Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Пискарева Ольга Александровна

Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека
<
Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Пискарева Ольга Александровна. Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.03 : Пущино, 2004 102 c. РГБ ОД, 61:04-3/357

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1. Организация генома человека и мобильные элементы 11

1.2. Строение и механизмы транспозиции мобильных элементов генома человека 12

1.2.1. Транспозоны 13

1.2.2. LTR - содержащие ретротранспозоны 13

1.2.3. LTR - иесодержащис ретротранспозоны 14

1.2.4. SINE 16

1.3. Жизненный цикл LTR несодержашего ретротранспозона L1 19

1.3.1. Транскрипция 21

1.3.2. Процессинг 21

1.3.3. Трансляция 23

1.3.4. Белок ОРТ] 24

1.3.5. Белок ОРТ2 25

1.3.6. Посттрансляционные модификации белков и образование рибонуклеопроїсинового комплекса 27

1.3.7. Доставка в ядро 28

1.3.8. Интеграция в геномную днк 29

1.4. Образование инверсий и делений элемента Ы 30

1.5. Образование укороченных копий L1 32

1.6. Перемещение элементов Ы по геномной ДНК 33

1.6,1, Гомологичная рекомбинация 33

1.6.2, Транспозиционная активность элементов L1 34

1.6.3. Частота транспозиций элементов Ы 36

1 .7. Клеточные функции элемента L1 37

1.7.1, Влияние на экспрессию генов 37

1.7.2, Восстановление двухцепочечных разрывов Д1ІК 37

1.7.3, Реорганизация генома 38

1.8. Практическое применение элементов L1 38

1.8.1. Филогенетические маркеры 38

1.8.2. Система случайного мутагенеза 39

1.8.3. Вектор для переноса генов 40

Глава 2. Экспериментальная часть 41

2.1. Материалы и реактивы 41

2.1.1. Рсактивы 41

2.1.2. Штаммы E.coli и культуры клеток 42

2.1.3. Вектора 42

2.1.4. Оли гону клеотиды 42

2.1.5. Основные буферы и растворы 43

2.1.6. Бактериальные среды 44

2.2. Методы рекомбипантных днк 44

2.3. Клонирование и экспрессия ОРТІ и фрагмента ОРТ 2 элемента Г1 lis в клетках ii.colt 45

2.4. Выделение и очитка рекомбипантных белкой из клеток \:..ай\ 46

2.5. Получение поликлональных мышиных антител 46

2.6. Клонирование и экспрессия ОРТ2 элемента Ll/V.v, кодирующей обратную транскриптазу в клетках насекомых Sf 21 47

2.6.1. Получение рекомбинантной бакмиды, несущей ОРТ2 Ll/Ул... 47

2.6.2. Получение рекомбинантного бакуловируса, несущего ОРТ2 LI//.V 48

2.6.3. Определение титра рекомбинантного бакуловируса 48

2.6.4. Наращивание и хранение рекомбинантного бакуловируса 48

2.6.5. Экспрессия ОРТ2 элемента L1//v в клетках насекомых Sf 21.. 48

2.7. Выделение рекомбинантной ОТ элемента Ы//л и:* клеток насекомых Sf'2l 49

2.8. Конструирование и экспрессия элемента ЬШ.ч в клетках млекопитающих 50

2.9. Культивирование клеток эукариот 50

2.10. Выделение ядер клеток млекопитающих 51

2.1 1. Аналитические методы 51

1.1. РНК-зависимая ДНК-полимеразная реакция 51

1 .2. Получение гетерогенных матриц 51

1.3. Реакция элонгации праймера 52

1.4. Определение активности РНКазы И 52

1.5. Гель-электрофорез НК в денатурирующих условиях 53

1.6. SDS-электрофорез белков 53

1.7. Окрашивание белковых гелей нитратом серебра 53

1.8. Иммуноблотинг 53

1.9. Определение концентрации белка 54

2.12. Микроскопия 54

2.1. Световая микроскопия 54

2.2. Флюоресцентная микроскопия 54

2.12.3. Конфокальная микроскопия 54

2.12.4. Трансмиссионная электронная микроскопия 54 CLASS

CLASS Глава 3 Результаты работы и их обсуждение 56

3.1. Экспрессия гибридных белков элемента LlA/.v с целью получения пол икл о нал ьн ы х антител 56

3.2. Экспрессия белка ОРТ2 элемента Lltf.s в клетках насекомых SI2! . 58

3.3. Получение препарата обратной фанскршпазы элемента Litis 61

3.4. Оптимумы ДПК-полимеразной активности обратной транскриптазы элемента LIA/.v 63

3.5. Влияние двухвалентных катионов па активность ОТ элемента L\Hs 63

3.6. Специфичность к субстратам ОТ элемента L\Hs 66

3.7 Синтез ДНК ОТ элемента LI/7А- 67

3.8. Активность РНКазы Н ОТ элемента L1//.S 72

3.9. Локализация белка р40 элемента VAHs в клетках млекопитающих 74

3.9.1. В клетках человека линии HeLa белок р40 накапливается в цитоплазме 74

3.9.2. В клетках хомяка CHO-KI ш vivo белок р40 элемента L1//.V на капли нается в цитоплазм с 74

3. 10. Образование вирусоподобных частиц белками элемента 1/1 /7л 79

Заключение 84

Выводы 85

Литература 86

Благодарности 102

Введение к работе

Актуальность проблемы

Элементы L1 или U.NLM относятся к классу ретротранспозонов, не содержащих длинные концевые повторы (LTR), и составляют приблизительно 1.7% генома человека. Элементы эгого класса реинтегрируют в геном через РНК-посредник при участии собственной обратной траискриптазы. В основном элементы L1. генома человека (Ll//.v) функционально ме активны, так как укорочены с 5'-конца и/или имеют внутренние перестановки и/или мутации, и только около 60 копий способны перемещаться в геноме, К настоящему времени клонированы полноразмерные "активные" копии L\H,s и определены их структурные особенности (Kazazian Н., 2001). Именно активные [Alls способны вызывать мутации, наследственные заболевания, генетическое разнообразие и полиморфизм, вто время как неактивные копии являются причиной неправильного кроссинговера, приводящего либо к делении, либо к дупликации.

Консенсусная последовательность \AHs протяженностью 6-7 тыс. пар оснований содержит две не перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ). Первая рамка кодирует белок со свойствами gag белков ретровирусов, вторая - белок с активностями эндонуклеазы и обратной траискриптазы. При исследовании белка ОРТІ, р40, выделенного из клеток тератокарциномы человека, было обнаружено, что р40 имеет высокое сродство к РНК LI/-/.V (Hohjoli Н., 1996, 1997) и образует в цитоплазме клеток мультимеры (Holmes S., 1992. Hohjoh П., 1997). При изучении транспозиционной активности LIA/.v в культуре клеток было показано, что С - концевая область белка р40 содержит ряд консервативных аминокислот важных для транспозиции элемента LI (Moran J., 1996). Кроме того, было обнаружено цис-активное функционирование L1/7.V в процессе реинтеграции в геном (Moran .1., 1996, 1999, Goodier, 2000, Wei W., 2001).

В двух независимых экспериментах было показано, что активность ОТ свойственна центральному домену белка ОРТ2, хотя другие выдвинутые предположения спорны, поскольку исследования проводились на частично очищенном препарате белка ОРТ2 (Clements А., 1998), либо в клеточной системе т vivo (Dhellin О., 1997). С помощью генетического метода определения частоты событий ретротранепозиции было показано, что делеции и мутации и последовательности ОРТ2 L1//.V приводят к инактивации транспозиционной активности элемента в культуре клеток человека (Moran J., 1996). Недавно было показано, что интеграция элемента человека Lltf.v в геном обеспечивается активностью обратной транскрнпгазы белка ОРТ2, причем в качестве праимера для построения к ДНК используется 3'-выступающий конец сайта мишени геномной ДНК (Cost (I, 2002). Такой механизм впервые был описан для LTR - несодержащего ретрогранспозона R2 Вт и получил название - обратная транскрипция, прайм ированам сайтом-мишенью (Luan D., 1993). Таким образом, именно активность обратной транскриптазы является одним из важнейших факторов, определяющим возможность построения кДНК копии элемента и его дальнейшее встраивания в геном.

Совокупность имеющихся данных, касающихся молекулярной биологии LI /7.v, оставляет открытыми ряд важных вопросов, решение которых является актуальным. В частности плохо изучены функциональные и структурные свойства белка ОРТ2 LANs, так же как и особенности процесса, катализируемого этим ферментом, из-за отсутствия гомогенного и стабильного препарата фермента. Так же остается неясной роль р40 в транспозиции lAHs. Кроме того, не выяснен механизм взаимодействия белков и РНК элемента в процессе доставки матрицы гз ядро.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было исследование функциональных свойств белков, кодируемых LTR- несодержащим ретротранспозоном 1,1 генома человека. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

Г) провести экспрессию открытой рамки трансляции 2 элемента L'\Hs r эукариотической системе; выделить и очистить полноразмерпый белок ОРТ2 lAHs и охарактеризовать его ферментативную активность; исследовать ДНК-полимеразную активность белка ОРГ2 LlAAv; разработать модельную систему экспрессии элемента 1,1 в культуре клеток млекопитающих; исследовать взаимодействие белков L\Hs в процессе его экспрессии.

Работа выполнена в ВНТК мобильных генетических элементов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ.

Научная новизна

Впервые проведена характеристика ферментативной активности белка ОРТ2 элемента L!#v. Показано, что очищенный белок является Mg~f-зависимой ДНК-полимеразой и проявляет как РНК-зависимую, так и ДНК-зависимую ДНК-пол и меразные активности, но не обладает активностью РНКазыН. Впервые показаны процессивность и паузинг ОТ L\H\ в процессе синтеза ДНК.

В экспериментах по экспрессии ОРТІ в клетках млекопитающих, впервые получены доказательства накопления белка ОРТІ в цитоплазме клеток в виде неупорядоченных агрегатов.

