Содержание к диссертации
Введение
II.Обзор литературы 7
II. 1 GFP-подобные белки 7
II.1.1 Зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria (GFP) 8
II. 1.2 GFP-подобные белки коралловых полипов Anthozoa 10
Структура GFP-подобных белков 12
Структура хромофора DsRed 13
Влияние конформации хромофора на флуоресцентные свойства 15
Функции GFP-подобных белков небиолюминесцентных кораллов 17
Распространение GFP-подобных белков 19
Эволюция семейства GFP/G2FP. 20
Структурные особенности GFP-подобных хромобелков 22
II. 1.3 Методы использования GFP-подобных хромобелков 24
Фотоактивируемые хромобелки 24
Хромобелки как акцепторы для резонансного переноса энергии 27
Использование мутантных вариантов хромобелков в двухцветовой
флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии 29
Использование хромобелков для создания псевдо-мономерных меток 32
Флуоресцентные белки с эмиссией в дальне-красной области спектра 33
II.2 Фотосенсибилизаторы и их использование 37
Флуоресцентные белки в качестве генетически-кодируемых
фотосенсибилизаторов 42
Фотодинамическая терапия (ФДТ) 42
III. Экспериментальная часть 48
IV. Результаты и обсуждение 62
Создание флуоресцентного белка с эмиссией в дальне-красной области спектра на основе хромобелка из Actinia equina 62
Получение фототоксичного белка на основе хромобелка медузы 80
Заключение 97
Выводы 101
Список литературы 102
- Зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria (GFP)
- Фотоактивируемые хромобелки
- Использование хромобелков для создания псевдо-мономерных меток
- Создание флуоресцентного белка с эмиссией в дальне-красной области спектра на основе хромобелка из Actinia equina
Введение к работе
Прогресс молекулярной биологии тесно связан с развитием её методологии. Доскональное изучение молекулярных основ процессов, происходящих в живой клетке: репликации, синтеза белка, функционирования органелл, взаимодействия клеток, — требует разработки и внедрения новых подходов в исследованиях. Важнейшие сведения для молекулярной биологии позволяют получить различные методики визуализации. Особый интерес при этом представляет возможность наблюдения за живыми клетками, изучение происходящих в них процессов в динамике. Востребованность данных, получаемых при наблюдении живых объектов, подтверждается бурным развитием техник микроскопии и мечения объектов.
В 1992 г. зеленый флуоресцентный белок (GFP) медузы Aequorea victoria был впервые использован как флуоресцентная метка для микроскопии. Флуоресцентный сигнал GFP, находящегося в составе химеры с целевым белком, позволил отследить включение синтеза целевого белка и его накопление. Уникальные свойства GFP: способность самостоятельно образовывать хромофор, возможность экспрессии в гетерологичных системах, низкая токсичность для клеток, — способствовали быстрому внедрению GFP в качестве гепетически-кодируемой флуоресцентной метки. В течение всего последующего времени велись как активный поиск и создание новых гомологичных GFP белков с различными свойствами, так и разработка новых методов с использованием GFP-подобных белков. Были получены белки с флуоресценцией в различных областях видимого спектра, что позволило, с одной стороны, использовать одновременно несколько меток, с другой, применять GFP-подобные белки для наблюдения за взаимодействием целевых молекул и копформационных изменений белков.
Помимо флуоресцентных белков в семейство GFP-подобных белков
входят также нефлуоресцентные белки - хромобелки. Хромобелки имеют высокую степень гомологии с флуоресцентными белками и способны к образованию хромофорной группы, однако квантовый выход их флуоресценции крайне низок. В то же время, хромобелки обладают рядом особенностей, позволяющих использовать их в качестве основы для создания новых инструментов молекулярной биологии: максимум поглощения, лежащий в области больших длин волн по сравнению с флуоресцентными белками, большое значение сдвига Стокса, свето-переключаемая флуоресценция. На основе GFP-подобных хромобелков были получены флуоресцентные варианты с эмиссией в дальне-красной области видимого спектра, представляющие большой практический интерес: они не только расширяют палитру доступных для мечения белков, но и позволяют добиться большей чувствительности детекции флуоресценции при работе с толстыми срезами или с целыми организмами, что объясняется высокой проницаемостью животных тканей именно в этом диапазоне длин волн.
GFP-подобные белки нашли широчайшее применение в биологии, однако они могут быть использованы не только в качестве флуоресцентных маркеров или индикаторов.
