) в геноме и траскрибируются РНК полимеразой-11 (Cai et al., 2004; Lee et al., 2004a) часто в виде полицистронных предшественников, содержащих последовательности нескольких miPHK (Aravin et al., 2003; Lau et al., 2001). pri-miPHK могут транскрибироваться в составе интронов, кодирующих белки генов, но большинство локализовано в межгенных спейсорах и транскрибируются с собственных промотеров (Bartel, 2004). pri-miPHK складываются в шпилечную вторичную структуру, их длина варьирует от ста до нескольких тысяч нуклеотидов (Aravin et al., 2003; Cai et al., 2004). В ядре pri-miPHK процес-сируются гетеродимерным комплексом Drosha/Pasha с образованием 70 нк. «шпильки» pre-miPHK (precursor miPHK) (рис. 2) (Denli et al., 2004; Han et al., 2004; Landthaler et al., 2004; Lee et al., 2003; Lee et al, 2002). Drosha -белок, принадлежащий семейству РНКаз третьего типа; Pasha/DGCR8 - белок, содержащий дцРНК связывающие домены. Pasha/DGCR8 специфически взаимодействует с одноцепочечными участками pri-miPHK в основании шпильки pri-miPHK, определяя ориентацию pri-miPHK относительно Drosha, что необходимо для правильного процессинга pre-miPHK (Han et al., 2006). Рекомбинантный Drosha в отсутствие Pasha/DGCR8 обладает неспецифической рибонуклеазной активностью и не способен узнавать и осуществлять процессинг pri-miPHK (Gregory et al., 2004). В клеточных экстрактах Drosha и Pasha/DCGR8 обнаружены в составе 500-650 кДа. комплекса (Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004), способного процессировать pri-miPHK, что предполагает наличие дополнительных белков участвующих в созревание pre-miPHK. Действительно, недавно в составе комплекса были выявлены две РНК-хеликазы семейства DEAD-box, од 17 на из которых оказалась гомологом RM62 (Fukuda et al., 2007), обнаруженого ранее также в составе siPHK RISC (Ishizuka et al., 2002).
Как типичный продукт активности семейства РНКаз третьего типа рге-miPHK имеет два выступающих нуклеотида на 3 конце, а также несет монофосфатную группу на 5 конце и две свободные гидроксильные группы на 3 конце (Lee et al., 2003). pre-miPHK содержит последовательность зрелой miPHK либо в 5 , либо в 3 половине шпильки. Таким образом, Drosha образует 5 или 3 конец будущей miPHK (Lee et al., 2003).
Exportin5 (дцРНК связывающий белок) участвует в транспорте pre-miPHK в цитоплазму, специфически узнавая два выступающих нуклеотида на 3 конце (Bohnsack et al., 2004; Yi et al., 2003; Zeng and Cullen, 2004) (рис. 2). Процессинг зрелой miPHK осуществляется белком Dicer в цитоплазме (Grishok et al., 2001; Hutvagner et al, 2001). Дрозофила имеет два специализированных Dicer: Dicer-2 участвует в процессинге siPHK, Dicer-1 - miPHK (Lee et al., 2004b). Точное специфическое нарезание pre-miPHK происходит на расстоянии 21-23 нуклеотидов от 5 конца, с помощью гетеродимерного комплекса Dicer-1 /Loqs (Forstemann et al., 2005; Jiang et al., 2005; Saito et al., 2005). В отсутствии Loqs белок Dicer-1 не способен процессировать miPHK и приобретает новую активность нарезать длинную дцРНК на siPHK (Saito et al., 2005). Loqs содержит несколько дцРНК связывающихся доменов и является ортологом R2D2. Гетеродимерный комплекс Dicer-1 /Loqs остается связанным с дуплексом miPHK, некоторое время после процессинга pre-miPHK (рис. 2). Одна из цепей образовавшегося дуплекса miPHK («guide») загружается в miPHK RISC, активным компонентом которого является белок Agol, принадлежащий семейству Argonaute (Okamura et al., 2004), другая цепь, «passenger» деградирует (рис. 2). Как и в случае дуплексов siPHK, «guide» цепь miPHK образует менее стабильную вторичную структуру на 5 конце, чем «passenger» цепь miPHK (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003), однако механизм селекции цепи и загрузки в miPHK RISC. Комплекс Dicer-1/Loqs не участвует в ассиметричной загрузке miPHK (Du Т., личное сообщение). Диссоциация «guide» от «passenger» цепи miPHK может происходить по типу siPHK дуплексов - разрезания «passenger» цепи по середине дуплекса (Matranga et al., 2005). Однако, большинство дуплексов miPHK имеют неспа-ренные нуклеотиды в районе разрезания «passenger» цепи, поэтому для них предполагают другой, отличный от siPHK, механизм загрузки «guide» цепи miPHKBmiPHKRISC.