Предложена модельная система экспрессии элемента L\Hs т vivo. Впервые обнаружено, что белки элемента Ll/V.v образуют структуры, подобные вирусным частицам. Вирусоподобные частицы имеют диаметр 92-95 нм и ассоциированы с ядерной мембраной.

Практическая ценность работы

Настоящая работа является частью фундаментальных исследований, посвященных изучению молекулярных механизмов транспозиционной активности элемента L'1/V.y. Предложена методика очисіки белка. ОРТ2 Ы/Ул из клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, несущим ОРТ2, позволяющая получать высокоочищенпый препарат, сохраняя его ферментативную активность.

Полученные в настоящей работе результаты могут быть использованы при реконструкции in vitro этапов транспозиции элемента Ll/Ул, а так же при создании векторов для переноса генов.

11 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация генома человека и мобильные элементы

Мобильные генетические элементы присутствуют во геномах как про-так и эукариот и вносят существенный вклад в его структуру и эволюцию. В настоящее время сделан значительный прогресс в понимании биологии транспозонов геномов млекопитающих и их роли в возникновении наследственных заболеваний. Реализация глобальной программы "Геном человека" внесла существенные коррективы в паши представления об организации генома. Было обнаружено, что менее 5% последовательностей генома человека являются кодирующими, остальное приходится надолго интропов, регуляторных последовательностей и мобильных генетических элементов и их остатков. Доля повторяющихся последовательностей ДНК генома составляет не менее 50%. (Lander Е., 2001).

Согласно классификации предложенной Lander Е., различают 5 типов повторяющихся последовательностей, основанных на структурных особенностях повторов; транспонирующиеся последовательности или мобильные генетические элементы -диспергированные повторы; пронессированиые псевдогены - неактивные копии клеточных генов не содержащие нитронов, к ним относят белок - кодирующие последовательности, гомологичные последовательностям истинных генов, и последовательности малых структурных РНК; простые повторяющиеся последовательности - прямые повторы, состоящие из относительно коротких к - меров, таких как (А)п, (СА)п или (CCG)n; дупликации сегментов - последовательности, состоящие из блоков приблизительно 10-300 т.п.о., скопированные из одной области генома в другую.

12 блоки тандем но - повторяющихся последовательностей центромер, теломер, кластеров рибосома)іьных генов и коротких плеч акроцентрических хромосом.

Повторяющиеся последовательности часто называют «эгоистичной» или «junk» ДНК и, как правило, не уделяют должного внимания. В действительности эти последовательности являются источником разнообразной информации о биологических процессах. Эти повторы дают богатый палеонтологический материал о протекании эволюционных событий. Ьудучи пассивными маркерами, они обеспечивают нас данными для исследования мутаций и селекции. В то же время, их транспозиционная активность продолжает реорганизовывать геном, вызывая эктопические перестановки, создавая совершенно новые гены, изменяя и тасуя уже существующие, и влияя на общие содержание GC - последовательное гей в геномной ДНК. Кроме того, мобильные элементы вносят вклад в динамику и структуру хромосом, и являются объектом изучения медицинской и нопуляционной генетики.

1.2. Строение и механизмы транспозиции мобильных элементов генома человека

В соответствии с молекулярной структурой и механизмами транспозиций эукариотические мобильные генетические элементы разделены на 4 группы: длинные диспергированные повторяющиеся последовательностей (long interspersed nuclear elements) или LINE, LI элементами, короткими диспергированными повторами или SINEs (Short Interspersed Nucleotide elements), LTR - содержащими ретротранстюзонами и ДНК - транспозонами. Независимо от типа мобильного элемента, его встраивание в новый генетический локус обычно сопровождается дупликацией короткого участка ДНК в месге встраивания (в сайте - мишени). Эти дуплицированные сегменты фланкируют встроившийся элемент, а их размер для разных мобильных элементов отличается (Сингер М., 1998). После краткой характеристики всех групп МЭ генома человека более ІЗ подробно будут рассмотрены LTR-несодержащие ретротранспозоны. Основное внимание будет уделено элементам LI Homo sapience. (LIMv).

1.2.1. Г pa неп о to и ы

Транспозоны генома человека имеют размер 2-3 т.п.о. и составляют примерно 3% от общей ДНК. По своему строению и структуре они схожи с бактериальными ДНК -транспозонами; содержат инвертированные концевые повторы и кодируют фермент- транс позазу. Механизм транспозиции - "cut and paste", осуществляется за счет активности транспозазы, однако способность МЭ перемещатся по геномной ДНК человека остается вопросом дискуссий (Lander Е., 2001). В геноме человека выделяют 7 основных классов ДНК -транспозонов, которые в свою очередь подразделяются на множество семейств, независимого происхождения (Smit Л., 1996).

В отличие от ДНК - транспозонов, ретротранспозоны кодируют обратную транскринтазу (РНК - зависимую ДНК - полимеразу) и перемещаются, используя механизм "copy and paste", процесс, включающий образование РНК - интермедиата. Приблизительно 42% генома человека составляют ретротранспозоны, и хотя большинство утих элементов-не активны, некоторые сохраняют способность к транспозиции (Sassaman D., 1997).

Выделяют автономные и неавтономные ретротранспозоны. Элементы считают автономными, если они кодируют активности необходимые для своего перемещения. Существует два класса автономных ретро транспозонов: LTR - содержащие ретротранспозоны и LTR - несодержащие рстротра не позоны.

1.2.2. MR-содержащие ретротранспозоны LTR - содержащие ретротранспозоны млекопитающих, втом числе и человека, обнаруживают сходство с ретровирусами. Последовательность LTR содержащих регротранспозонов длиной 6-І I т.п.о. и содержит в

14 разных случаях от одной до ipex (иногда более) открытых рамок, соответствующих белкам gag, рої и eiiv. Первая кодирует синтез белка, аналогичный гену gag ретро вирусов, вторая ген рої, детерминирует синтез обратной транскриптазы, а так же протеазы, РНКазы Н и интегразы. Последовательность ретротраиспозона фланкирована по концам длинными, до нескольких сотен нуклеотидов, прямыми повторами - LTR (Long Terminal Repeals, длинные концевые повторы). Эти повторы, обычно, не содержат1 длинных открытых рамок, но содержат промотор, сайт полиаденилирования и различные регуляторііьіе последовательности, влияющие на уровень транскрипции

Транспозиция проходит через этапы, характерные для ретровирусов: обратная транскрипция происходит в цитоплазматических вирусоподобных частицах, праймироваиная тРНК (Brown Р., 1987, Boeke J., 1989, Bushman F., 1990, Lichmger D., 1990, Katz R., 1990, Sandmeyer S., 1990). Эндогенные рсфовирусы млекопитающих подразделяются на гри класса (1 - III), каждый из которых состоит из множества семейств различного происхождения (Malik Н., 2000). Эндогенные ретровирусы генома человека (Human endogenous retroviruses, HERVs) и Л - частицы генома мыши (mtracisternai А-particles, lAPs) являются типичными представителями LTR - содержащих ретротранспозонов. Около 8% генома человека представлены последовательностями эндогенных ретровирусов, их дефектных копий и отдельных LTR, образовавшихся в результате рекомбинации 5'- и 3" LTR этих ретроэлементов (Lander Е., 2001).

1.2.3. LTR - несодержащие ретрогранспочоны

Впервые, LTR -несодержащие регротранспозоны были идентифицированы в клетках млекопитающих. По первому хорошо изученному LINE-1 или L1 - элементу, это семейство было названо LI -семейством, отдельные представители которого маркируются начальными буквами латинского видового названия организма-хозяина: LI Hs - человека,

15 LI Md - домовой мыши и т.д. Термин для обозначения этих последовательностей был предложен в 1985 М.Сингер (Singer М., 1985) и в настоящее время стал синонимом семейства ретротранепозонов млекопитающих. LINE элементы присущи геномам всех без исключения высших эу кар йот. В геноме человека этот класс представлен тремя семействами LI, L2 и L3, которые занимают до 21% генома человека, из них активные только элементы LI (Lander Е., 2001).

В геноме человека насчитывают приблизительно 520 000 последовательностей элемента L1, из них около 3000 - 5000 копий полноразмерные (Grimaldi С, 1984; Lander Е., 2001) и только 50 из них являются "активными" и способны перемещаться в геноме (Sassaman D., 1997).

К настоящему времени клонированы полноразмерные и транспозиционно активные копии ретрогранспозонов LI, как человека (Dombroski В., 1991, 1993, Holmes S., 1994, Sassaman D., 1997), так и мыши (Naas Т., 1998), и определены их структурные особенности. Консенсусная последовательность элементов LI человека содержит: 5'- концевую нетранслируемую область, внутренний промотор, две не перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТІ, ОРТ2), разделенные пекодирующим спенсером длиной -63 и.о., который содержит стоп - кодоны в трех рамках и 3'- кон це вую нетранслируемую область, заканчивающуюся сигналом полиаденилировамия ААТААА и поли-А последовательностью (рис. 2). Последовательность элементов фланкирована дупликациями сайта - мишени длиной 9-18 п.о. (Szak S., 2002),

Механизм транспозиций LINE-элементов генома человека остается недоказанным. Недавно было показано, что интеграция элементов L\Hs осуществляется за счет сопряженности обратной транскрипции с процессом встраивания в геном. Впервые такой механизм транспозиции был описан для R2 семейства LlNL-элементов насекомых и получил название обратная

16 транскрипция, праймированная сайтом-мишенью (Luan D., 1993). Детально этот механизм будет описан ниже. Эта особенность механизма транспозиции LINE элементов приводит к тому, что большинство копий ретропозоиов в геноме лишены 5'конца из-за преждевременного завершения процесса обратной транскрипции В случае ретротранспозонов, обратная транскрипция и встраивание в геном разобщены: обратная транскрипция происходит внутри вирусоподобных частиц, и в геном встраивается уже готовый полноразмерный ретротранспозон. Поэтому, в отличие от LINE-элементов, инсерции ретротранспозонов обычно не делегированы с 5' конца.