Методология молекулярной биологии, помимо визуализации, включает в себя множество инструментов направленного воздействия на объект исследования. Информация об изменениях, которые повлекло за собой, например, включение, выключение или модификация изучаемой системы, позволяет судить о ее функции и свойствах. Одним из способов реализовать этот подход является методика светозависимой инактивации целевых молекул посредством соединения, способствующего образованию активных форм кислорода при облучении, фотосенсибилизатора (CALI — chromophore assisted light/laser inactivation). Фотосенсибилизаторы находят применение не только области научных исследований, но и в прикладной медицине. Тот факт, что
облучение клеток, содержащих фотосенсибилизатор, при определенных условиях может приводить к запуску в них программы клеточной гибели, лег в основу фото динамической терапии рака.
GFP-подобные хромобелки представляют собой особый научный интерес и с теоретической, и с прикладной точки зрения. Ученым еще предстоит выяснить природную функцию хромсбелков и их филогенетическое разнообразие. В работе дан обзор современных представлений об этой группе GFP-подобных белков и их практических приложений и продемонстрирована возможность использования хромобелков как основы для получения белков с новыми свойствами: флуоресцентных белков с эмиссией в дальне-красной области спектра и фототоксичных белков.
Зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria (GFP)
GFP был открыт в 1962 г. при исследовании молекулярных основ люминисценции гидромедузы Aequorea victoria. При механической стимуляции в теле медузы происходит выброс белка экворина, который при взаимодействии с ионами Са2+, содержащимися в среде, начинает люминесцировать. Был измерен спектр эмиссии экворина, и оказалось, что положение его максимума (485 нм) не совпадает с наблюдаемым в живом организме (508 нм). Выяснилось, что кроме экворина в люминисценции участвует еще один белок, названный GFP, две молекулы которого образуют тетрамерный комплекс с двумя молекулами экворина. Субъединицы взаимодействуют таким образом, что происходит безизлучательный перенос энергии с экворина на GFP, что приводит к сдвигу эмиссии в зеленую область спектра. Была определена молекулярная масса GFP - 28кДа; измерены спектры возбуждения и эмиссии: белок имеет два пика возбуждения (395 и 475 нм) и пик эмиссии при 508 нм; определен квантовый выход флуоресценции GFP, который составляет 0.8 [89].
В 1992 г. был клонирован ген, кодирующий GFP [80]. В 1996 году была определена пространственная структура GFP (рис. 1) [76]. Методом рентгеноструктурного анализа было показано, что полипептидная цепь GFP уложена в образованный 11 антипараллельными р-слоями бочонок, диаметр которого составляет 24 А, а длина - 42 А. В центре Р-бочонка проходит а-спираль, в составе которой находится хромофорная группа. Защищенный белковой глобулой хромофор полностью изолирован от растворителя и контактирует только с теми аминокислотами, боковые цепи которых погружены внутрь Р-бочонка [75, 76].
Главной особенностью GFP, позволяющей использовать его в гетерологичных системах экспрессии, является способность формировать хромофор внутри белковой глобулы без привлечения внешних органических кофакторов. Хромофор образуется путем циклизации белкового остова во фрагменте 65-67 (Ser — Туг - Gly) с образованием имидазолин-5-она и последующей дегидратации метиленового мостика боковой цепи остатка Тугбб. В результате образуется структура с системой сопряженных двойных связей, способная поглощать и испускать свет в видимой области спектра (рис. 2). Наличие двух пиков в спектре возбуждения GFP объясняется тем, что хромофор может существовать в двух формах: ионизованной и нейтральной [7]. Помимо аминокислот, непосредственно входящих в состав хромофора, известны еще две крайне консервативные среди флуоресцентных белков позиции - это Arg96 и Glu222. По-видимому, эти остатки необходимы для образования хромофора [22, 76].
В 1994 г. GFP впервые был использован в качестве маркера [13]. GFP и мутанты на его основе быстро приобрели популярность в качестве флуоресцентных меток для работ in vivo. Возникла необходимость в увеличении количества цветов, доступных для мечения. Методами направленного и случайного мутагенеза были получены различные варианты GFP, пик эмиссии которых приходится на синюю, голубую или желто-зеленую области видимого спектра. Но несмотря на многочисленные попытки, получить мутантный белок с эмиссией в красной области спектра не удавалось [43, 25, 76].