Если miPHK комплементарна мРНК-мишени напротив 10-11 нк. miPHK, то miPHK RISC производит разрезание мРНК по середине дуплекса (Hutvagner and Zamore, 2002; Okamura et al., 2004; Yekta et al., 2004). В отличие от siPHK RISC miPHK RISC не способен диссоциировать от мРНК-мишени после нарезания, и как следствие этого осуществлять «multiple turnover» (Wee L. M., личное сообщение). Таким образом, подавление экспрессии генов за счет нарезания мРНК, вызванного miPHK, неэффективный процесс. Наиболее сильное подавление экспрессии генов, вызванное miPHK, происходит на трансляционном уровне (Olsen and Ambros, 1999). Большинство miPHK частично комплементарны 3 НТР мРНК, обычно они имеют несколько неспаренных нуклеотидов с мРНК, в том числе в районе 10-11 нк., спаривание с которым необходимо для нарезания мРНК (Haley and Zamore, 2004). Образование дуплекса в районе 2-7 нк. «seed» последовательности miPHK необходимо для функции miPHK (Lewis et al., 2005). Несколько участков комплементарности с miPHK внутри 3 НТР мРНК приводит к более эффективному подавлению трансляции. Предполагают, что miPHK RISC работают кооперативно (Bartel, 2004; Doench et al., 2003; Pillai et al., 2005).
Продукция терминальных клонов, гомозиготных по мутации в гене dicer-І, с помощью митотической рекомбинации
Наличие двунаправленной транскрипции Su(Ste) подразумевало образование длинной дцРНК, которая может процессироваться с образованием rasiPHK по типу siPHK белком Dicer-2 (Lee et al., 2004b; Meister and Tuschl, 2004), в то же время, размеры rasiPHK Su(Ste) (24-27 нк.) превышали размеры канонических коротких РНК, что указывало на возможные особенности в процессинге rasiPHK (Aravin et al., 2004). Возможность участия Dicer-2 в процессинге rasiPHK следовало проверить.
Чтобы выявить участие Dicer-2 в процессинге дцРНК Su(Ste), сравнивали характер процессинга канонических siPHK из длинной шпилечной дцРНК с процессингом rasiPHK Su(Ste). Была использована известная трансгенная конструкция для подавления экспрессии гена white, с помощью длинной дцРНК, образующейся в ходе экспрессии трансгена, содержащего инвертированный повтор третьего экзона white (Lee and Carthew, 2003). Dicer-2 процессирует дцРНК шпильку с образованием white siPHK, которые вызывают деградацию white мРНК, что приводит к белой окраске глаза. На фоне мутаций по одному из генов, необходимого для продукции и функции siPHK (dicer-2, r2d2, ago!) глаза, как известно, сохраняют красную окраску (рис. 9а) (Forstemarm et al., 2005; Lee et al., 2004b).
Накопление смысловых и антисмысловых siPHK white с шагом в 22 нк.. а. Схема трансгенной шпилечной конструкции, использованной для изучения биогенеза siPHK in vivo. Показаны старт транскрипции, инвертированный повтор и интрон гена while. Показана дерепрессия гена white в глазах мух, несущих мутацию в гене dicer-2 в гомозиготе (dcr-2/dcr-2), тогда как у гетерозигот dicer-2 экспрессия white подавлена [dcr-2/CyO).
