Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Получение и свойства теломеризованных клеток человека Караченцев Дмитрий Николаевич

Получение и свойства теломеризованных клеток человека
<
Получение и свойства теломеризованных клеток человека Получение и свойства теломеризованных клеток человека Получение и свойства теломеризованных клеток человека Получение и свойства теломеризованных клеток человека Получение и свойства теломеризованных клеток человека
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Караченцев Дмитрий Николаевич. Получение и свойства теломеризованных клеток человека : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03, 03.00.25.- Москва, 2002.- 145 с.: ил. РГБ ОД, 61 03-3/319-8

Содержание к диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1. Структура и функции телом ер 10

  1. Теломерная ДНК 10

  2. Белки связывающиеся с теломерной ДНК 13

  3. ДНК-белковые комплексы высшего порядка 14

  4. Тел ом еры и механизмы контролирующие повреждения в ДНК 15

  5. Гетерохроматиновые свойства теломерных регионов 15

  6. Особенности наиболее дистальной части теломерной ДНК 16

2. Фермент теломераза 18

  1. Теломераза является РНК зависимой ДНК полимеразой 18

  2. Структура РНК компонента теломеразы 19

  3. Каталитическая субъединица теломеразы является обратной транскриптазой 21

  4. Механизм работы теломеразы 23

  5. Потенциальные дополнительные компоненты теломеразы 25

  6. Организация гена каталитической субъединицы теломеразы 27

3. Функции теломеразы в клетке 29

  1. Концевая недорепликация хромосом 29

  2. Регуляция активности теломеразы в клетке 31

  3. Роль репрессии теломеразы в соматических клетках 33

  4. Теломеры и старение 35

  5. Теломераза и онкогенез 37

  6. Нетеломеразное удлинение теломер 3 8

4. Увеличение пролиферативного потенциала клеток путем введения гена hTERT 39

  1. Введение теломеразы в клетки млекопитающих 39

  2. Клетки с введенным геном теломеразы не проявляют свойств

характерных для раковых клеток 43

  1. Введение теломеразы в различные типы клеток 46

  2. Перспективы применения теломеризованных клеток 53 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культура клеток 58

1.1. Получение первичных культур фибробластов человека 58

  1. Получение первичных культур миобластов человека 58

  2. Ведение клеточных культур 59

  3. Индукция миогенной дифференцировки 60

  4. Определение пролиферативного потенциала и скорости роста

культуры клеток 60

1.6. Замораживание клеточных культур 61

2. Введение гена каталитической субъединицы теломеразы в клетки человека 61

  1. Генетические конструкции 61

  2. Приготовление ДНК для введения в клетки человека 63

  3. Трансфекция ДНК путем электропорации 63

  4. Трансфекция ДНК с помощью липофекции 64

  5. Селекция клонов и клональный рост 64

3. Измерение активности теломеразы в клеточных экстрактах 65

  1. Получение клеточных экстрактов 65

  2. Измерение теломеразной активности 66

  3. Определение концентрации белка в экстрактах 66

  4. Вычисление теломеразной активности 67

4. Измерение длины теломер в клетках 67

  1. Выделение и очистка геномной ДНК 67

  2. Расщепление ДНК и гельэлектрофорез фрагментов 68

  3. Перенос ДНК на мембрану по Саузерну 69

  4. Гибридизация ДНК 69

5. Изучение кариотипов 70

  1. Приготовление хромосомных препаратов из митотических клеток человека 70

  2. Окрашивание хромосом, G- banding 71

6. Исследование сохранения нормальных механизмов регуляции клеточного цикла 71

  1. Радиоавтография и подсчет митотических индексов 71

  2. Индукция состояния покоя без сыворотки и в высокой

клеточной плотности 72

  1. Индукция клеточного старения путем блокирования функции теломеразы 73

  2. Окраска на SA-галактозидазу 73 РЕЗУЛЬТАТЫ 75

  1. Введение гена hTERT в культивируемые клетки человека 75

  2. Изучение теломеразной активности полученных клонов фибробластов человека 77

  3. Изучение пролиферативного потенциала клеток после введения гена hTERT 80

  1. Исследование сохранения нормальных механизмов регуляции клеточного цикла 85

  2. Изучение длины теломер в иммортализованных с помощью теломеразы клетках человека 91