С момента первого упоминания о GFP существовало мнение, что гомологов этого белка нужно искать непременно в биолюминесцентных системах, где бы они выступали в качестве вторичных эмиттеров, конвертирующих коротковолновый свет, испускаемый первичным эмиттером, в длинноволновый. Соответственно поиски гомологов ограничивались изучением животных, обладающих биолюминисценцией. Полагали также, что все гомологи GFP испускают зеленый свет. В рамках этих предположений удалось найти ген еще одного зеленого флуоресцентного белка в морском пере {Renilla reniformis), однако, найти организмы, содержащие красные флуоресцентные белки не удавалось [25].
В 1999 г. Ю.А. Лабас предложил принципиально иной подход к поиску новых флуоресцентных белков [70]. Он обратил внимание, что хотя само свойство биолюминесценции встречается у многих организмов, способ его реализации на молекулярном уровне зачастую сильно отличается [41]. Это позволило предположить, что появление биолюминесценции в разных филогенетических группах происходило независимо на основе комбинации уже существовавших функциональных доменов.
Самыми распространенными среди GFP-подобных белков коралловых полипов Anthozoa являются зеленые флуоресцентные белки. Практически все животные класса обладают зеленой флуоресценцией. Максимумы эмиссии GFP-подобных зеленых флуоресцентных белков лежат в пределах 480-520 нм. Кривые поглощения могут иметь либо один пик (440-510 нм), либо два пика (400 нм, 470-490 нм), соответствующих нейтральному и анионному состояниям хромофора.
В животных класса Anthozoa были обнаружены первые флуоресцентные белки с эмиссией в красной области спектра (максимум эмиссии при более чем 570 нм). Кроме того был клонирован ген желтого флуоресцентного белка, zFP538 коралла Zoanthus sp., максимум поглощения которого приходится на длину волны 528 нм, а максимум эмиссии на 538 нм [70]. Помимо флуоресцентных белков в кораллах класса Anthozoa были найдены GFP-подобные хромобелки, которые практически не флуоресцируют (квантовый выход флуоресценции менее 0.001), однако имеют яркую окраску и эффективно поглощают видимый свет (молярный коэффициент поглощения составляет 50000-150000 М" см ). Как правило, хромобелки имеют спектр поглощения с одним широким пиком в видимой области с максимумом при 560-610 нм (рис. 3). Примечательно, что в этой области спектра даже незначительное смещение пика поглощения приводит к существенному изменению восприятия цвета белка человеческим глазом: оттенков малинового, сиреневого, фиолетового и синего. В некоторых хромобелках удается детектировать очень слабую (квантовый выход около 0.001) красную или дальне-красную флуоресценцию в области от 590 до 650 нм [66, 39, 111].
Фотоактивируемые хромобелки
Некоторые хромобелки могут переходить во флуоресцентную форму при облучении светом определенной длины волны и интенсивности, то есть являются фотоактивируемыми. Первый фотоактивируемый хромобелок морского анемона Ammonia sulcata, названный asFP595, был описан в 2000 г. [66]. Оказалось, что если образец белка asFP595 облучать интенсивным зеленым светом, то он обратимо переходит в красную флуоресцентную форму. Через довольно короткий период (время полужизни фотоактивированного состояния около 10 с) белок самопроизвольно возвращается в нефлуоресцентное состояние. Облучение синим светом приводит к быстрому возврату активированного белка asFP595 в темновое состояние. Данная фотоконверсия является обратимым процессом и может быть повторена многократно.
В результате мутагенеза asFP595 был получен вариант asFP595, названный KFP1 (Kindling Fluorescent Protein - разгорающийся флуоресцентный белок) [16, 18]. В целом, KFP1 демонстрировал тот же тип фотоконверсии, что и исходная форма asFP595, но обладал большим временем жизни флуоресцентного состояния (50 с). Кроме того, при увеличении интенсивности и/или длительности облучения KFP1 зеленым светом происходил необратимый переход белка во флуоресцентное состояние. Различие в интенсивности флуоресценции между необратимо активированным и неактивированным KFP1 составляло 30 раз, квантовый выход при активации увеличивался более чем в 70 раз. При этом даже облучение синим светом не возвращало KFP1 в нефлуоресцентное состояние.