1.2.4. SINE

Геном млекопитающих содержит большое количество копий неавтономных ретротранспозонов. Эти элементы не кодируют белков, следовательно, для перемещения им необходимы активности, кодируемые другими автономными ретротранспозонами. К неавтономным ретротранспозонам относят SINEs, процессировнные псевдогены и SVA элементы.

Хорошо изученными являются короткие диспергированные элементы, т.н. SINEs (Short Interspersed Nucleotide Elements). Эти повторы короткие -длиной 100 - 300 и.о. содержат внутренний промотор для РНК - полимеразы III и не кодируют никаких белков. Предполагают, что для своей амплификации они используют машинерию элементов LI и используют общую У - концевую область. Промоторные области всех изученных SINEs имеют происхождение от последовательностей тРПК, за исключением одного семейства: Alu - повторов. Кроме того, Alu - пвторы имеют собственную 3' концевую область. Их аналоги в геноме мышей BI элементы (Smit А., 1999). В геноме человека выделяют три семейства SINEs: Alu - повторы, MIR и ЇІіегЗ/MIR. Из них только Alu - элементы активные. SINEs в геноме человека представлены 1,5 миллионом копий, что составляет 13% последовательности ДНК (Lander Е., 2001).

Ретроэлемент

РНК посредник - LTR элемент + LTR элемент

Ретропозон + env

Ретротранспозон ORF1 ORF2 LTR

Ту1 / Copia I укороченные HERVs

Ретровирусы -poly(A)^ THE1 человека Alu элементы генома человека gag рої ORF1 0RF2 poly & Gypsy I HERVs Эндогенные ретровирусы L1 элемент генома человека

Рис. 1. Классификация ретроэлементов

I і L

Т.П.О.

5' IJTR

3* IJTR белок ОРТІ белок OPT2

ш

Рис.2. Структура мобильного элемента L1 генома человека.

Консенсусная последовательность элементов LI//.S содержит: 5'-нетранслируемую область (5' UTR), внутренний промотор (Ры), две не перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ) и З'-концевую нетранслируемую область (3' UTR), сигнал полиаденилирования (рА) и заканчивающуюся поли-А последовательностью.

ОРТІ кодирует белок, 40 кДа, содержащий консенсусную последовательность L-x(6)-L-x(6)-L-x(6)-Lt.h. «лейциновый зиппер» (ЛЗ). ОРТ2 кодирует белок 150 кДа, содержащий домены эндонуклезы (ЭН) и обратной транскриптазы (ОТ).

19 1.3. Жизненный цикл LTR-несодержащего ретротра неп озона L1

В настоящее время в основе модели механизма транспозиции элемента LIH.v лежат знания и экспериментальные данные структуры и механизма транспозиции рстрозлементов других классов, принадлежащих другим видам. Ключевым этапом является обратная транскрипция интермедиатной Р] ІК элемента, катализируемая собственной обратной транскриптазой. Основные этапы транспозиции включают; транскрипцию, процессинг РНК, транспорт мРНК, трансляцию, поеттрансляционные модификации и образование рибонеклуопротеинового комплекса, возвращение в ядро, обратную транскрипцию и интеграцию (рис.3).

Для изучения ретротранспозиции элемента L1 генома человека был предложен интересный подход, в основе которого лежит молекулярон-генетический метод определения событий транспозиции в культуре клеток млекопитающих. В эукариотическом векторе последовательность элемента L1//.V была соединена с селектируемым маркером, который мог активироваться юлько при ретротранспозиции элемента, придавая клеткам устойчивость к антибиотику (Moran J., 1996). Используя этот метод, было показано, что для реинтеграции элемента L\Hs в геном необходимы оба белка, кодируемые ОРТІ и ОРТ2. Было обнаружено, что элемент содержит слабый сигнал полиаденилирования, следовательно, используя более сильный сигнал полиаденилирования генов, расположенных за последовательностью элемента, элементы І.Л способны переносить (транедупировать) близлежащие гены (Goodier J., 2000). Так же было показано цис-активное функционирование элемента LI в процессе своей транспозиции (Wei W., 2001). Тем не менее, данный метод не позволяет ответить на большую часть вопросов, связанных с реинтеграцией элемента L1 генома человека.

ірансіорі ш ядра I трансляции; пост-трансл. модификации;

АААп граноюрг в и цк» обраювание РНП щтюплата

Рис.3. Схема реинтеграции мобильного элемента \AHs

1.3.1. Транскрипция

Транскрипция элемента LI генома человека, по-видимому, начинается в 5' - нетранслируемой области элемента поскольку содержит промотор и не зависит от последовательности расположенной выше (Swergotd С, і 990). Однако механизм транскрипции ретротранспозона in vivo остается невыясненным. Было показано, что последовательность У -нетранслируемой области соответствует последовательности, узнаваемой РНК - полимеразой III (Kiirose К., 1995), в тоже время как сигнал полиаденидирования элемента имеет классическую последовательность ААТААА для РНК - полимеразы II (McCracken S., 1997, Hirose Y., 1998, Moran J., 1999, Oshcim Y., 1999). Транскрипция с внутреннего промотора РНК полимеразой II впервые была показана в прямых экспериментах на ретроэлементе jockey, ретротранспозоне Drosophila melanogaster (Mizroklii L., 1988), затем и для других ретроэлементов Drosophila: фактора I, F и Doc (Chamboissier М„ 1990, Burke Т., 1996, Minchiotti С, 1997). Внутренние промоторы содержат короткие специфические элементы в транскрибируемой области вместо характерных участков, подобных или аналогичных ТАТА-боксу. Подобная структура, по видимому, направляет транскрипцию РНК полимеразой II с внутреннего промотора ретротранспозона L1 генома человека. В элегантных экспериментах на культуре клеток, Moran с соавторами показали, что замена 5' - нетранслируемой области элемента L1 как человека, так и мыши на гетерологичный промотор РНК - полимеразы 11 не влияет па эффективность транскрипции элемента LI (Moran J., 1996, Naas Т., 1998).

1.3.2. Іїроцессині

Известно, что продукты транскрипции ДНК - зависимой РНК -полимеразы II подвергаются последующим модификациям: кэпированию, полиаденилированию, сплайсингу (Лысин Б. 1987).

Как упоминалось ранее, элементы L\Hs содержат функциональный сигнал полиаденилирования ЛАТА А А и, по-видимому, используют механизм расщепления и полиаденилирования, характерный для транскриптов РНК - полимеразы II. Однако два необычных свойства сигнала полиаденилирования элемента ХЛИн обращают на себя внимание.

Первое - сигнал полиаденилирования находится непосредственно перед предполагаемым поли А - хвостом. Этот факт можно объяснить двумя способами: либо расщепление и полиаденилирование происходит сразу же после последовательности АА'ГААА, в то время как, классически расщепление происходит после 10-25 п.о. (Chen F., 1995). Либо расщепление следует через обычное количество п.о. после поли А - сигнала, а остатки аденина между сигналом полиаденирования и пол и А - хвостом являются кодирующими. Если последнее верно, тогда становится понятным, почему элементы LI сохранили последовательность из несколько десятков А в процессе эволюции: позитивная селекция элементов, содержащих много А, для осуществления обратной транскрипции - интеграции в геном.

Второе необычное свойство процесса полиаденилирования элемента L1 - отсутствие регуляторних последовательностей после сайта полиаденирования элементов L1//.S. К ним относят консервативные GU -богатые последовательности на 3' - конце сигнала полиаденилирования длиной обычно 20-60 нуклеотидов, которые способствуют эффективному расщеплению и полиаденилированию (McDevitt М., 1984, McLauchlan J,, 1985). Подобная последовательность в элементе 1.1 /7л сильно вариабельна и зависит от места встраивания (в основном это полиА - хвост). Следовательно, можно ожидать, что полиадснилироваание не будет эффективным после собственного сигнала полиаденилирования. По- видимому, этим объясняется транедукция элементом 3' последовательностей: использование чужого более сильного сигнала полиаденилирования ( .!,, 1999).

Известно, что последовательность элемента L1/7.V не содержи! интронов, поэтому сплайсингу РНК не подвергается. Другие модификации

23 РНК элемента LIMv в настоящее время неизвестны. Так, например, нет прямых доказательств, что РНК кэпирована. Остается неясным, как происходит экспорт мРНК из ядра в цитоплазму.

1.3.3. Трансляция

Элемент LI генома человека содержит две неперекрывающиеся ОРТ в одной рамке, разделенные некодирующей областью (63 и.о.), в которой стоп - кодоны находятся в трех рамках. Для LINE последовательностей других классов млекопитающих отмечена другая структура ОРТ. Так, элемент LI генома мыши содержит ОРТ в разных рамках, а элемент LI генома крысы -перекрывающиеся ОРТ. Таким образом, в результате транскрипции элемента LI млекопитающих образовавшаяся мРНК является бицистроном и атипична, по сравнению с другими мРНК млекопитающих. Из экспериментальных данных было сделано предположение, что белок ОРТ 1 транслируется за счет сканирования 5'- области РНК рибосомами (McMillan J., 1993). В этих же экспериментах были получены косвенные доказательства того, что трансляции белка ОРТ2 отлична от механизма терм и нации -реинициации. Наличие в мРНК элемента LI/Y.v двух инициирующих AUG -колонов предполагает возможность инициации трансляции на прямом вхождении рибосом в цикл трансляции независимо от юп - структур и лидерных последовательностей мРНК при прямом участии их IRFS -последовательностей или за счет перескока рибосом.

Принимая во внимание вышесказанное, не удивительно что белок ОРТ I, по - видимому, транслируется значительно эффективнее, чем белок ОРТ2. Так белок ОРТІ элемента lAHs детектируется в цитоплазме клеток карциномы груди и медуллобластомы, опухолевых клеток зародышевого пути (Leibold D„ 1990, Bratthauer G., 1992, 1993, 1994; Asch H., 1996) и ряде трансформированных клеточных линий (Deragon .1., 1990, Holmes $., 1992, Trelogan S., 1995; Martin S., 2001). В то время как определение белка ОРТ2 оказалось не возможным, не смотря на попытки использовать широкий

24 арсенал современных методов детекции ОТ активности и иммунологического выявления антигенов (Ostertag Е., 2001).

