Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЩКЛИЗУВДК РНКаз 8
1.1. Субстратная специфичность ферментов 8
1.2. Механизм каталитического действия циклизующих РНКаз 12
1.3. Субстратная специфичность РНКазы А в реакции с низкомолекулярными и высокомолекулярными субстратами 17
1.4. Структура комплексов РНКазы А с нуклеотидами 22
1.5. Механизм реализации специфичности РНКазы А 29
1.6. Молекулярные аспекты субстратной специфичности гуани ловых РНКаз 35
1.7. Узнавание нуклеотндов неспецифическими РНКазами 42
1.8. Заключение <,., 43
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
2.1. Спектральные методы 46
2.2 Измерение констант связывания методом дифференциальной УФ-спекгроскопии 48
2.3. Спектрофотометрические измерения 52
2.4. Измерения скорости гидролиза нуклеозид-циклофосфатов с помощью рН-стата 53
2.5. Измерение скоростей неферментативного гидролиза нуклеозид-2 ,3 -циклофосфатов
2.6. Математическая обработка кинетических данных 55
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА III. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ НЕСПЩИФИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ ИЗ ГРИБА PEITICILLIUM BREVICOM- PACTUM ..'...' 57
ГЛАВА ІV. ТОПОХИМИЧЕСКИЕ АСПЖТЫ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ РИБОНУКЛЕАЗЫ PMIGILLIUM BREVICOMPACTUM 80
4.1. Субстратная специфичность РНКазы P.brevicompactum 80
4.2. Сопоставление механизмов реализации специфичности РНКазы P.brevicompactum
и РНКазы А 92
ВЫВОДЫ 108
ЛИТЕРАТУРА III
- Субстратная специфичность ферментов
- Измерение констант связывания методом дифференциальной УФ-спекгроскопии
- ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ НЕСПЩИФИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ ИЗ ГРИБА PEITICILLIUM BREVICOM- PACTUM
- Субстратная специфичность РНКазы P.brevicompactum
Субстратная специфичность ферментов
Ферменты играют чрезвычайно важную роль в биологических системах, катализируя с высокой эффективностью практически все химические реакции, которые протекают в клетке. При этом каждый фермент,в отличие от химических катализаторов, обладает способностью эффективно катализировать превращения только одного типа субстратов. Для обозначения этого важного свойства ферментов и было введено понятие субстратной специфичности.
В применении к биологическим системам специфичность означает по существу способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких, конкурирующих за активный центр. Очевидно,что понятие "специфичность" носит относительный характер. Судить о том, насколько специфичен фермент к данному субстрату, мы можем только сравнивая скорость превращения данного субстрата со скоростью превращения другого субстрата этого же фермента, выбранную за некоторую произвольную точку отсчета. В биологических системах такая ситуация сравнения реализуется непрерывно, когда несколько субстратов конкурируют за активный центр фермента. Пусть система состоит из одного фермента и двух субстратов А и В
Измерение констант связывания методом дифференциальной УФ-спекгроскопии
При добавлении к раствору РНКазы P.brevicompactum 3 -AMP и з -CMP оказывалось, что УФ-спектр нуклеотида с белком отличается от суммы спектров исходных компонентов, то есть наблюдался дифференциальный УФ спектр. Мы использовали дифференциальные УФ спектры для того, чтобы определить константы связывания з -АМР и з -СМР с РНКазой. Для этого была измерена зависимость разностного поглощения от концентрации нуклеотида при постоянной концентрации белка. Схема опыта состояла в следующем: в тандемные кюветы ("Helma", США) вносили в одно отделение I мл трис-ацетат-ного буфера, а в другое отделение - I мл раствора фермента в том же буфере (рН = 5,7, I = 0,2). После термостатирования в течение 3-5 минут (t = 25С) прописывали нулевую линию. Затем в то отделение кюветы сравнения, где находился буфер, добавляли 10-20 мкл исходного раствора нуклеотида. Такой же объем исходного раствора нуклеотида добавляли в то отделение кюветы с образцами, где находится фермент. Чтобы скомпенсировать разведение раствора фермента, возникающее при добавлении к нему раствора нуклеотида, в кювету сравнения добавляли такой же объем буфера (10-20 мкл) в то отделение, где находился фермент. Затем прописывали возникающий в результате взаимодействия нуклеотида с белком дифференциальный спектр. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока не наблюдалось прекращение увеличения разностного поглощения (AD) в дифференциальном спектре, т.е. пока белок не насыщался нуклеоти-дом.
С целью изучения механизма действия неспецифической РНКазы мы определили ионогенные группы фермента, участвующие в, реакции трансэтерификации фосфодиэфирной связи и гидролиза циклофосфатов. Для этого была изучена в.соответствующих реакциях зависимость параметров kKQT и Км от рН. В качестве субстратов при исследовании стадии образования циклофосфатов использовались динуклеозидмоно-фосфаты UpA, СрА и АрС, а для изучения стадии гидролиза циклофосфатов - игй-г з -Р и Cyd-2 ,3 -P. Такой выбор нескольких субстратов с пуриновими и пирнмидиновыми нуклеозидами на з - и 5 -концах фосфодиэфирной связи, позволял определить, фиксируется ли фос-фодиэфирный фрагмент динуклеозидмонофосфатов с основаниями различной природы в одном и том же локусе активного центра, или.место его фиксации зависит от природы нуклеозидов на его концах.Кроме того, указанный набор субстратов давал возможность выявить , влияние ионизации оснований на кинетические параметры ферментативной реакции.
.Измерения ь и Kj были выполнены в диапазоне рН от 3,5 до 7,5. Наименьшее значение рН определялось устойчивостью РНКазы к денатурации. Наибольшее значение использованных рН лимитировалось уменьшением скорости реакции.
Известно, что зависимость отношения / от рН отражает ионизацию групп свободного фермента, которые принимают участие в образовании комплекса
Субстратная специфичность РНКазы P.brevicompactum
В качестве очередного этапа изучения механизма действия неспецифичной К основаниям субстратов РНКазы ИЗ гриба P.brevicompactum мы ставили задачу: изучить характер взаимодействия фермента с нуклеозндным (нетрансформируемым) фрагментом субстрата - ну-клеозид-2 ,3 -циклофосфата, поскольку именно это.взаимодействие проявляется в субстратном специфичности фермента.
Для решения поставленной задачи мы провели измерения кине-, тических параметров гидролиза мононуклеозиддиклофосфатов пуринового и пиримидинового ряда и их аналогов. В качестве аналогов использовались соединения, у которых по сравнению с природными селективно элиминированы некоторые гетероатоми основания, что позволило широко варьировать сродство соответствующих субстратов к ферменту (Схема I).
Из рис. 15 видно, что в логарифмическом масштабе константы скорости гидролиза нуклеозидциклофосфатов и константы Михаэлиса в пиримидиновой и пуриновой серии связаны линейными соотношениями.