Хромофор, образованный из остатков Met63 - Tyr64 - Gly65, по-видимому, синтезируется в ходе тех же реакций, что и хромофор DsRed, но на последнем этапе в результате гидролиза ацилиминной связи между амидным атомом азота главной цепи и а-С атомом Met63 происходит расщепление полипептидной цепи между остатками Cys62 и Met63 (такое же расщепление может происходить в DsRed при денатурации [38]). Предполагается, что в катализе расщепления полипептидной цепи принимают участие близкие к месту расщепления аминокислоты: Thrl6, Cys64, Ser68 [69, 82].
Данная модель была впервые сформулирована на основе косвенных данных (изменения спектров поглощения и возбуждения, а также поведения мутантных вариантов asFP595 с заменами аминокислотных остатков, пространственно сближенных с хромофором) [18]. В дальнейшем, модель цис-шрсшс-изомеризации хромофора была подтверждена данными кристаллографии. Так было показано, что в темновом состоянии хромофоры asFP595 и KFP1 находятся в /ира//с-непланарной конформации и что окружение хромофора предоставляет достаточную свободу для его перехода в г/ггоконформацию [82]. Более того, удалось провести фотоконверсию мутантного белка asFP595-A148S прямо в кристалле, что позволило напрямую наблюдать светозависимую /и/?аж 7/г/с-изомеризацию хромофора [5]. Следует отметить, что флуоресцентный z/wc-изомер хромофора был непланарным, что, возможно, и объясняет низкий квантовый выход флуоресценции активированного белка asFP595 и его вариантов.
Важность нс-/??ра//с изомеризации хромофора была также продемонстрирована методом кристаллографии для белка mTFP0.7 (monomelic Teal Fluorescent Protein), демонстрирующего обратимую фотоконверсию между флуоресцентным и нефлуоресцентным состояниями [44]. Этот белок обладает яркой голубой флуоресценцией с максимумом эмиссии 488 нм, но при облучении светом с длиной волны около 450 нм быстро теряет флуоресцентные свойства, которые восстанавливаются через несколько минут после окончания облучения. Облучение mTFP0.7 в нефлуоресцентном состоянии коротковолновым светом (360-400 нм) приводит к быстрому восстановлению флуоресценции. Структура белка mTFP0.7 была разрешена как для флуоресцентного, так и для нефлуоресцентного состояния, что дало возможность их сравнения в одном белке. Во флуоресцентном состоянии хромофор mTFP0.7 является планарным и находится в цис-конформации. При переходе в нефлуоресцентное состояние происходит его /нс-ш/?а«оизомеризация, сопровождающаяся переходом в непланарную конформацию. В тря//с-конформации фенольное кольцо ориентировано таким образом, что равновесие сдвигается в пользу протонированной формы хромофора [44].
Фотоактивируемые хромобелки можно использовать для прицельного мечения клеток, отдельных органелл, или белков с тем, чтобы отслеживать затем их перемещение [16, 17, 19, 20, 21, 23]. Также недавно было продемонстрировано, что обратимо фотоконвертируемые белки, имеющие темновое и флуоресцентное состояния, являются прекрасными метками для флуоресцентной микроскопии ультравысокого разрешения [48, 86, 28]. Так, например, белок asFP595 позволяет достичь разрешения 50 нм, что существенно превосходит предел разрешения обычной световой микроскопии (половина длины волны света, или около 250 нм). Главными недостатками описанных на сегодняшний день KFP-подобных белков является низкая яркость их флуоресценции и склонность к тетрамеризации [16].
Другой метод оценки FRET основан на измерении времени жизни флуоресценции донора (FLIM), так как при эффективном FRET время жизни флуоресценции заметно уменьшается [99]. Данный метод имеет ряд преимуществ (высокая чувствительность, получение абсолютных значений, которые не зависят от концентрации флуорофоров), но, к сожалению, требует дорогостоящего оборудования.
При использовании FLIM сигнал акцептора неинформативен, более того, интенсивная флуоресценция акцептора создает существенные сложности. По этой причине использование хромобелков в качестве FRET-акцепторов представляется оптимальным для FLIM. В качестве акцепторов FRET хромобелки позволяют анализировать полный спектр эмиссии донора без поправки на ту часть флуоресценции акцептора, которая попадает в тот же канал. Таким образом, расчет FLIM оказывается значительно более точным, разница между значением сигнала и шумом возрастает.