1.3.4. ЬелокОРП

Последовательность ОРТІ элемента LI генома человека кодирует белок, состоящий из 338 аминокислот и молекулярной массой -40 кДа (рис. 2). В биохимических исследованиях белка ОРТІ или р40, выделенного из иммунологически позитивных к р40 клеток, было обнаружено, что во -первых, белок ОРТІ имеет высокое сродство к РНК элемента LI (Hohjoh Н., 1996, 1997) и, во-вторых, образует мультимеры в цитоплазме клеток тератокарциномы человека (Holmes S., 1992, Hohjoh 11., 1997). Сходные результаты были получены и для белка ОРТІ элемента L1 генома мыши (Kolosha V., 1997). Так же, было показано, что комплекс, образованный белком р40 и РНК элемента 1/1, устойчив к высоким концентрациям солей и активности рибонуклеаз (Hohjoh Н., 1997). В другой работе, исследуя частично очищенные мультимеры (р40)л - РНК, были получены данные, свидетельствующие о том, что р40 специфично связывает одпоцепочечные участки РНК элемента 1/1 (Hohjoh Н., 1997). Однако, нельзя исключать, что это артефакт исследований in vitro, т.к. методика выявления специфичных участков связывания РНК элемента L1 с белком ОРТІ включала обработку рибонуклеинового комплекса РНКазой ТІ.

Реальный размер белка ОРТІ элемента L1 геномов млекопитающих может варьироватьт как между видами, гак и внутри вида. Например белок ОРТІ элемента L1 мыши может отличаться на 28 а.к. (Adey N., 1994; Goodier J,, 2001; Mears M, 2001). Для белка р40 человека размер белка постоянен,

На основание компьютерного анализа аминокислотной последовательности белка ОРТІ было выявлено, что N - концевая часть полипептидной цепи образует альфа- спираль и «лейциновый зиппер», структуру с регулярным чередованием лейцинов L-X6-L-X6-L-X6-L, о первой трети цепи (Holmes S., 1992; Hohjoh 11,1996). Выло сделано

25 предположение, что р40 образует мулыимеры в цитоплазме за счет взаимодействия доменов «лейциновый зиппер» каждой молекулы р40 и стабилизированные межбелковыми дисульфидными связями. ІЇ то же время в этих ри бону клеопро геи новых частицах не было обнаружено ОТ активности. Предполагается; что консервативная С-концевая часть отвечает за связывание с РНК, а консервативная N - концевая часть участвует в белок-белковых взаимодействиях. Так например, было показано, что белок ОРТІ мыши проявляет активность шаперонов нуклеиновой кислоты in vitro (Martin S.,200l).

1.3.5. Белок OPT2

Последовательность ОРТ2 кодирует белок, состоящий из 1275 аминокислот и молекулярной массой 148 988 Да (рис.2). Это один из наиболее больших ферментов в семействе РНК-зависимых ДНК-полимераз. Проведенный компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка ОРГ2 показал, что полипептидная цепь ОРТ2 формирует в N-концевой области эпдонуклеазный домен (Feng Q,, 1996), в центральной части - домен обратной транскриптазы (Mathias S , 1991), а в С-концевой части - домен подобный «цинковым пальцам» (Fanning Т., 1987).

Домен эндонуклеазы эволюционно относят к доменам семейства LTR -несодержащих ретротранспозонов, кроме того положение консервативных а.к. соответствует положению каталитического центра экзонуклеазы III, экзонуклеазы E.coli (FcngQ., 1996; Gorman М, 1997; .lurka J., 1997; Martin F., 1995; Мої С, 1995; Malik F., 1999).

Домен эндонуклеазы O.PT2 ретротранспозона Ы Hs был экспресс и рован в клетках бактерий и его ферментативная активность охарактеризована. Было показано, что эндопуклеазная активность не специфична, и осуществляет одиночный разрыв в двойной цепи ДНК (Feng Q., 1996; Cost G., 1998). Однако выявить эндонуклеазную активность на препарате полноразмерного белка ОРТ2 было не возможно (Cost G., 2002,

26 ] Іискарсва О, и Шматченко В. неопубликованные данные). По - видимому, это связано с третичной структурой белка ОРТ2: каталитический центр эндонуклеазы находится внутри белковой молекулы.

Анализ последовательности доменов ОТ всех LTR -несодержащих рєтротранспозонов показал их близкое сходство (Malik Н., 1985). Кроме того, последовательность ОТ LTR -несодержаших рєтротранспозонов гомологична консервативным участкам ОТ отдаленных, семейств, как LTR -содержащих рсїротранспозонов, так и ретро вирусов (Xiong Y., 1990). Для вышеупомянутых O'.l" характерно проявлять активность внутри вирусоподобных частиц, используя в качестве прайм ера і РНК и процесс обратной транскрипции проходит через ряд промежуточных этапов (Whitcomb J., 1992). Для ОТ LTR - несодержаших рєтротранспозонов механизм обратной транскрипции упрощен: в качестве праймера используется З'-выступающий конец разрыва геномной ДНК (І ліан D., 1993).

Третий консервативный домен ОРТ2 - С-концевой, обогащен цистеинами (Fanning Т., 1987). Этот домен консервативен у всех известных элементов L! млекопитающих и его относят к классу ССНС, т.н. «цинковые пальцы» (Duvernell О., 1998, Goodwin R., 2001), «Цинковые пальцы» характерны для нуклеокапсидных белков всех ретровирусов, за исключением семейства спумавирусов (Berg J., 1990; Klein D., 2000), и обнаружены также у других белков, способных связывать одноцепочечную РНК (Aniing S., 1996; Barabino S., 1997). Эти данные позволяют предположить участие белка ОРТ2 в белок нуклеиновых взаимодействиях, в частности, связывание белком ОРТ2 РНК элемента L! в процессе образования промежуточных продуктов ретрогранепозиции.

Ранее было показано, что делении и мутации в ОРТ2 ретро гранспозона LI Hs приводят к снижению или полной инактивации транспозиционной активности элемента в культуре клеток человека (Могап .1., 1996). Эксперименты двух независимых групп исследователей показали, что

27 активность ОТ свойственна центральному домену белка ОРТ2, хотя другие выдвинутые предположения спорны, поскольку исследования проводились на частично очищенном препарате белка ОРТ2 (Clements А., 1998), либо в клеточной системе in vivo (Dhellin О., 1997). Именно активность обратной транскриптазы является одним из важнейших факторов, определяющим возможность построения кДЬЖ копии элемента и его дальнейшее встраивание в геном. Однако функциональные и структурные свойства ОТ речротранепозона L1 человека плохо изучены, так же как и особенности процесса, катализируемого этим ферментом, из-за отсутствия гомогенного и стабильного препарата фермента.

1.3.6. Посттрансляционные модификации белков и образование рибонуклеопрогеинового комплекса

Анализ аминокислотной последовательности белков ОРТІ и ОРТ2 предсказывает наличие сайтов для различных посттрансляционных модификаций: фосфорилирование, N - гликозилирование, мєристилирование, амидирование. Однако экспериментальных доказательств процессии га белков к настоящему времени не получено.

Предполагается, что белки ОРТІ и ОРТ2 вместе с РНК элемента образуют рибонуклеиновый комплекс в цитоплазме, который защищает РНК элемента от внутриклеточных РНКаз и доставку всех компонентов в ядро. В пользу этой гипотезы говорят данные по биохимической характеристике белка ОРТІ in vitro. Так при выделении белка ОРТІ из клеток тератокарципомы человека, было обнаружено, что белок образует мультимеры совместно с РНК элемента. Образованный комплекс был устойчив к высоким концентрациям солей и активности рибонуклеаз (Hohjoh Н , 1997). Результаты другого эксперимента свидетельствовали в пользу того, что белок ОРТІ специфично связывает одноцепочечные участки РНК элемента LI (Hohjoh Н., 1997). Однако ОТ активности в этих мультимерах обнаружено не было.

1.3.7. Доставка в ядро

Для успешного завершения транспозиции элемента L1 в геномную ДНК, образовавшийся интермедиа!, состоящий из РНК и белков элемента, должен каким то образом попасть в ядро. Известно, что белки с молекулярной массой более 60 кДа не проникают в ядро за счет пассивной диффузии через ядерные поры (Gorlich D., 1999). Поскольку белок ОРТ! не был обнаружен в ядре (Hohjoh Н., 1996), а белок ОРТ2 имеет молекулярную массу около 150 кДа, следовательно, доставка обратной транскриптазы и РНК матрицы к геномной ДНК должна осуществляться за счет активного транспорта через ядерные поры с затратами энергии, либо во время растворения ядерной мембраны во время митоза или мейоза. В ряде экспериментов на культуре клеток было показано, что С концевая область белка р40 содержит ряд консервативных аминокислот важных для транспозиционной активности элемента LI (Moran J., 1996), С помощью этого метода было показано цис-активное функционирование элемента L1 в процессе своей реинтеграции в геном (Moran J., 1996, 1999, Goodier J., 2000, Wei W.,2001).

Известно несколько механизмов доставки белков в ядро В классическом способе импорт белков обеспечивается специальными белками - импортинами (так же называемыми кариоферинами), которые узнают специфические аминокислотные последовательности (nuclear localization signals, NLS, или сигналами ядерной локализации) (Gorlich D., 1999, Nakielny S., 1999). Однако, ни анализ аминокислотной последовательности белков обеих рамок па присутствие NLS-подобных последовательностей, ни экспериментальные данные, не подтверждают использование описанного механизма для доставки РНК и белков элемента в ядро.

Другими способами доставки в ядро может быть связывание с белками элемента других белков уже содержащих NILS, либо наличие неких специфических последовательностей в РНК элемента (Osteitag К, 2001). Так

29 же, можно сделать предположение, что для доставки своих белков и РНК в ядро элемент I...1 образует рибонуклеопротеиновы и комплекс, подобный вирусным частицам, который проникает в ядро, либо через бреши в ядерной мембране, либо при ее растворение во время митоза или мейоза.