  3. Изучение стабильности генома теломеризованных фибробластов человека 93

  4. Изучение иммортализующих свойств экспрессии теломеразы

на миобластах человека 94

  1. Изучение телом еразн ой активности культур миобластов человека после трансфекции гена hTERT 97

  2. Изучение пролиферативного потенциала миобластов человека после введения гена hTERT 98

10. Исследование способности теломеризованных миобластов образовывать мышечные
волокна 99

11. Изучение клеток, иммортализованных на поздних пассажах плазмидой pRS 100
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 103

1. Индукция теломеразной активности в клетках человека

путем экспрессии hTERT 106

2. Длина теломер и пролиферативный потенциал клеток человека после

введения гена каталитического компонента теломеразы 107

3. Сохранение нормальных механизмов регуляции пролиферации

в теломеризованных клетках 111

  1. Искусственное старение в культурах теломеризованных фибробластов после блокирование функции теломеразы 115

  2. Стабильность генома теломеризованных фибробластов человека 117

6. Свойства теломеризованных миобластов человека 118
ВЫВОДЫ 122
БЛАГОДАРНОСТИ 123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АЗТ ПП ПСЧ СПС

т.п.н.

Теломеризация

у.п.

цзк этс

DMEM

ELISA

FISH

НМЕС

hnRNP

HPV16

hTERT

MPSV

NHEJ

PALA

RT-PCR

SA-гал

SCID мыши

SV-40 T TART; HeT-A TBP T-loop TRAP

UTR UV-B


З '-ази до-3'- дезокситими дин.

Пролиферативный Потенциал.

Пуповинная сыворотка человека

Синдром преждевременного старения

Тысячи пар нуклеотидов.

Теломеразная Активность.

Введение гена hTERT

Телячая сыворотка

Удвоения Популяции (клеток).

Циклинзависимые киназы.

Эмбриональная телячья сыворотка

Эмбриональные фибробласты человека.

Альтернативные механизмы удлинения теломер.

Цитомегаловирус.

Среда Игла, модифицированная Дульбекко.

Эндотелиальные клетки.

Метод иммунодетекции (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Мутантний фенотип с короткими теломерами у дрожжей.

Флюоресцентная гибридизация in situ.

Гемагглютинин.

Клетки эпителия аденоидов человека.

Кератиноциты крайней плоти человека.

Клетки эпителия молочной железы человека.

Гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины.

Папилломавирус человека 16 типа.

Каталитический компонент теломеразы человека.

РНК компонент теломеразы человека.

Гидроксимочевина.

Длинный концевой повтор (Long Terminal Repeat).

Мышечная дистрофия Дюшена.

Вирус миелопролиферативной саркомы.

Негомологичная рекомбинация с объединением концов.

ІЧ-фосфоноацетил-І^-аспартат.

Фосфатно-солевой буфер.

Обратная транскриптаза.

Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция.

Связанная со старением р-галактозидаза.

Мыши страдающие суровым иммунодефицитом (Severe

Combined ImmunoDeficiency mice).

Большой T антиген вируса SV-40.

Ретротранспозоны связанные с теломерами у Drosophila.

Белок связывающийся с теломерами.

Теломерная петля.

Метод измерения теломеразной активности (Telomeric Repeat

Amplification Protocol).

Нетранслируемая область РНК (Untranslated Region).

Ультрафиолетовое излучение типа В.