Впервые этот подход был реализован в 2006 г. в работе [31]. Хромобелок REACh был специально создан на основе желтого флуоресцентного белка EYFP путем мутагенеза позиций вблизи хромофора. Был отобран слабофлуоресцентный белок (квантовый выход в 30 раз ниже, чем у EYFP), при этом значение максимума поглощения REACh (510 нм) практически не изменилось относительно EYFP (514 нм), а молярный коэффициент поглощения вырос на 20%. Было показано, что белок REACh может быть использован как улучшенный FRET-акцептор для EGFP. В паре EGFP-REACh перекрывание спектров эмиссии донора и поглощения акцептора превышает таковое для пары ECFP-EYFP.
Использование хромобелков для создания псевдо-мономерных меток
Как было сказано выше, олигомеризация и агрегация флуоресцентных белков является зачастую серьезным препятствием для их использования in vivo [112]. Процесс создания мономерных мутантов GFP-подобных белков крайне сложен: как правило, введение в аминокислотную последовательность флуоресцентного белка замен, направленных на снижение склонности к олигомеризации, приводит к частичной потере флуоресценции у мутантов.
В 2003 г. был предложен способ создания псевдофлуоресцентной метки [9]. Авторы предложили одновременно с флуоресцентно-меченым целевым белком экспрессировать в клетках избыток нефлуоресцентного белка. Таким образом, при тетрамеризации с большой вероятностью в одном тетрамере окажется только одна флуоресцентная молекула, связанная с целевым белком, а остальные субъединицы окажутся нефлуоресцентными. Подход был успешно применен на примере красного флуоресцентного белка M355NA, мутанта, созданного на основе хромобелка asFP595 нитчатой актинии Ammonia sulcata. В последовательность M355NA была введена замена в хромофорообразующей позиции (Y64C), был получен полностью пефлуоресцентный белок, названный asulCP-NFl. Исходный природный хромобелок asFP595 нельзя было использовать из-за способности под действием мощного зеленого света конвертироваться в форму, обладающую красной флуоресценцией. Мечение В-актина и Таи34 (тубулин-связывающего белка) M355NA с котрансфекцией asulCP-NFl показало, что использование псевдофлуоресцентной метки позволяет получать изображения не хуже, чем при использовании истинно мономерных флуоресцентных белков. Тем не менее, таким образом не удается решить одну из важнейших проблем, создаваемых олигомеризацией флуоресцентных белков, — большого размера метки [9]. Флуоресцентные белки с эмиссией в дальне-красной области спектра Создание флуоресцентных белков с эмиссией в дальне-красной области спектра расшиярет возможности многоцветового мечения, позволяет создавать новые FRET-пары [39]. Кроме того, чувствительность детекции флуоресценции в дальне-красной области спектра выше, чем в случае более коротковолновых меток. Это связано с тем, что вода и хромофоры, содержащиеся в животных тканях, практически не поглощают свет в диапазоне 650-900 нм [60, 106].
Из известных природных флуоресцентных белков наибольшим максимумом эмиссии обладает белок eqFP611 четырехцветной актинии Entacmaea quadricolor [109]. Максимум эмиссии eqFP611 приходится на длину волны 611 нм. Максимумы эмиссии флуоресценции, измеренные в значительном количестве образцов тканей кораллов, лежат в диапазоне 480-620 нм [118]. Исходя из того, что была проанализирована широкая выборка кораллов различных видов, предполагают, что поиск природных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии свыше 620 нм малоэффективен [39]. Первый белок со сдвигом в дальне-красную область на основе GFP-подобных белков был получен в 2000 г. Среди рекомбинантных мутантов белков dsFP593 и drFP583 был отобран мутант с самым высоким квантовым выходом флуоресценции, из которого с помощью полимеразной цепной реакции (ГШР) со случайными заменами был получен мутант ds/drFP616 с максимумом эмиссии 616 нм [30]. На сегодняшний день создано несколько флуоресцентных белков с эмиссией в дальне-красной области спектра: mPIum на основе mRFP с максимумальной эмиссией при 649 нм [105]. Katushka и его мономерный вариант mKate с максимальной эмиссии при 635 нм [88, 71] на основе eqFP611. HcRed на основе хромобелка кожистой актинии, Heteractis crispa, с максимумом эмиссии при 645 нм [39, 105] mPIum. При создании белка mPIum был использован подход направленной эволюции белков [105]. Для внесения случайных точечных замен в исходный ген mRFP 1.2 была использована клеточная линия В-лимфоцитов человека. При контакте с антигеном в В-лимфоцитах происходит соматическая гипермутация: внесение многочисленных замен в V-область генов иммуноглобулинов (1x10"3 мутаций на основание за одно поколение, что в 106 раз больше, чем количество мутаций в других генах за то же время) [104]. Было произведено несколько циклов случайного мутагенеза с последующей селекцией на флуоресцентном клеточном сортере (FACS, Fluorescence-activated cell sorter) клеток, экспрессирующих мутантные белки с наибольшим соотношением интенсивности флуоресценции на 660 и 615 нм, одновременно обладающие достаточно интенсивной флуоресценцией на 660 нм. С каждым циклом происходило обогащение по количеству мутантов с большей длиной волны эмиссии. После 23 циклов мутагенеза и сортировки был получен мономерный мутант mPIum, обладавший поглощением при 590 нм и эмиссией - 649 нм (сдвиг Стокса составляет 59 им). Квантовый выход белка mPIum составляет 0,1.