1.3.8. Интеграция в геномную ДНК

Элементы L1, по - видимому, транскрибируются и интегрируют в геном за счет сопряженных процессов обратной транскрипции и интеграции, механизма, который получил название обратная транскрипция праймированная сайтом-мишенью (ОТПС). Первоначально ОТПС была показана для элемента R2, сайт-специфический, LTR - несодержащий ретротраиспозон, обнаруженный у артропод (Luan D., 1993). Ретротранспозоны R2 имеют одну ОРТ, кодирующую эндонуклеазу рее фикции типа II и активность ОТ. В изящном эксперименте т , используя бактериально экспрессированный белок R2, было показано, что эндонуклеазный домен этого белка расщепляет некодирующую цепь в последовательности rena28S РНК в определенном месте (мишени). Образовавшийся 3' - ОН разрыв ДНК используется доменом ОТ белка R2 в качестве праймера, а РНК элемента R2 - в качестве матрицы для построения кДНК элемента. После завершения обратной транскрипции РНК происходит расщепление кодирующей цепи и интеграция. В результате образуется точная дупликация исходного сайта - мишени, которая фланкирует вновь встроенный элемент (Luan D., 1993). Предполагается, что элемент Ы генома человека также использует механизм ОТПС для обратной транскрипции и интеграции. В пользу этой гипотезы говорят следующие данные: в геноме элементы LI обычно фланкированы точными дупликациями сайтов-мишеней размером 7-20 и.о., обычным следствием реакции ОТПС; состав нуклеотидов в предсказанном сайте расщепления обычно обогащен Т, которые комплиментарны З'-концевой пол и А зо последовательности элемента L1; вероятность образования нары: праймер-матрица возрастает; и наконец, в последних экспериментах in vitro, полноразмерный белок ОПТ2 элемента L1 слитый на С-конце с TST осуществлял ограниченное количество реакций О'ГПС (Cost С, 2002).

Модель ОТПС для элемента L1 предсказывает, что в процессе инициации обратной транскрипции белок ОРТ2 взаимодействует с полиА-хвостом РНК элемента Ы, но следует подчеркнуть, что прямых экспериментальных доказательств этой модели до сих пор нет.

Анализ последовательностей ДНК в местах встраивания элемента LI подтверждает гипотезу, что для обратной транскрипции в качестве ираймера ОТ элемента LI использует Т - богатые последовательности геномной ДНК, которые отжигаются с А - богатыми 3' - концевыми последовательностями РНК" элемента LI (Ostertag Е., 2001), По - видимому, этим объясняется положительная селекция элементов L1, содержащих А - богатые последовательности на 3' - конце в процессе интеграции элементов.

1.4. Образование инверсий и делений элемента УЛ.

Приблизительно 25 % недавних вставок L1 содержат инверсии от нескольких сотен до 15 сотен нуклеотидов последовательности элемента (Ostertag Е., 2001). Такие инверсии всегда включают 5'- конец элемента L! и являются еще и копиями, укороченными с 5'-конца. Другими словами, если последовательность L1 представить как 5-A-B-C-D-E- 3', тогда инверсию можно представить как 5'- С -В- -D-E- 3', Место инверсии может содержать еще и делению или дупликацию. Предлагается модель, описывающая механизм образования инверсий, как результат О'ГПС (Ostertag Е., 2001).

Если предположить, что расщепление второй цепи ДНК происходит до полного завершения обратной транскрипции, то дополнительный 3'-гидроксил становится доступным для праймироваиия еще одной реакции обратной транскрипции. Этот потенциальный праймер произвольно

5* разрыв первой цепи сайт - мишень 111111111111 ш разрыв второй цепи

I I I I III I J | | | | | | |

РНК L1 интеграция *» *» Я» в» обратная транскрипция

ДСМ

синтез ДИК

КОПИЯ і I

Рис. 4. Механизм обратной транскрипции, используемый ретротранспозоном L1 для интеграции в геном. ДСМ, дупликация сайта-мишени.

32 отжигается с РНК Ы в любом месте и прай м и рует обратную транскрипцию в сайте удаленном от З'-конца РНК LI, уже задействованном в реакции ОТ. Таким образом, РНК элемента может быть праймированна двумя различными праймерами в двух различных местах, вероятность, которых назвали двойным прайм ированием. Разрешение структуры РЫК/кДНК, образовавшейся в результате двойного праймирования, может образовать типичную инверсию L1, усеченного с 5'-конца. В зависимости от протяженности реакции обратной транскрипции от З'-конца РНК LI, точка инверсии может дополнительно содержать делению или дупликацию. Эта модель предсказывает все типичные структуры инверсии элемента, которые обнаружены в геноме по базам данных, и не предсказывает структуры, которые не обнаружены.

Если эта модель верна, тогда основания на З'-конце внутреннего праймера должны быть комплиментарны основаниям матрицы РНК L1 прямо проксимално к точке инверсии. Кроме того, расщепление второй цепи ДНК должно происходить до полного завершения обратной транскрипции. Это предсказание полностью подтверждено при анализе недавних вставок LI, обнаруженных в базе данных по геному (Ostertag Е., 2001).

Для элемента R2 в экспериментах in vitro было показано, что расщепление второй цепи ДНК происходит после окончания обратной транскрипции (Luan D., 1993). Вероятно, что механизм ОТІ 1С для элемента R2 и элемента II отличаются в этом отношении.

1.5, Образование укороченных копий L1.

Большая часть вставок элемента L І in vivo значительно укорочена с З'-конца: средняя протяженность вставки тол їжо около I кб, или 1/6 часть полноразмерного элемента (Lander Е., 2001). Преобладание укороченных копий элемента объясняется, по - видимому, неспособностью обратной транскриптазы L1 полностью копировать РНК элемента прежде чем произойдет диссоциация комплекса фермент - РНК. Образование

33 укороченных копий может быть так же вследствие активности клеточных РНКаз, останавливающих ОТ элемента. LI. Расщепление РНК раньше завершения обратной транскрипции, с последующей интеграцией не полностью синтезированной копии может приводить к вставке элемента, усеченного с 5'- конца.

1.6. Перемещение элементов L1 но геномной ДНК

В настоящее время известны несколько механизмов перемещения элементов L1 в геномной ДНК, способных быть причиной наследственных заболеваний: уникальная гомологичная рекомбинация, непосредственно встраивание элементов в гены и предоставление своей машинерии для транспозиционной активности других ретроіранепозонов.

1.6.1. Гомологичная рекомбинация

В геноме человека насчитывают приблизительно 520 000 последовательностей элемента L1, что составляет около 17% геномной ДНК (Lander Е.5 2001). Высокая частота повторения гомологичных последовательностей является удобным материалом для их рекомбинации.

Гомологичная рекомбинация элементов L1 встречается крайне редко, намного чаще - для Alu - повторов (Deininger Р., 1999). Неправильное спаривание последовательностей L1 и неравный кроссинговер стали причиной трех недавно обнаруженных делеций приведших к заболеваниям (Burvvinkel В., 1998, Segal Y., 1999). Древная дупликация имеющая важное эволюционное последствие-дупликация гамма - глобиновых генов, была обнаружена у приматов Нового Свега (Fitch D., 1991). Было описано более 40 отдельных случаев различных заболеваний, причиной которых явились делении в результате неправильного спаривания и кроссинговера А1ц -повторов (Deininger Р., 1.999).

Было выдвинуто несколько объяснений причин гомологичной рекомбинации, чаще наблюдаемой между последовательностями А1п -

34 элементов нежели между последовательностями LI (Deininger Р., 1999). Ек>-первых, среднее расстояние внутри геномной ДНК между двумя элементами L! намного больше, чем между двумя Alu- повторами, таким образом, вероятность спаривания 1/1 - LI крайне низка, и возможно, приводит к легальным последствиям. Во - вторых, элементы L1 концентрирую гея в AT -богатых областях ДНК, в то время как Alu - повторы - в GC - богатых. І Іоскольку AT - области относительно бедны генами и даже если рекомбинация между L1 - Ы случается чаще, чем ожидаем, то к делециям последовательностей генов приводит значительно реже.

1.6.2. Транспозиционная активность элементов L1

Предполагается, что транспозиция L1 -элементов происходит с более или менее постоянной частотой вплоть до настоящего времени. Лучшим тому подтверждением служат результаты исследования присутствия-отсутствия L1-копий в определенных локусах: комплексе Ь-глобиновых генов мыши (Kingsmore S., 1994, Mulhardt С, 1994). Во всех исследованных случаях элементы L1 фланкированы по месту встраивания дупликациями сайтов-мишеней ДНК "хозяйского" происхождения. Само наличие ДСМ, фланкирующих копии L1, указывает на способность последних к транспозиции

Более того, были обнаружены и описаны совсем недавние встраивания ретротранспозонов в геноме человека, ставшие причиной заболеваний человека (Kazazian 11., 1999). Из 35 описанных случаев на долю инсерций элементов 1.1 приходится 13, Alu- повторов - 19, вставка SVA - 2 и одна.-встраивание последовательности, трансдуцироваиной элементом SVA. Встраивания пронессированных псевдогенов обнаружено не было, не смотря на то, что некоторые из этих последовательностей полиморфны.

Если рассмотреть распределение случаев инсерций, то получается следующая картина. Большая часть интеграции обнаружена в X хромосоме -50% (18 инсерций), причем большая доля приходится па транспозиции

35 элементов LI. Так, в генах X хромосомы было обнаружено 1 I новых всгавок элементов L1; в некодирующих областях X -хромосомы -6 вставок A In - повторов и I элементов SVA. Некоторые вставки LI, вызвавшие заболевания, сцепленные с X хромосомой, являются de novo событиями. В одном случае L1/-/.V встроился в локус фактораУШ свертывания крови, причем у обоих родителей копия LINE в соответствующем локусе отсутствует (Kazazian П., 1988, Woods-Samuels Р., 1989), в другом -произошла инсерция LI/V.v в иитрон одной из копий е-тус юна (Kazazian 1-1., 1998). Таким образом, леї ко выявляемыми инсерциями являются встраивание мобильных элементов в гены половых хромосом и аутосомальных доминантных заболеваний.