Пробы с однонуклеотидным «шагом», использованные для приготовления «микрочипа», для смысловой и антисмысловой цепи и Ме-шпильки изображены ввиде отрезков 22нк., формирующих наклонные линии сверху и снизу от w/z/fe-шпильки. Красным прямоугольником обозначена антисмысловая цепь, а синим прямоугольником - смысловая цепь. в. Распределение сигналов гибридизации по длине последовательности w/г/їе-шпильки. Ось х - положение проб, ось у - относительная интенсивность сигналов. Красной линией обозначены сигналы для антисмысловой цепи, синей линией - для смысловой. Показано накопление обеих цепей siPHK white. г. Преобразование Фурье (Bracewell 1986) для суммы смысловых и антисмысловых while siPHK сигналов, полученных при анализе микрочипа. Показано преимущественное накопление siPHK с «фазой», кратной 22 нуклеотидам. д. Распределение сигналов гибридизации siPHK по длине последовательности white-шпильки на фоне мутации в гене dicer-2.
С помощь «микрочипа», содержащего, пробы длиной 22 нк ко всем потенциально возможным siPHK, соответствующим смысловой и антисмысловой цепи дцРНК white (рис. 96), было выявлено образование обеих цепей siPHK (рис. 9в), тогда как мутация в гене dicer-2 приводила к исчезновению сигналов гибридизации (рис. 9д). Отдельные сигналы на фоне мутации в гене dicer-2 не были выявлены Northern-анализом и по всей видимости объясняются неспецифической гибридизацией отдельных проб (данные не представлены). Математический анализ распределения интенсивности сигналов позволил выявить пики гибридизации, отражающие процессинг дцРНК с одного конца с «шагом» в 22 нуклеотида, что соответствует результатам исследований процессинга с помощью Dicer-2 in vitro (Zamore et al., 2000; Zhang et al., 2004a).
Для выявления все возможных rasiPHK Su(Ste) использовали микрочипы, содержащие последовательности одной из копий повторов Su(Ste). Обнаружили накопление только антисмысловых, но не смысловых Su(Sie) rasiPHK в семенниках (рис. 10а). 1(їй смысловые rasiPHK
Преимущественное накопление антисмысловых rasiPHK без. «шага» в 22 нк.,образуемого Dicer-2. а. Распределение сигналов гибридизации по длине повтора Su(Ste). Представлены старты смысловой (синия стрелка) и антисмысловой транскрипции (красная стрелка). Показано преимущественное накопление только антисмысловых rasiPHK Su(Ste). б и г. Преобразование Фурье для суммы смысловых и антисмысловых сигналов rasiPHK Su(Ste) и гоо, полученных при анализе микрочипа. Показано отсутствие «фазы» при накоплении rasiPHK SufSteJ и гоо. в. Распределение сигналов гибридизации по длине повтора ретротранспозона то. # 1, 3,4, 5, 6, 7 - пики rasiPHK, подтвежденные Northern-анализом как индивидуальные rasiPHK, - неспецифический сигнал поли-А богатой последовательности. Показано преимущественное накопление только антисмысловых rasiPHK гоо. rasiPHK накапливались неслучайным образом, для некоторых учасков последовательности Su(Ste) обнаруживали пики гибридизации, однако не было выявлено накопления антисмысловых rasiPHK с «шагом» 22 или 24-29 нк. (рис. 106). С помощью программы M-Fold не было обнаружено шпилечных структур, которые мог образовывать антисмысловой транскрипт Su(Ste) (данные не представлены). Характеристика с помощью «микрочипа» rasiPHK, происходящих из транскриптов LTR-содержащего ретротранспозона гоо, экспрессирующегося в яичниках, дала сходные результаты (рис. 10в,г). Следовательно, преимущественное накопление антисмысловых rasiPHK при отсутствии 22 нк. «шага», образуемого Dicer-2, характерно для биогенеза rasiPHK как в семенниках, так и в яичниках. По всей видимости, Dicer-2 не участвует в продукции rasiPHK (см. раздел 4.2 и 4.3). 4.2. Гены, необходимые для биогенеза rasiPHK
Ранее было показано, что мутации в генах spindle-E(spn-E), armitage{armi) и auber-gine(aub) приводили к дерепрессии тандемных повторов Stellate в семенниках (Aravin et al., 2001; Schmidt et al., 1999; Stapleton et al., 2001; Tomari et al., 2004a) и рет-ротранспозонов НеТ-А и I-element в яичниках (Vagin et al., 2004). Так же было обнаружено, что ген piwi необходим для подавления экспрессии мобильных элементов в яичниках и семенниках (Kalmykova et al., 2005; Sarot et al., 2004). Гены aubergine{aub) и piwi кодируют PIWI подсемейство белков Argonaute. Гены spindle-E(spn-E) и armitage(armi), кодируют семейство DEAD-box РНК-хеликаз.