На каждом раунде мутагенеза производился анализ полученных белков с эмиссией в дальне-красной области спектра. Общими для них являлись замены Vall6Glu, Phe65Cys, Ilel61Met; причем оказалось, что первые две замены влияют на красный сдвиг, а третья приводит к сужению коротковолновой части пика эмиссии. Аминокислота в 65-ой позиции находится непосредственно перед хромофором, 16-ый и 161-ый остатки расположены по разные стороны от хромофора, их боковые цепи направлены внутрь. Очевидно, мутации по этим позициям приводят к изменению микроокружения хромофора.
Katushka. В 2007 г. был создан белок с эмиссией в дальне-красной области спектра, получивший название Katushka. За основу для направленного мутагенеза и мутагенеза со случайными заменами был выбран мутант природного красного флуоресцентного белка четырехцветной актинии Entacmaea quadricolor (eqFP611). Этот мутант, названный TurboRFP, отличался высокой скоростью созревания, высокой рН стабильностью и квантовым выходом. В ходе нескольких раундов мутагенеза с отбором на сдвиг эмиссии в дальне-красную область и яркость был получен белок Katushka, спектр эмиссии, которого представлен одним узким пиком с максимумом 635 нм. Квантовый выход Katushka составляет 0.34, молярный коэффициент поглощения - 65000 IVT CM"1. Katushka склонен к димеризации, поэтому на его основе в дальнешем был получен мономерный вариант, mKate, (квантовый выход - 0.33, молярный коэффициент поглощения - 45000 ЇУГ см"1) [71, 88]. В 2008 г. на основе eqFP611 удалось получить флуоресцентный белок с максимальной эмиссией при 639 нм. [61].
Создание флуоресцентного белка с эмиссией в дальне-красной области спектра на основе хромобелка из Actinia equina
Использованный подход к созданию белков с эмиссией в дальне-красной области спектра на основе GFP-подобных хромобелков был впервые предложен в работе Н. Гурской с соавторами [39]. Мы предположили, что оптимальной основой для создания флуоресцентных белков с эмиссией, сдвинутой в дальне-красную область, должны стать хромобелки, чей пик поглощения смещен в длинноволновую область. Известные на тот момент GFP-подобные хромобелки имели максимум поглощения при длинах волн менее 580 нм , что воспринимается человеческим глазом как лиловая или пурпурная окраску. С целью найти хромобелок с максимумом поглощения от 600 нм мы предприняли поиск животных образцов, окрашеных в синий цвет. Поиск велся среди обитателей морского аквариума Московского Зоопарка и среди животных рифа Оспрей, находящегося в Коралловом Море. Оказалось, что часть животных, выглядящих синими в воде, на самом деле не содержит синих белков, такой оттенок им придает поглощение красного света морской водой Образец с истинно синим окрашиванием, пурпурная актиния Рис. 14. Пурпурная актиния, Actinia (Actinia equina), был найден в Московском equina. Стрелкой показан край оооттяпк.е ножного диска, имеющий синюю окраску. Actinia equina - пурпурная (или лошадиная) актиния (отряд Actiniaria, подкласс НехасогаШа, класс Anthozoa) Позднее в морском анемоне Cnidopus japonicus был обнаружен белок с максимумом поглощения 610 нм cjBlue[15]. (рис. 14) обитает в приливной зоне берегов Европы. По краю ножного диска актинии располагается синяя полоска. Такое распределение GFP-подобных хромобелков в теле животного нехарактерно для актиний, как правило окрашен ротовой диск и кончики щупалец.