Недавние вставки элементов L1 имеют определенные характеристики. Все инсерции элемента, за исключением одной, фланкированы обычными дупликациями сайта - мишени. 12 всгавок содержат укороченные копии элемента длиной от 300 п.о. до 3,8 т.п.о., 2 вставки полноразмерные копии, с интактными ОРТ. Три из 14 транедуцировали 3' концевые фланги.

13 инсерции элементов L1 стали причиной заболеваний, так как встраиваясь в экзоны или в и троны генов, нарушали их транскрипцию. Инсерции в экзонах приводят, по- видимому, либо к появлению антисмысловых кодонов, либо пропуску РНК - полимеразой «разорванного» зкзона. Встраивание в интроны приводні к тому, что РНК - полимераза пропускает экзоны или персскакивет их и как следствие снижается эффективность транскрипции или стабильность первичного транскрипта. Например, вставка элемента L1 в иитрон ген фукутина у пациента с мышечной дистрофией типаФукуямя привело к альтернативному сплайенгу (Narita N., 1993), также как и в случае с инсерцией в иитрон renaCYBB у пациента с хроническим грануломатозом. Полноразмерная вставка элемента, в интрон гена |3 - глобина у пациента с |3 -талассемией и гена RP2 у пациента с retinitis pigmentosa вызвала низкий уровень или полное отсутствие синтеза мРНК с нормальным сплайсингом (Ostertag В., 2001).

36 Описанные выше случаи инсерции элементов L1 были обнаружены во время эбриогенеза, но одна вставка была описана и для соматических клеток. Элемент LI интегрировал в экзон гема Л.РС (adenomatous polyposis col і) в опухоли ободочной кишки. Иисерция была обнаружена только в опухолевых тканях кишечника пациента, но не в нормальной (Miki Y., 1992).

1.6.3. Частота транспозиций элементов L1

Закономерно возникает вопрос, сколько активных элементов Ы в геноме человека и какая частота транспозиций?

Группой исследователей была проведена кропотливая работа по выделению и характеристике полноразмерных элементов L1 из геномной библиотеки (Doinbroski В., 1991, 1993, Holmes S., 1994, Sassaman D., 1997). Было обнаружено, что около 50% элементов содержали 2 интактные ОРгГ и примерно половина из них (или четверть от всех выделенных) показала транспозиционную активность в культуре клеток (Moran J., 1996). Было сделано предположение, что в геноме человека находится 30-60 копий активных элементов Ы . Анализ последовательности генома человека выявил приблизительно 520 000 последовательностей элемента L1. Было обнаружено, что около 3000 - 5000 копий полноразмерные, а копий не содержащих мутации только 79 (Lander L\, 2001). Если предположить, что активными являются не более 30%, то получим примерно 25 - 30 транспозициоино активных копий элементов L1 на гаплоидный геном или 50 - 60 на диплоидный. Эти результаты хорошо соотносятся с экспериментальными данными Sassaman et al (Sassaman, 1998)

Частоту ретротранспозиций также пытались оценить различными методами, используя частоту мутаций специфичных генов и общую частоту мутаций в эбриогенезе. По разным подсчетам, частота ретротранспозиций колеблется от 1 встраивания на каждые 4 индивидуума до 1 на каждые 100.

Частота инсерции для элементов L1 составляет примерно 1 вставка на каждые 10 - 250 индивидуумов (Ostertag Е., 2001),

1.7. Клеточные функции элемента \Л

1.7.1. Влияние на экспрессию генов

Известно, что мобильный генетический элемент, встраиваясь в новом сайге геномной ДНК, может существенно изменять экспрессию генов хозяина. Поэтому, в зависимости от места встраивания, могут проявляться различные эффекты: а) инактивация проявления генов хозяина в результате встраивания МЭ внутри гена. Например, инсерция в жзонах может приводить к появлению антисмысловых кодонов или разрыву экзона, и соогвеїсі венно сю пропуску во время транскрипции. В то время как встраивание в имтромы, по- видимому, снижает эффективность транскрипции или стабильность первичного транскрипта б) регулируемый исключительно МЭ или в) совместный контроль проявления гена в результате встраивания вего регуляторную область, поскольку последовательности рстрогранспозонов содержат регуляторные участки.

1.7.2. Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК

Наряду с этим, можно предположить наличие других эффектов встраивания мобильных элементов в ДНК хозяина. В некоторых случаях присутствие их транспозиционной активности может помочь клетке выжить при возникновении дву це почечных разрывов в ДНК даже при отсутствии рекомбинациейной системы репарации. Показано, что для процесса репарации необходима функциональная обратная трапскриптаза (Teng еи al. 1996), т.е. ретротранспозоны могут участвовать в репарации двуцепочечных разрывов ДНК, принося пользу хозяйской клетке. Было сделано предположение, что подобная система репарации может работать и у вьіспіих эукариот и, возможно, способность ретроіранспозонов к репарации

38 хозяйскою генома играет существенную роль в поддержании высокой копийности ретроэлсментов (Teng, 1996, Moore, 1996). 'Гак недавно было показано, что элементы L1 могут заполнять возникшие двуцепоцечные разрывы в ДНК хозяина (Morrish Г., 2002), таким образом, участвуя в репарации разрывов геномной ДНК.

1.7.3. Реорганизация генома

Как активные, так и пассивные копии 1,1, учитывая их количество в геноме, могут служить сайтами гомологичной рекомбинации с возникновением перестроек генетического материала, втом числе, и транслокаций. При этом постулируется наличие бивалентного агента, специфически узнающего последовательность элемента LI и какой-либо собственный домен, что приводит к жесткому позиционированию гомологичных хромосом в случае примерно одинакового распределения L1-последовательностей, что, в свою очередь, существенно снижаег количество рекомбинационных событий, приводящих к возникновению событий неравного кроссинговера. Учитывая, что 1-фактор гибридного дисгенеза дрозофилы является U-подобным элементом, вышеописанный принцип может быть использован и процессах видообразования. Более того, мутации, вызывающие либо увеличение частоты транспозиции LINE -элементов, либо усиления экспрессии ОРТ2, могут, в конце концов, приводить к чрезмерному накоплению копий LINE и SINE-элементов и псевдогенов, увеличивая генетический груз и, таким образом, влиять на выживание организма и, далее, вида.

1.8. Практическое применение элементов L1 1.8.1. Филогенетические маркеры

Присутствие ретротранспозонов L1 в геноме человека на протяжении по крайней мере 700 млн лет, их продолжающаяся экспансия и транспозиционная аісгивность, а также их стабильная интеграция и передача .19 но наследству - вот свойства элементов І.Л, которые делают их незаменимыми филогенетическими маркерами. Для проведения филогенетического анализа между видами могут быть использованы древние встраивания LI (Aiidersson С, 1998, Cantrell М., 2000, Hughes .1., 2001). В то время, как новые инсерции могут выступать в роли средства изучения недавней динамики популяции человека, поскольку являются по своей природе полиморфными (Cantrell М, 2000, Boissinot S., 2001). В качестве филогенетических маркеров можно использовать Alu- повторы, поскольку они так же обладают выше перечисленными признаками, и уже были использованы для исследования разнообразия вида Homo sapience (Aiidersson С, 1998).

1.8.2. Система случайного мутагенеза

Поскольку эндонуклеазная активность белка ОРТ2 элемента L1 не является сайт-специфичной, то распределение мест встраивания элемента L1 относительно случайное событие как по геному, так и внутри гена. Способносгь разрывать последовательность генов и стабильно наследоваться делает эти элементы потенциально привлекательным средством для системы случайного мутагенза мышей (Moran j., 1999). Совершенно недавно был предложен метод, использующий зеленый флюоресцентный белок в составе рстротрансмозиционной кассеты, позволивший обнаружить единичные транспозиционпо позитивные клетки т vivo (Ostertag В., 2000). Применение этого метода открывает новые возможности системы случайного мутагенеза на основе элемента LI. Кроме того, было показано, что транспозиционная активность элементов L1 в мышиных клетках зародышевого пути более чем 1 инсерция на 100 зиготу (Ostertag Е., 2000). Описанный подход может стать основой для мощной и простой системы создания мутантных мышей, не прибегая к стратегии клонирования эмбриональных клеток.

40 1.8.3. Вектор для переноса генов

Способность элемента L1 стабильно встраиваться в геномную ДНК и переносить близлежащие З'-концевые последовательности, а. также кодирование белков, которые являются эндогенными и не вызывают иммунного ответа являются привлекательными признаками при создании векторов на основе полной или частичной последовательности ретротранспозона. LI для переноса генов. Поскольку, развитие современной медицины предполагает разработку эффективных и безопасных молекулярно-генетических способов адресной доставки генов или замену дефектной копии в генотерапии, то элементы L1 выступают в роли перспективных кандидатов для замены уже существующих рстровирусных систем доставки.

Строение и механизмы транспозиции мобильных элементов генома человека

В соответствии с молекулярной структурой и механизмами транспозиций эукариотические мобильные генетические элементы разделены на 4 группы: длинные диспергированные повторяющиеся последовательностей (long interspersed nuclear elements) или LINE, LI элементами, короткими диспергированными повторами или SINEs (Short Interspersed Nucleotide elements), LTR - содержащими ретротранстюзонами и ДНК - транспозонами. Независимо от типа мобильного элемента, его встраивание в новый генетический локус обычно сопровождается дупликацией короткого участка ДНК в месге встраивания (в сайте - мишени). Эти дуплицированные сегменты фланкируют встроившийся элемент, а их размер для разных мобильных элементов отличается (Сингер М., 1998). После краткой характеристики всех групп МЭ генома человека более подробно будут рассмотрены LTR-несодержащие ретротранспозоны. Основное внимание будет уделено элементам LI Homo sapience. (LIMv).