На примере тандемных повторов Su(Ste) и ретротранспозона гоо методом Northern-анализа исследовали образование rasiPHK в семенниках и яичниках на фоне мутаций в генах, необходимых: 1) для биогенеза и функции siPHK: dicer-2, r2d2, ago2 (Lee et al, 2004b; Liu et al., 2003; Okamura et al., 2004) 2) для образования и функции miPHK: loqs (Forstemann et al., 2005; Jiang et al., 2005) 3) для функции rasiPHK: spindle-E, armitage, aubergine, piwi (Sarot et al., 2004; Schmidt et al, 1999; Stapleton et al., 2001; Tomari et al., 2004a) Мутации в генах, кодирующих РНК-хеликазы (spindle-E и armitage), а также PIWI подсемейство белков Argonaute (piwi и aubergine) приводят к полному ичезиовению rasiPHK Su(Ste) (рис. Па), соответствующей основному пику rasiPHK Su(Ste), обнаруженому с помощью микрочипа, и к значительному снижению экспрессии гоо rasiPHK, соответствующей пику #1 гоо rasiPHK (рис. 116), но не miPHK (рис. 11а,б). Исчезновение всех rasiPHK Su(Ste) и гоо на фоне мутаций вышеперечисленных мутаций было подтверждено независимыми методами: анализом микрочипа и Northern-блот анализом с рибопробой, детектирующей все короткие РНК Su(Ste) (рис 12 а,б и данные не представлены). Мутации в генах, необходимых для биогенеза siPHK (dicer-2, r2d2, ago2) или miPHK (loqs), не влияют на накопление rasiPHK (рис. 11а,б).
Продукция и функция rasiPHK не зависит от активности белка Dicer-1
Мутации в генах spindle-E, armitage, aubergine приводят к нарушению локализации мРНК oskar и gurken в развивающемся ооците (Cook et al., 2004), тогда как мутации в генах, необходимых для биогенеза miPHK и siPHK, не влияют на локализацию материнских транскриптов (W. Theurkauf, личное сообщение). Мутации в генах пути rasiPHK сопровождаются с накоплением в ядрах питающих кдеток гистона y-H2Av (Klattenhoff et al., 2007), ассоцированноці с местами двуцепочечных разрывов ДНК (Rogakou et al., 1999). Предполагается, что двуцепочечные разрывы ДНК - результат активных перемещений мобильных элементов (Klattenhoff et al., 2007). Мутации в генах, кодирующих киназы air и chk-2, отвечающих за активацию машины репарации при появлении двуцепочечных разрывов ДНК, способны восстанавливать локализацию транскриптов oskar и gurken в случае нарушения функций spindle-Е, armitage и aubergine (Chen et al., 2007; Klattenhoff et al., 2007). Несмотря на номальную локализацию материнских транскриптов, при нарушении системы репарации количество мРНК мобильных элементов и гистона y-H2Av (Chen et al., 2007; Klattenhoff et al., 2007). Klattenhoff и сотрудники предложели модель, объясняющую участие белков, необходимых для биогенеза rasiPHK, в локализации материнских транскриптов (рис. 21). В случае нарушения биогенеза rasiPHK происходит активация перемещений мобильных элементов, что приводит к двуцепочечным разрывам ДНК, активирующим аппарат репарации ДНК в клетки, в том числе функционирования ATR киназы.
Представлена модель, как блокирование ответа на репарацию ДНК (каскад киназ) восстанавливает локализацию материнских транскриптов oskar и gurken (gkr) при нарушении пути образования rasiPHK из статьи (Klattenhoff et al., 2007). поляризация vasa микротрубочек локализация . трансляция дгк транскриптов J, чу oskar и дгк закладка дорзо-вентральной оси эмбриона
Последующий киназный каскад активации Chk2 киназы приводит к деполяризации микротрубочек (Krishnan et al., 2004), необходимых для правильной локализации мРНК oskar и gurken, а также к инактивации белка VASA, контролирующего правильное место трансляции белка gurken (Tomancak et al., 1998). В случае отсутсвия ATR, даже при наличии двуцепочечных разрывов, киназныи каскад не активируется, что приводит к восстаиавлению локализации транскрипов на фоне мутации в генах, участующих биогенезе rasiPHK. Таким образом, нарушение пути rasiPHK оказывает непрямой эффект на оогенез дрозофилы.