Небольшой фрагмент тела актинии, окрашенный в синий цвет, был использован для выделения РНК. На матрице РНК была синтезирована кДНК. С помощью пары вырожденных праймеров, соответсвующих консервативным областям GFP-подобных белков, удалось клонировать ген нового GFP-подобного хромобелка. В соотвествие с номенклатурой, предложенной в 2000 г. [107], синий белок актинии Actinia equina был назван аеСР597 (от Actinia equina Chromoprotein (хромобелок Actinia equina) с максимумом поглощения при 597 нм).
Хромобелок аеСР597 Нуклеотидная последовательность гена аеСР597 была определена методом автоматического секвенирвования. Длина гена аеСР597 — 696 пар нуклеотидов, что соответствует белку, состоящему из 231 аминокислотных остатков. Последовательность кДНК, кодирующая аеСР597, была помещена в базу данных GenBank с присвоением номера DQ159069.
Поиск гомологичных последовательностей в банке данных NCBI выявил ближайшего гомолога аеСР597 — белок asFP595 нитчатой актинии Anemonia sulcata. Гомология между этими белками составляет 68%. На хромофоробразующих позициях белка аеСР597 также находятся остатки метионина, тирозина и глицина (Met63yr64-Gly65). В позициях 148 и 165, располагающихся вблизи хромофора и значительно влияющих на флуоресцентные свойства GFP-подобных белков, в аеСР597 располагаются остатки Cys и Ser соответственно. Такие аминокислоты, находящиеся в позициях 148 и 165, типичны для GFP-подобных хромобелков, однако никогда не встречаются во флуоресцентных белках семейства (см табл. 1) [8]. Ген аеСР597 был экспрессирован в E.coli, кодируемый им белок был выделен и проанализирован.
При денатурации спектральные свойства определяются исключительно структурой самого хромофора, так как влияние белкового окружения исчезает. Спектр поглощения, измеренный в таких условиях, позволяет судить о типе хромофора GFP-подобного белка. Спектр поглощения аеСР597 в при щелочной и кислотной денатурации полностью совпадает со спектром поглощения хромофора DsRed. Как известно, многие хромобелки обладают DsRed-подобным хромофором [68, 81, 78, ПО]. Можно предположить, что отсутствие флуоресценции у аеСР597 связано не со структурой хромофора, а с его конформацией, определяемой белковым окружением. Сдвиг максимума поглощения DsRed-подобного хромофора в аеСР597 на 42 нм также объясняется особенностями белкового окружения в аеСР597. Электрофорез в полиакриламидпом геле образцов аеСР597
Образцы аеСР597, приготовленные с денатурацией и без денатурации, были нанесены на электофорез в полиакриламидпом геле. Нативный белок аеСР597 двигается в геле одной полосой, с подвижностью, соответствующей размеру более чем 100 кДа. Денатурированный аеСР597 двигается в геле одной полосой с подвижностью, соответствующей размеру 27 кДа. Полученные данные свидетельствуют о том, что, как и большинство GFP-подобных белков, аеСР597 в нативном состоянии образует тетрамеры, которые могут быть разрушены при денатурации. На электрофореграмме видно также наличие фрагментов с подвижностью, соответствующей 8 и 19 кДа которые, по-видимому, представляют собой белок, частично денатурированный по ацилиминной связи хромофора в процессе приготовления пробы. Подобная картина описана и для DsRed [38]. Большая часть денатурированного белка двигается в геле одной полосой, соответствующей по размеру аеСР597 с добавлением гексагистидинового пептида. Из этого следует, что образование хромофора аеСР597 происходит без расщепления полипептидной цепи. Это также косвенно подтверждает наше предположение о том, что аеСР597 имеет DsRed подобный хромофор, так как все другие известные на сегодняшний день «красные» хромофоры образуются с расщеплением полипептидной цепи. Так например, хромофор asFP595, белка обладающего наибольшей степенью гомологии с аеСР597, образуется с расщеплением полипептидной цепи, важную роль в котором играют следующие остатки, Thrl6, Cys64, Ser68. В отличие от asFP595 у аеСР597 в позиции 16 находится остаток метионина, который, по-видимому, блокирует эту реакцию.