Транспозоны генома человека имеют размер 2-3 т.п.о. и составляют примерно 3% от общей ДНК. По своему строению и структуре они схожи с бактериальными ДНК -транспозонами; содержат инвертированные концевые повторы и кодируют фермент- транс позазу. Механизм транспозиции - "cut and paste", осуществляется за счет активности транспозазы, однако способность МЭ перемещатся по геномной ДНК человека остается вопросом дискуссий (Lander Е., 2001). В геноме человека выделяют 7 основных классов ДНК -транспозонов, которые в свою очередь подразделяются на множество семейств, независимого происхождения (Smit Л., 1996).

В отличие от ДНК - транспозонов, ретротранспозоны кодируют обратную транскринтазу (РНК - зависимую ДНК - полимеразу) и перемещаются, используя механизм "copy and paste", процесс, включающий образование РНК - интермедиата. Приблизительно 42% генома человека составляют ретротранспозоны, и хотя большинство УТИХ элементов-не активны, некоторые сохраняют способность к транспозиции (Sassaman D., 1997).

Выделяют автономные и неавтономные ретротранспозоны. Элементы считают автономными, если они кодируют активности необходимые для своего перемещения. Существует два класса автономных ретро транспозонов: LTR - содержащие ретротранспозоны и LTR - несодержащие рстротра не позоны. LTR - содержащие ретротранспозоны млекопитающих, втом числе и человека, обнаруживают сходство с ретровирусами. Последовательность LTR содержащих регротранспозонов длиной 6-І I т.п.о. и содержит в разных случаях от одной до ipex (иногда более) открытых рамок, соответствующих белкам gag, рої и eiiv. Первая кодирует синтез белка, аналогичный гену gag ретро вирусов, вторая ген рої, детерминирует синтез обратной транскриптазы, а так же протеазы, РНКазы Н и интегразы. Последовательность ретротраиспозона фланкирована по концам длинными, до нескольких сотен нуклеотидов, прямыми повторами - LTR (Long Terminal Repeals, длинные концевые повторы). Эти повторы, обычно, не содержат1 длинных открытых рамок, но содержат промотор, сайт полиаденилирования и различные регуляторііьіе последовательности, влияющие на уровень транскрипции

Транспозиция проходит через этапы, характерные для ретровирусов: обратная транскрипция происходит в цитоплазматических вирусоподобных частицах, праймироваиная тРНК (Brown Р., 1987, Boeke J., 1989, Bushman F., 1990, Lichmger D., 1990, Katz R., 1990, Sandmeyer S., 1990). Эндогенные рсфовирусы млекопитающих подразделяются на гри класса (1 - III), каждый из которых состоит из множества семейств различного происхождения (Malik Н., 2000). Эндогенные ретровирусы генома человека (Human endogenous retroviruses, HERVs) и Л - частицы генома мыши (mtracisternai А-particles, lAPs) являются типичными представителями LTR - содержащих ретротранспозонов. Около 8% генома человека представлены последовательностями эндогенных ретровирусов, их дефектных копий и отдельных LTR, образовавшихся в результате рекомбинации 5 - и 3" LTR этих ретроэлементов (Lander Е., 2001).

Впервые, LTR -несодержащие регротранспозоны были идентифицированы в клетках млекопитающих. По первому хорошо изученному LINE-1 или L1 - элементу, это семейство было названо LI -семейством, отдельные представители которого маркируются начальными буквами латинского видового названия организма-хозяина: LI Hs - человека, LI Md - домовой мыши и т.д. Термин для обозначения этих последовательностей был предложен в 1985 М.Сингер (Singer М., 1985) и в настоящее время стал синонимом семейства ретротранепозонов млекопитающих. LINE элементы присущи геномам всех без исключения высших эу кар йот. В геноме человека этот класс представлен тремя семействами LI, L2 и L3, которые занимают до 21% генома человека, из них активные только элементы LI (Lander Е., 2001).

В геноме человека насчитывают приблизительно 520 000 последовательностей элемента L1, из них около 3000 - 5000 копий полноразмерные (Grimaldi С, 1984; Lander Е., 2001) и только 50 из них являются "активными" и способны перемещаться в геноме (Sassaman D., 1997).

Посттрансляционные модификации белков и образование рибонуклеопроїсинового комплекса

Анализ аминокислотной последовательности белков ОРТІ и ОРТ2 предсказывает наличие сайтов для различных посттрансляционных модификаций: фосфорилирование, N - гликозилирование, мєристилирование, амидирование. Однако экспериментальных доказательств процессии га белков к настоящему времени не получено.

Предполагается, что белки ОРТІ и ОРТ2 вместе с РНК элемента образуют рибонуклеиновый комплекс в цитоплазме, который защищает РНК элемента от внутриклеточных РНКаз и доставку всех компонентов в ядро. В пользу этой гипотезы говорят данные по биохимической характеристике белка ОРТІ in vitro. Так при выделении белка ОРТІ из клеток тератокарципомы человека, было обнаружено, что белок образует мультимеры совместно с РНК элемента. Образованный комплекс был устойчив к высоким концентрациям солей и активности рибонуклеаз (Hohjoh Н , 1997). Результаты другого эксперимента свидетельствовали в пользу того, что белок ОРТІ специфично связывает одноцепочечные участки РНК элемента LI (Hohjoh Н., 1997). Однако ОТ активности в этих мультимерах обнаружено не было.

Для успешного завершения транспозиции элемента L1 в геномную ДНК, образовавшийся интермедиа!, состоящий из РНК и белков элемента, должен каким то образом попасть в ядро. Известно, что белки с молекулярной массой более 60 кДа не проникают в ядро за счет пассивной диффузии через ядерные поры (Gorlich D., 1999). Поскольку белок ОРТ! не был обнаружен в ядре (Hohjoh Н., 1996), а белок ОРТ2 имеет молекулярную массу около 150 кДа, следовательно, доставка обратной транскриптазы и РНК матрицы к геномной ДНК должна осуществляться за счет активного транспорта через ядерные поры с затратами энергии, либо во время растворения ядерной мембраны во время митоза или мейоза. В ряде экспериментов на культуре клеток было показано, что С концевая область белка р40 содержит ряд консервативных аминокислот важных для транспозиционной активности элемента LI (Moran J., 1996), С помощью этого метода было показано цис-активное функционирование элемента L1 в процессе своей реинтеграции в геном (Moran J., 1996, 1999, Goodier J., 2000, Wei W.,2001).

Известно несколько механизмов доставки белков в ядро В классическом способе импорт белков обеспечивается специальными белками - импортинами (так же называемыми кариоферинами), которые узнают специфические аминокислотные последовательности (nuclear localization signals, NLS, или сигналами ядерной локализации) (Gorlich D., 1999, Nakielny S., 1999). Однако, ни анализ аминокислотной последовательности белков обеих рамок па присутствие NLS-подобных последовательностей, ни экспериментальные данные, не подтверждают использование описанного механизма для доставки РНК и белков элемента в ядро.

Другими способами доставки в ядро может быть связывание с белками элемента других белков уже содержащих NILS, либо наличие неких специфических последовательностей в РНК элемента (Osteitag К, 2001). Так же, можно сделать предположение, что для доставки своих белков и РНК в ядро элемент I...1 образует рибонуклеопротеиновы и комплекс, подобный вирусным частицам, который проникает в ядро, либо через бреши в ядерной мембране, либо при ее растворение во время митоза или мейоза.

Элементы L1, по - видимому, транскрибируются и интегрируют в геном за счет сопряженных процессов обратной транскрипции и интеграции, механизма, который получил название обратная транскрипция праймированная сайтом-мишенью (ОТПС). Первоначально ОТПС была показана для элемента R2, сайт-специфический, LTR - несодержащий ретротраиспозон, обнаруженный у артропод (Luan D., 1993). Ретротранспозоны R2 имеют одну ОРТ, кодирующую эндонуклеазу рее фикции типа II и активность ОТ. В изящном эксперименте т vii.ro, используя бактериально экспрессированный белок R2, было показано, что эндонуклеазный домен этого белка расщепляет некодирующую цепь в последовательности rena28S РНК в определенном месте (мишени). Образовавшийся 3 - ОН разрыв ДНК используется доменом ОТ белка R2 в качестве праймера, а РНК элемента R2 - в качестве матрицы для построения кДНК элемента. После завершения обратной транскрипции РНК происходит расщепление кодирующей цепи и интеграция. В результате образуется точная дупликация исходного сайта - мишени, которая фланкирует вновь встроенный элемент (Luan D., 1993). Предполагается, что элемент Ы генома человека также использует механизм ОТПС для обратной транскрипции и интеграции. В пользу этой гипотезы говорят следующие данные: в геноме элементы LI обычно фланкированы точными дупликациями сайтов-мишеней размером 7-20 и.о., обычным следствием реакции ОТПС; состав нуклеотидов в предсказанном сайте расщепления обычно обогащен Т, которые комплиментарны З -концевой пол и А последовательности элемента L1; вероятность образования нары: праймер-матрица возрастает; и наконец, в последних экспериментах in vitro, полноразмерный белок ОПТ2 элемента L1 слитый на С-конце с TST осуществлял ограниченное количество реакций О ГПС (Cost С, 2002). Модель ОТПС для элемента L1 предсказывает, что в процессе инициации обратной транскрипции белок ОРТ2 взаимодействует с полиА-хвостом РНК элемента Ы, но следует подчеркнуть, что прямых экспериментальных доказательств этой модели до сих пор нет.