Несмотря на привлекательность модели, она не позволяет объяснить, почему на фоне мутаций в гене atr при видимом восстановление локализации материнских транскриптов мухи, имеющие нарушения в биогенезе rasiPHK, остаются стерильными. По всей видимости, эффект, вызванный нарушением биогенеза rasiPHK более комплексный и не может объясняться простой активацией перемещений транспозонов. Мутации в генах spindle-E, armitage и aubergine приводят к увеличению экспрессии теломерных ретроэлементов НеТ-А и TART (Savitsky et al., 2006; Vagin et al., 2004; Vagin et al., 2006), необходимых для поддержания длины теломер (Levis et al., 1993; Sheen and Levis, 1994). На фоне перечисленных мутаций происходит увеличение частоты присоеденения НеТ-А к теломерам (Savitsky et al., 2006), что может вызывать нарушения в расхождении хромосом и нормальном протекании оогенеза. Интересно отметить, что на фоне мутаций, нарушающих биогенез rasiPHK, у-II2Av колокализуется с теломерными повторами в ядре (W. Theurkauf, личное сообщение). Накопление y-H2Av в ядрах можно объяснить тем, что на фоне мутаций в генах spindle-E, armitage и aubergine может происходить нарушение локальной структуры хроматина теломер и диссоциация НР1 и НОАР, контролирующих длину теломер (Cenci et al., 2003; Oikeraus et al., 2004; Oikemus et al., 2006; Perrini et al., 2004; Savitsky et al., 2002). «Голые» концы теломер распознаются y-H2Av как двуцепочечные разрывы ДНК, это приводит к индукции каскада киназ и деполяризации микротрубочек в ооците.
Мутации в гене piwi влияют на поддержание программы стволовых клеток (Сох et al., 1998; Сох et al., 2000; Lin and Spradling, 1997). Однако остается неисследованным участвует ли биогенез rasiPHK прямо в функционировании стволовых клеток. Оказалось, что мухи, несущих одновременно мутации в генах spindle-E и armitage, страдают нарушениями в поддержании программы стволовых клеток, как и в случае мутации rempiwi (данные не представлены). Особая функция белков, вовлеченных в биогенез rasiPHK, состоит в их участие в организации макромолекулярного РНК белкового комплекса «nuage» (от французского - облачко), характерного компонента развивающейся терминальной ткани у многоклеточных организмов (Knaut et al., 2000; Russell and Frank, 1978; Snee and Macdonald, 2004). «Nuage» - электронно-плотное, обогащенное РНК образование вокруг ядра питающих клеток ооцита. Белки Aubergine и Ago3 находятся непосредственно в «nuage» (Brennecke et al., 2007), на более поздних стадиях развития ооцита компоненты «nuage», в том числе и Aubergine, транспортируютя из питающих клеток в ооцит и локализуются в терминальной плазме ооцита (Harris and Macdonald, 2001). Мутации в генах armitage, spindle-E и aubergine приводят к нарушению структуры «nuage» (Findley et al., 2003; Lim and Kai, 2007). Предполагается, что «nuage» участвует в подавление повторяющихся элементов генома. Накапливаются все больше экспериментальных данных, подтверждающих это. Мутации в генах maelstrom, spindle-E, aubergine, krimp и vasa, нарушающие организацию «nuage» (Findley et al., 2003; Lim and Kai, 2007), приводят к снижению количесва rasiPHK и увеличению экспрессии мобильных элементов (Lim and Kai, 2007). Мутации в генах dicer-І и dicer-2 не влияют на формирования «nuage» (Lim and Kai, 2007) и на экспрессию мобильных элементов (Vagin et al., 2006). Учитывая, что Aubergine и Ago3 локализуются в «nuage» (Brennecke et al., 2007), можно предположить, что именно там происходит деградация мРНК мобильных элементов и цикл амплификации «вторичных rasiPHK» (см. раздел 5.5.). Последующие эксперименты покажут, нарушается ли продукция rasiPHK по модели «пинг-понг» на фоне мутаций, дестабилизирующих формирование «nuage». Остается выяснить взаимосвязь между биогенезом rasiPHK и формированием терминальной ткани.
