Введение к работе
Актуальность проблемы
Среди известных на сегодняшний день генетических систем одной из наиболее динамичных, вне всякого сомнения, является система митохондрий. В процессе эволюции эукариотической клетки с огромной скоростью происходили и продолжают происходить глубочайшие перестройки аппарата воспроизведения и реализации генетической информации органелл. В контексте постоянного диалога с ядерным геномом митохондрии потеряли свою автономию вследствие переноса практически всех белок-кодирующих генов в ядро. В то же время значительная часть генов РНК (несмотря на явно «пробелковый» характер эволюции митохондриальных метаболических систем) и генов, кодирующих белки электрон-транспортной цепи, сохранена в митохондриальном геноме. Сосуществование двух относительно независимых генетических систем, контролирующих метаболизм митохондрий, привело к возникновению весьма сложных механизмов взаимодействия.
К таким механизмам в первую очередь относится импорт кодируемых ядерным геномом макромолекул в органеллы. Направленное перемещение белков из цитозоля в митохондрии, очевидно, является одним из наиболее древних приобретений эукариотической клетки. Осуществляемое благодаря работе высоко консервативного белкового аппрата, оно было тщательно исследовано и в настоящее время описано в деталях. Вместе с тем, значительно позже и, очевидно, независимо в разных систематических группах митохондрии начали терять также отдельные гены РНК, что усилило их интеграцию в эукариотическую систему клетки-хозяина. Потеря своих РНК (и, по крайней мере, в одном случае, описанном у дрожжей, развитие нового адаптивного механизма) привела к необходимости выработать специальный механизм для их импорта из цитозоля. У протистов, растений, грибов и животных самые разнообразные белковые системы были использованы для осуществления этой задачи. Отличающиеся в первую очередь поразительной непохожестью друг на друга, системы импорта РНК в разных таксонах оказались весьма сложными для исследования. Не является исключением и человеческая клетка, в которой был показан митохондриальный импорт нескольких РНК, важнейшей из которых явлется 5S рРНК.
Впервые обнаруженная в митохондриях быка, цитозольная 5S рРНК оказалась едва ли не самым высоко представленным в органеллах видом рибонуклеиновой кислоты. Присутствие её в матриксе выглядело несколько неожиданным, т.к. было принято считать, что гены 5S рРНК бесследно исчезли из митохондриальных геномов животных и грибов, а её функцию взяли на себя новые белки, столь характерные для миторибосом. Вместе с тем, недавний цикл работ, направленных на выявление функции этой маленькой, но, как оказалось, весьма
важной молекулы, показал, что 5S рРНК, являясь одной из наиболее консервативных макромолекул в рибосоме, выполняет роль «администратора», ответственного за координацию работы функциональных сайтов рибосомной машины. С уверенностью можно сказать, что без этого высшего регуляторного центра последовательное, чёткое и закономерное осуществление реакций элонгации является невозможным. Каким же образом эукариотические клетки решали проблему исчезновения 5S рРНК из митохондриального генома? Один из способов, как это уже отмечалось выше, состоит в замещении 5S рРНК новыми рибосомными белками, формирующими центральный протуберанец большой субчастицы (трипаносоматиды, дрожжи). Однако очевидное существование пути импорта цитозольной 5S рРНК в митохондрии позвоночных, как и ряд других косвенных данных, заставляет нас предположить, что в последнем случае может иметь место прямая замена утраченной 5S рРНК на её эукариотический ортолог. Исследованию механизма импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека, его регуляции и функциональной роли транспортируемой молекулы в органеллах посвящена настоящая работа.
Цель исследования.
Целью настоящей работы было исследование механизма импорта и возможной функции 5S рРНК в митохондриях клеток человека и создание рекомбинантных форм 5S рРНК, способных служить митохондриальными векторами.
Основные задачи исследования:
1. Выявить структурные элементы 5S рРНК, служащие сигналами её митохондриальной
локализации (детерминанты импорта).
2. Идентифицировать белковые факторы, необходимые для проникновения 5S рРНК в
митохондрии (факторы импорта).
3. Исследовать роль каждого фактора импорта в процессе транспорта 5S рРНК в
митохондрии.
4. Проверить гипотезу об участии импортируемой 5S рРНК в митохондриальной
трансляции.
5. Сконструировать на основе 5S рРНК векторные молекулы, способные переносить
гетерологичные последовательности РНК в матрикс человеческих митохондрий in vivo.
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате выполнения данной работы детально охарактеризован механизм импорта 5S рРНК в митохондрии человеческих клеток. Систематическое исследование эффективности импорта мутантных версий 5S рРНК позволило выявить существование двух сигналов митохондриальной локализации, один из которых расположен в проксимальной части спирали I, а другой - в спирали IV и петле D. Эти структурные элементы соответствуют сайтам связывания с двумя факторами импорта: митохондриальным рибосомным белком L18 (MRP-L18) и митохондриальным ферментом роданезой. Оба белка работают в молекулярном конвейере, обеспечивая эффективный «захват» молекул 5S рРНК и направление их в митохондрии. Создана минимальная in vitro система импорта 5S рРНК в человеческие митохондрии, составленная из очищенных компонентов. Охарактеризовано взаимодействие факторов импорта с молекулой РНК. Впервые продемонстрированы РНК-связывающие свойства роданезы, а также необычный шаперонный эффект, который 5S рРНК способна оказывать на денатурированный или синтезируемый на рибосоме фермент. Показано, что MRP-L18, ранее фактически не охарактеризованный представитель семейства самых консервативных 5S рРНК-связывающих белков, способен взаимодействовать с 5S рРНК прокариотического типа, но, очевидно, приобрёл также в процессе эволюции способность формировать неклассический комплекс с эукариотической 5S рРНК. Этот результат позволил нам предположить, что комплекс 5S pPHK/MRP-L18 является основной формой существования 5S рРНК в митохондриях. Выделение и изучение митохондриальных рибосом из печени крысы впервые подтвердило присутствие в их составе цитозольной 5S рРНК. Исследования in vivo, в которых подавлялась экспрессия роданезы или MRP-L18, показали, что при уменьшении импорта 5S рРНК в митохондрии наблюдается пропорциональное снижение уровня митохондриальной трансляции. Таким образом, участие импортируемой 5S рРНК как компонента миторибосомы в реакциях митохондриальной трансляции более не вызывает сомнений.
Раскрытие механизма импорта 5S рРНК позволило нам сконструировать высокоэффективную векторную систему, обеспечивающую доставку гетерологичных РНК-последовательностей в органеллы in vivo. Использование этой системы открывает широчайшие возможности как для генетических манипуляций над митохондриями, так и для терапии многочисленных заболеваний, связанных с мутациями в митохондриальном геноме.
Апробация работы
Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались или были представлены в виде стендовых сообщений на следующих международных конференциях: конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2007), XVIII Менделеевский конгресс по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Конгресс «Meetochondrie» (Франция, 2008, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы
исследования», «Результаты исследования» и «Обсуждение результатов исследования».
Работа завершается выводами и списком цитируемой литературы ссылок. Работу
иллюстрируют рисунков, таблицы и приложения. Общий объём диссертации страниц.