Введение к работе

Как и всякое научное открытие, иммортализация клеток человека в результате введения гена каталитического компонента теломеразы породило больше новых вопросов, чем смогло дать ответов на уже поставленные вопросы. Однако эти данные окончательно подтвердили теорию концевой недорепликации - механизма, ограничивающего число делений, отведенных клетке, предложенную Алексеем Оловниковым в 1971г (Оловников, 1971).

Репликативное старение клеток является результатом прогрессивного укорачивания ДНК, входящей в состав теломер - ДНК-белковых структур, находящихся на концах линейных хромосом и предохраняющих хромосомы от слияния и деградации. Короткие теломеры, вероятно, служат сигналом повреждения ДНК и запускают процессы клеточного старения. Теломеры укорачиваются из-за того, что синтез ДНК на отстающей цепи не может быть завершен до конца, остаются небольшие недореплицированные участки. Теломераза - это фермент, который экспрессируется в клетках полового ряда и в некоторых других. Теломераза может замедлять или предотвращать укорачивание теломер путем добавления повторов TTAGGG к концам хромосом. В большинстве соматических клеток теломераза либо отсутствует, либо экспрессируются недостаточные уровни фермента, которые не могут обеспечить поддержание теломер, и таким образом, клетки сталкиваются с проблемой прогрессивной потери ДНК.

Наиболее распространенное объяснение причин старения организма базируется на утверждении, что эволюционный отбор должен действовать против расходования ресурсов на построение тела, которое будет выживать далеко за пределы времени, необходимого для размножения и воспитания потомства. Процессы поддержания и репарации требуют большого расхода пластических и энергетических ресурсов, поэтому уровень вложений должен быть "рассчитан" на среднюю продолжительность жизни для данного вида. За многие тысячелетия, люди выработали оптимальную продолжительность жизни вида 35-40 лет, необходимую для успешной репродукции (Kirkwood, 1988). Репаративные стратегии организма человека рассчитаны на эту продолжительность жизни, характерную для людей каменного века, они позволяют поддерживать относительно здоровое тело, эффективно выживать до возраста, необходимого для размножения и воспитания потомства, но не за эти пределы.

В течение последнего столетия, человечество значительно улучшило условия своей жизни, разработка вакцин и антибиотиков позволила полностью искоренить многие болезни. Улучшение санитарного состояния и условий жизни, успехи в медицинском обеспечении позволили многим индивидуумам сильно превысить возраст, в котором большинство наших предков погибали. Значительное дополнительное увеличение продолжительности жизни, в настоящее время ограничивается физиологическими причинами, неэффективностью работы различных клеточных процессов, которые не предназначены для столь долгой жизни.

Репликативное старение может рассматриваться как механизм защиты от опухолей. Требуется накопление нескольких мутаций, чтобы опухолевые клетки могли стать злокачественными (Vogelstein and Kinzler, 1993). Эпидемиологическая статистика показывает, что для развития опухоли необходимо от трех до семи мутационных событий. Первоначальные измененные клетки, вероятно, должны поделиться как минимум 20 раз, чтоб достичь размера популяции, достаточного для того, чтобы иметь приемлемый шанс приобрести следующую мутацию. Таким образом, для развития опухоли, клетки должны поделиться 60-140 раз. Если репликативное старение ограничивает число допустимых делений, тогда большинство предраковых клеток остановят пролиферацию после накопления одной - двух мутаций и не смогут достичь опасных для здоровья стадий опухолеобразования. Необходимость обойти это ограничение, обычно путем реактивации теломеразы для поддержания длины теломер, объясняет, почему в 85% опухолевых клеток имеется теломеразная активность (Kim et al., 1994). Укорачивание теломер, вероятно, эволюционировало как противоопухолевый механизм, вносящий вклад в значительное увеличение противораковой защиты в крупных долгоживущих организмах.

Наилучшей защитой от рака было бы наложение сильного ограничения на число клеточных делений, но клетки должны иметь достаточный репликативный потенциал для обеспечения нормального роста, поддержания и репарации тканей. В рамках модели старения организма, эволюция должна отбирать оптимальное число делений, необходимое для поддержания роста, клеточного обновления и репарации повреждений в пределах возраста характерного для вида, но не более того. Поскольку в настоящее время люди живут намного дольше людей каменного века, мы можем рассчитывать увидеть некоторые болезни или расстройства здоровья, в которых репликативное старение ограничивает эффективность клеточного обмена и вносит вклад в ухудшение физиологической функции органов и тканей. Пациенты, имеющие недостаточность теломеразы страдают серьезными нарушениями в функции пролиферирующих тканей (Vulliamy et al., 2001). Однако ограничение пролиферативного потенциала клеток путем репликативного старения это не единственный фактор, который вносит вклад в старение организма.

Преимущества противораковой защиты без сомнения имеют и некоторые обратные стороны. В дополнение к ограничению пролиферативной способности, доступной для целей обновления и репарации существуют другие возможные недостатки коротких теломер. Например, триплет GGG представляет собой предпочтительный сайт для оксидативного повреждения (Oikawa and Kawanishi, 1999), и вероятно, длинные теломеры, состоящие на 50% из последовательности триплетов GGG могут служить в качестве буфера, поглощающего оксидативные удары.

В настоящее время, все еще, остается не вполне ясным, как старение клеток in vitro связано со старением in vivo, в какой степени старение организма обусловлено ограниченностью пролиферативного потенциала входящих в его состав клеток. Медицинские приложения введения гена каталитической субъединицы теломеразы (теломеризации) весьма заманчивы, однако неизвестно все ли типы клеток можно иммортализовать введением теломеразы. Настораживает также тот факт, что подавляющее большинство опухолей человека обладают теломеразной активностью (Kim et al, 1994). Как соотносится иммортализация при помощи теломеразы с трансформацией клеток, являются ли клетки с введенной теломеразой раковыми или является ли теломеризация ступенькой на пути раковой прогрессии?

В данной работе мы не ставили целью ответить на все вопросы, связанные с эффектами теломеризации, но мы попытались прояснить некоторые аспекты, касающиеся сохранения нормальных механизмов регуляции клеточного цикла и старения в иммортализованых теломеразой фибробластах человека, и показали, что введения одной теломеразы не достаточно для иммортализации миобластов человека.

Вероятно, клеточно-заместительные технологии найдут широкое применение в медицине будущего. В процессе старения происходит гибель клеток организма, которая не может быть восполнена регенерацией. Со временем потеря клеток приводит к ослаблению функций органов и тканей, уменьшению их надежности, развитию болезней, связанных со старением и в итоге к гибели организма. Помимо собственно старения, любые болезни и травмы приводят к потерям клеток. Существуют и специфические болезни, выражающиеся в прогрессивной потере клеток. Клеточно-заместительные технологии могут оказаться необходимыми для генной терапии. Скорее всего, операции по "лечению больных генов" будут производиться вне тела пациента с последующем введением клеток в организм.

Для обеспечения клеточно-заместительных технологий необходимо иметь возможность размножать клетки конкретного пациента в достаточной мере вне организма. Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека является возможным решением проблемы неограниченного размножения клеток. В 1998 г. впервые было показано, что введение гена каталитического компонента теломеразы способно иммортализовать клетки человека (Bodnar et al., 1998; Vaziri and Benchimol, 1998). Исследователи не наблюдали никаких побочных действий такой иммортализации (Jiang et al., 1999; Morales et al., 1999). Позже, однако, появились данные о некоторых долговременных неблагоприятных последствиях введения гена hTERT (Wang et al., 2000; Farwell et al., 2000), кроме того, оказалось, что не все клетки человека становятся бессмертными при введении гена hTERT.

Учитывая большое значение подобных экспериментов для медицины и фундаментальных исследований, мы решили самостоятельно изучить эффекты иммортализации клеток путем введения гена каталитического компонента теломеразы.

Похожие диссертации на Получение и свойства теломеризованных клеток человека