Клонирование и экспрессия ОРТІ и фрагмента ОРТ 2 элемента Г1 lis в клетках ii.colt

Белок OP іI экспрессировали в составе гибридного белка с глютатион-S-трансферазой (TST). ОРТІ элемента LI Hs размером I т.п.о. амплифицировали в ПЦР в присутствии олигонуклеотидных праймеров: А1 (5 - CGTACCATGGGGAAAAAACAGAACAGAAAAAC -3 ) и А2 (5 TAGTCGACTATGATGTTAGCTGGrI"GATTTTGC -У); и клонировали в вектор pGEX-KG (Guan. К., 1991), по сайтам Nco I и Sal I, так чтобы ОРТ I была в рамке с геном Г ST. Рекомбинантная плазмида, pGEX-p40, кодировала гибридный белок TST - р40 с молекулярной массой 68 кДа. Фрагмент полипептида ОРТ2 с 426 по 558 а.о. сливали с 1ST. В этом случае 0,4 т.п.о. фрагмент ОРТ2 был встроен в вектор pGEX-KG по сайгам ХЬа I и Hind 111. Рекомбинантная плазмида, pGEX-hRT1, кодировала гибридный белок PST- liRT с молекулярной массой 42,6 кДа. Рекомбинантными плазм идам и трансформировали клетки ІІ. сої і J Ml 09, высевали на. LB-arap чашки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и оставляли расти на ночь при 37С. Препаративное наращивание, индукцию и хранение рекомбинантных штаммов проводили согласно протоколам фирмы Amersham.

Все операции но очистке белка были выполнены при 4 С. Клетки рекомбинантных штаммов из 20 мл культуры лизировади в 500 мкл буфера ТЭД, содержащего 1 мМ PMS.F, 0.1 мг/мл лизоцима, и обрабатывали ультразвуком (3 процедуры по 15 сек) на дезинтеграторе Branson (Branson Sonic Power)/ MSE 150 WT (Англия), Неразрушенные клетки и мембраны удаляли центрифугированием (10000 g/мин, 5 мин.).

Для очистки гибридных белков с FST доменом, полученный экстракт клеток li.coli, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (-18 С) вместе с 40 мкл глутатион-сефарозы 4В (Pharmacia), уравновешенной ФСБ/1% Triton Х-100/ 10 тМ ДТТ. После центрифугирования при 500g в течении 5 секунд супернаган і удаляли и сорбент со связанным гибридным белком промывали ФСБ/1% Triton-Х-100/ 10 тМ ДТТ. Промывку повторяли дважды буфером для элюции 50 мМ Грие-HCI, рН 8.0. Смолой со связавшимся гибридным белком наполняли колонку (1x8 см) и проводили элюцию гибридного белка с FST доменом 10 мМ глютатионом 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0. Белковые фракции собирали и анализировали элекфофоезом в SDS-ІІААГе.

Очищенные таким образом гибридные белки TST-p40 и rST-liRT были использованы для получения поликлональных сывороток. Афипно-очищенный гибридные белки TST-p40 и rST-liRT" использовали для получения соответствующих поликлональных мышиных антител. Мышам линии BALBc подкожно вводили 50 мкт очищенного антигена совместно с полным адъювантом Фрейнда в 6 точек каждые 2 недели. Через 8 недель после первой иммунизации собирали сыворотку и проверяли наличие специфических антител иммуноблоттингом.

ОРТ2 элемента L1 клонировали под промотор полиэдрииа в вектор pFastBacI ("Gibco") по сайтам Sail и Sad из плазмиды pSM42 (любезно предоставленной Prof. Н.Н. Kazazian), обработанной предварительно теми же рестриктазами. В результате получали рекомбинантную плазмиду pBac-hRT, которую использовали для конструирования рекомбинантного бакуловируса при помощи транспозон-зависимой интеграции, подробно описанной в протоколах Gibco (Luckow, 1993). Рекомбинантной плазмидой pBac-hRT, несущей ген устойчивости к гентамицину, трансформировали компетентные клетки И.coil штамма DHlOBac, содержащие бакмиду (ДНК бакуловируса), несущую ген устойчивости к канамицину, и плазмиду-помощник, несущую ген устойчивости к тетрациклину. После теплового шока клетки инкубировали в среде LB без антибиотика в течение 4 часов при 37 С при постоянном помешивании 100-150 об/мин. Проводили селекцию клопов, несущих рекомбинантную бакмиду, в условиях blew/white теста на агаризованной среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина. 10 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл X-gal и 40 мкг/мл ИПТГ, и инкубировали при 37 С 24 часа. Из рекомбинантных клонов выделяли бакмидную ДНК, которую анализировали при помощи ПЦР па присутствие последовательности ОРТ2 элемента L1.

Оптимумы ДПК-полимеразной активности обратной транскриптазы элемента LIA/.v

Максимально высокое включение меченного [ H]dГІР в полимерную форму на гомогенной матрице поли(гА)-олиго(аТ) рекомбинантой обратной транскриптазой Ll#.v наблюдалось в следующих условиях: 100 мМ NaCl, 50 мМ K.CL 10 мМ DTT, при рН 8.0. Нарис. 8 представлены данные влияния температуры на проявление РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности. Установлено, что полимеразная активность фермента при 30С и при 48С ниже в 2 и в 3 раза, соответственно, чем при 37С, в то время как при 42С полимеразная активность уменьшается незначительно. Температурным оптимумом аісгивности рекомбинантнои обратной транскриптазы элемента L\Hs является 37С. Зависимость ОТ активности белка ОРТ2 LIA/.v от концентрации ионов Мп и ионов My представлена на рис. 9. Максимальное включение меченного [TTJdTTP на матрице іюли(гА)-олиго(с1Т) в присутствии ионов Мп2+ наблюдалось в узком диапазоне концентраций этого катиона 0,3 - 0,6 мМ МпСІг, повышение концентрации катиона до 1мМ и выше сильно ингибировало ДНК-полимеразную активность фермента (рис 9А). Сравнивая влияние обоих катионов, обнаружено, что в присутствии ионов Mg + каталитическая активность фермента выше в -3 раза, чем в присутствии ионов Mni+. Присутствие двухвалентных катионов в реакционной смеси требуется для пол и меразной активности большинства ДНК-полимераз и обратных транскриптаз, изученных к настоящему времени (Skalka, 1993; Taube, 1998; Perach, 1999). Рис. 9Б иллюстрирует РНК-зависимую ДНК-пол им еразиую активность фермента в широком диапазоне концентраций ионов Mg" . Данные по влиянию двухвалентных катионов на ОТ активность исследуемою фермента позволяют сделать вывод о том, что обратная транскриптаза L\Hs является Mg-зависимой ДНК - полимеразой. Изучена каталитическая активность фермента на разных субстратах, перечисленных в табл. 2. В стандартных условиях инкубации максимальное включение радиоактивномеченного [TTJdTTP в полимерную форму на матрице поли(гА)-олиго(о!Т) и составляло 388 единиц на мкг белка, тогда как поли(гС)-олиго(с10)2.1}( - 67 единиц. На матрице ДНК-типа поли[с!(А-Т)] активность фермента составила меньше 6 % от активности на поли(тА)-олиго(сіТ). Кроме того, ОТ активность на гетерогенных матрицах РНК- и ДНК-типа не превышала значений, полученных на поли[с1(А-Т)] (табл. 2). Сделан вывод, что обратная транскриптаза рсфотранеиозона L!//,v проявляет как РНК - зависимую, так и ДНК - зависимую ДНК -полимеразные активности.

Высокая ОТ активность на матрице поли(гА)-олиго((іТ), по-видимому, связана с высокой аффинное і ью фермента к такому типу матриц. По-видимому, такое сродство является основной причиной накопления копий элемента LI//.Y в АТ-богатых областях геномной ДНК в процессе эволюции. Процесс синтеза ДНК состоит из трех этапов: инициации, элонгации и терминации синтеза. Инициация синтеза белком ОРТ2 рстротранспозона LI H.s\ называемая обратной транскрипцией, праймированной сайтом-мишенью (Luan, 1993), была описана ранее (Cost, 2002). Принимая во внимание, что белок ОРТ2 LIHs является РНК-зависимой ДНК-пол имеразой, важно подчеркнуть актуальность изучения синтеза ДНК на РНК-матрице. В настоящей работе мы исследовали способность ОТ Ll/Ул элоптировать цепь ДНК на. гетерогенной матрице Ll/Y.v РНК и ДНК типа. Для изучения синтеза ДНК белком ОРТ2 элемента LI //л были подготовлены два типа субстратов \Atis: фрагмент РНК размером 450 н. с отожженным на У -конце с олигоиуклеотидом (21 н), и одноцеиочечный фрагмент ДНК 415 н. с отожженным на У - конце с олигоиуклеотидом (25 н). Реакцию элонгации вели к условиях, описанных в материалах и методах. Продукты ДНК-полимеризации анализировали высокоразрешающим электрофорезом із денатурирующих условиях. Из экспериментальных данных (рис. 10) синтеза ДНК видно, что продукт полимеризации на РНК-матрице имел длину 450 н. и соответствовал размеру исходной матрицы. При синтезе ДНК на ДНК-матрице размер продукта полимеризации ОТ 1.1 Hs также совпадал с размером исходной матрицы и составил 415 нуклсотидов. Полученные результаты подтверждают, что обратная транскриптаза ретротранспозома L\Hs может эффективно использовать в качестве субстрата не только РНК, но и ДНК. Кроме того, данные синтеза ДНК белком ОРТ2 \AHs хорошо иллюстрируют особенности процесса полимеризации на РНК-матрице. Как видно нарис. 10 при построении ДНК накапливаются промежуточные продукты полимеризации. Известно, что процесс обратной іранскрилции может обрываться в определенных местах РНК-матрицы, что, по-видимому, связано с диссоциацией комплекса фермент-субстрат. Такие места, остановки на матрице при синтезе ДНК называют пауз и игом и описаны для всех изученных к настоящему времени ОТ (Williams, 1990; Isel, 1997; Avidan, 1998, 2002, Harrison, 1998; Taube, 1998; Werner, 1999). Сравнение последовательности РНК-матрицы и мест остановки синтеза ДНК показало, что ОТ lAHs делает «паузы» в GC-богатом участке РНК матрицы. Продолжение полимеризации ДНК происходит в результате реинициации этою процесса. «Паузы» синтеза можно объяснить относительно низким сродством фермента к GC-носледовагельностям, приводящим к диссоциации комплекса фермент-матрица. По-видимому, это свойство белка ОРТ2 LI/7.V является одной из причин высокого содержания укороченных и неактивных копий элемента L1/-/.V в геноме человека.

Похожие диссертации на Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека