Содержание к диссертации
Введение
1. Cигнальные пути фактора некроза опухоли (tnf-a) и его общие биологические свойства 8
1.1. Общие биологические свойства фактора некроза опухоли TNF-a 9
1.2. Активация транскрипционного фактора NF-кВ TNF-a 17
1.3. Образование вспомогательного комплекса при проведении сигнала рецептором TNF-R1 28
1.4. Липидные микродомены клеточной мембраны как функциональные модуляторы сигнальных путей семейства рецепторов TNF-a 32
1.5. Участие различных протеаз в сигнальных каскадах, индуцируемых TNF-a. 36
2. Результаты и обсуждение 40
2.1. Исследование дифференцирующей активности гексапептида TGENHR, L-глутаминовой кислоты и TNF-a на клетках линии IIL-60 41
2.2. Гексапептид TGENHR и L-глутаминовая кислота повышают TNF-опосредуемую активацию фосфолипазы С 45
2.3. Гексапептид TGENHR и L-Glu усиливают TNF-опосредованную экспрессию эндогенного фактора некроза опухоли 48
2.4. Влияние пептида TGENHR, L-глутаминовой кислоты и TNF-a на цикл клеточного деления 51
2.5. Исследование влияние гексапептида TGENHR и L-глутаминовой кислоты на TNF-индуцированную гибель HL-60 клеток 54
2.6. Исследование влияния TGENHR и L-Glu на TNF-индуцируемую активацию транскрипционного фактора NF-кВ 57
2.7. Влияние TGENIIR и L-Glu на TNF- опосредуемую активацию каспазы-3 и касиазы -8 60
2.8. Гексапептид TGENHR отменяет церамид-индуцированный апоптоз 63
2.9. Заключение 66
3. Экспериментальная часть 67
3.1 Материалы 68
3.2. Буферные растворы 69
3.3. Методы 70
3.3.1. Культивирование клеток 70
3.3.2. Определение дифференцирующей активности 70
3.3.3. Определение внутриклеточной концентрации ииозитолмоно- и дифосфатов в клетках линии HL-60 70
3.3.4. Приготовление агарозного геля 71
3.3.5. Выделение суммарной РНК 71
3.3.6. Получение кДНК из клеток 72
3.3.7. Полуколичественная конкурентная ПЦР 72
3.3.8. Обратной транскрипции ПЦР (RT-PCR) 74
3.3.9. Гель-электрофорез 75
3.3.10. Выделение продуктов ПЦР из геля 75
3.3.11. Определение уровня клеточной гибели 76
3.3.12. Определение апоптоза в клетках цитофлуориметрическим методом 76
3.3.13. Определение активности клеточных каспаз -8, -3 76
3.3.14. SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле 77
3.3.15. Иммуиоблот-анализ 77
3.3.16. Анализ цикла клеточного деления 78
3.3.17. Анализ экспрессии маркеров дифференцировки CD14 и CD16 79
Выводы 80
- Активация транскрипционного фактора NF-кВ TNF-a
- Липидные микродомены клеточной мембраны как функциональные модуляторы сигнальных путей семейства рецепторов TNF-a
- Исследование влияние гексапептида TGENHR и L-глутаминовой кислоты на TNF-индуцированную гибель HL-60 клеток
- Гель-электрофорез
Введение к работе
Апоптоз является естественным физиологическим процессом, необходимым как для развития, так и для поддержания тканевого гомеостаза, эмбриогенеза и функционирования различных дифференцированных клеток. Восприимчивость клеток миелоидного ряда к цитотоксическим агентам зависит от степени их дифференцированности. При этом до сих пор остается невыясненной точная взаимосвязь между клеточной дифференцировкой и апоптозом из-за того, что механизмы, контролирующие эти процессы, отчасти, используют схожие метаболические пути. В связи с этим, выяснение механизмов, регулирующих развитие апоптоза в опухолевых недифференцированных и нормальных дифференцированных клетках, является одним из ключевых аспектов при лечении больных различными формами лейкоза. Известно, что в процессе клеточной дифференцировки клетки миелоидного ряда становятся устойчивыми к действию целого ряда индукторов апоптоза. Так было показано, что обработка клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза такими известными индукторами дифференцировки, как форболовые эфиры, полпостыо-трапс-ретпносъая кислота, витамин D3 или диметилсульфоксид приводит к развитию резистентности клеток к различным апоптотическим стимулам, в том числе и к цитотоксичному действию фактора некроза опухоли альфа TNF-a [1-4].
TNF-a - многофункциональный цитокин, принадлежащий к семейству TNF-лигапдов, секретируется многими типами клеток. TNF-a является физиологическим индуктором таких процессов, как гибель клеток в результате апоптоза или некроза, клеточная дифференцировка, гемопоэз, а также участвует в регуляции и реализации иммунных и воспалительных реакций. Многообразие биологических свойств TNF-a опосредованно двумя высокоаффинными рецепторами TNF-R1 и TNF-R2, принадлежащих к большому семейству рецепторов TNF-лигандов (TNF-Rs) [5]. В подавляющем большинстве клеток TNF-R1 является ключевым медиатором в передаче сигналов, опосредованных TNF-a; TNF-R2, по всей вероятности, выполняет важную роль в функционировании лимфоидной системы. На молекулярном уровне выделяют три основных эффекта, определяющие пути реализации разнообразных клеточных ответов, обусловленных взаимодействием TNF-a с TNF-Rs: а) активация транскрипционного фактора NF-KB; б) активация стресс-активируемых (SARKs/JNK); в) индукция апоптоза. При действии TNF-a инициация процесса апоптоза осуществляется двумя путями - прямым рецепторным и митохондриальным [5].
Терапевтическое применение TNF-a в качестве противоопухолевого агента осложнено из-за его общей высокой токсичности, связанной с широким спектром биологических активностей этого цитокина. Поэтому одним из подходов к использованию этого цитокина для лечения злокачественных новообразований является поиск агентов, которые снижали бы его токсическое действие, но позволяли бы сохранить его противоопухолевую активность. В последние годы активно разрабатываются терапевтические методы на основе комбинаторного применения этого цитокина с различными индукторами дифференцировки либо химического (полностью-транс-ретиноеъйя кислота, диметилсульфоксид, форболовые эфиры), либо биологического происхождения (ростовые факторы GM-CSF и G-CSF, интерферон), что способствует усилению дифференцирующего эффекта на опухолевые клетки при снижении токсического действия TNF-a на организм. Такими соединениями могут оказаться гексапептид TGENHR и L-глутамиповая кислота, являющиеся индукторами гранулоцитарной дифференцировки клеток миелоидного ряда. У
Гексапептид TGENHR (HLDF-6) является фрагментом эндогенного фактора дифференцировки клеток линий HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), который полностью воспроизводит дифференцирующую активность полноразмерного фактора. Установлено, что в основе механизма действия HLDF-6 на клетки HL-60, не имеющего собственного рецептора на поверхности клеток, лежит его способность взаимодействовать с липидным компонентом клеточных мембран [6]. В ходе исследований было установлено, что наряду с дифференцирующей активностью, гексапептид обладает ярко выраженными протекторными свойствами. HLDF-6 предохраняет от дегенерации клетки Пуркинье червя мозжечка крыс in vivo и гранулярные нейроны мозжечка крыс in vitro при индуцируемой химической гипоксии [7]. Кроме того, гексапептид повышает устойчивость клеток HL-60 и мышиных эмбрионов к холодовому шоку и ионизирующей радиации [8]. Было также продемонстрировано нейропротекторное действие этого пептида на моделях болезни Альцгеймера in vivo и in vitro [9]. Была продемонстрирована важная роль L-глутаминовой кислоты в составе этого пептида, замена, которой приводила к исчезновению биологической активности HLDF-6 [6]. Кроме того, было обнаружено, что свободная L-Glu, как и пептид, проявляет антипролиферативное и дифференцирующее действие па клетки HL-60, при отсутствии специфического рецептора на мембране клеток этой линии [10] Существуют данные, что многие из этих процессов дегенерации клеток потенцируются фактором некроза опухоли (TNF-a) [И].
Данная работа является частью структурно-функциональных исследований проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по изучению биологически активного шестичленного фрагмента эндогенного фактора дифференцировки HLDF клеток линий HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека TGENHR (HLDF-6). Целью работы являлось сравнительное изучение влияния гексапептида TGENHR (HLDF-6) и L-глутаминовой кислоты на процессы дифференцировки и апоптоза, вызываемые действием TNF-a на клетках линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека. В рамках этой работы были поставлены следующие задачи: 1) выяснение характерных особенностей дифференцирующего действия гексапептида HLDF-6, L-Glu и TNF-a; 2) исследование влияния гексапептида HLDF-6 и L-Glu на клеточную гибель, вызываемую действием TNF-a; 3) изучение молекулярного механизма действия HLDF-6 и I-Glu на TNF-опосредованную клеточной гибель.
Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, кандидату химических наук И.А. Костанян и заведующему лабораторией белков гормональной регуляции, члену-корреспонденту РАН В.М. Липкину за постоянное внимание к данной работе и помощь в ее проведении. Автор также признателен кандидату химических наук С.В. Хайдукову (ИБХ РАН) за помощь в проведении цитофлуориметрического анализа и кандидату химических наук Л.Н. Шингаровой за предоставленный фактор некроза опухоли (TNF-a).
Активация транскрипционного фактора NF-кВ TNF-a
Активация фактора транскрипции NF-кВ (nuclear factor kappa В) происходит под действием факторов различной природы: воспалительных цитокинов, таких как TNF-a и IL-1; ксенобиотиков; продуктов бактериального происхождения и некоторых формах физиологического стресса (ультрафиолет, активные формы кислорода) [55]. NF-кВ контролирует экспрессию многих генов, действие которых направлено на повышение устойчивости клеток к стрессовым воздействиям, на подавление апоптоза и регуляцию процессов клеточного иммунитета, опосредованных рецепторами TNF-a NF-кВ образует группу димерных транскрипционных факторов, относящуюся к семейству NF-KB/Rel белков. У млекопитающих известны, пять изоформ NF-KB/Rel: NF-кВ 1/р50 и NF-KB/p52, активная форма которых образуется в результате протеолиза их предшественников р105 и рЮО соответственно; c-Rel, RelA/p65 и RelB [56]. Наиболее распространенная изоформа NF-кВ состоит из субьединицы Rel (синонимы: Rel А и р65) и р50. Белки этого семейства в своей структуре содержат консервативный гомологичный домен Rel (RIID), способствующий димеризации, ДНК-связыванию, ядерной локализации и взаимодействию с членами семейства I-кВ протеинов - природных ингибиторов NF-KB/Rel [56]. В состав семейства I-кВ белков, характеризующихся наличием шести или семи анкириновых повторов, входят І-кВа, І-кВр\ І-кВу, І-кВє, I-кВ, Вс1-3, р105 и рЮО. В С-концевой части предшественников NF-кВ 1/р50 и NF-KB/p52, р105 и р100, помимо содержащихся в N-конце домена RHD, находятся семь добавочных повторов анкирина. В структуру N-концевой части 1-кВа, I-кВР и І-кВє также входит регуляторный домен, осуществляющий деградацию этих белков при различных стимулах [56]. В неактивной форме клеточные ингибиторы I-кВ связаны с димерами NF-KB, маскируя их участок ядерной локализации, и что способствует сохранению такого трехкомпонентного комплекса в цитоплазме. TNF-a, как и множество других индукторов, стимулирует протеолитическую деградацию I-кВ и высвобождение NF-кВ из неактивного комплекса I-KB-NF-KB, и последующей транслокации последнего в ядро, где происходит активация транскрипции NF-кВ-регулируемых генов [57]. Следует отметить, что для полной активации NF-KB необходима его модификация посредством фосфорилирования. Некоторые киназы, такие как митоген-активируемые МАР-киназы (mitogen activated protein kinases), некоторые изоформы нротеинкипазы С (РКС) принимают участие во вторичной модификации NF-KB.
Различные сигнальные пути, ведущие к индукции деградации ингибитора 1-кВ начинаются с активации многокомпонентного протеинкиназного комплекса IKK киназ (I-кВ kinase complex). Этот активный IKK-комплекс способен фосфорилировать регуляторный домен ингибитора I-кВ, тем самым, способствуя его узнаванию убиквитин-лигазному комплексу (SKPl-Cullin-Fboxtype ЕЗ). Киназный комплекс IKK является многокомпонентной структурой, в состав которой входит гетеротример из киназ IKK1 и IKK2 (ІККа и ІКК (3) и регуляторпой киназы ЖКу (NEMO, Fip-3, ІККАР) [58-65], а также гомодимер, характеризующийся наличием либо белка теплового шока Hsp90 (heat shock protein-90) либо двумя или тремя молекулами протеина cdc37, ассоциированного с Hsp90 (Hsp90-asscociated cdc37 protein) [66]. При стимуляции клеток с дефицитом по ІККу различными индукторами наблюдалось значительное снижение активности фактора транскрипции NF-KB, подтверждая существенное значение этого некаталитического компонента для IKK-комплекса [67-69]. Анализ ІККа7" и IKKp" " мышиных эмбриональных фибробластов показал, что обе эти киназы нужны для осуществления их функций и по-разному способствуют TNF-индуцированной активации NF-кВ. Так у ЖКР -мышей при действии TNF-a резко уменьшался уровень І-кВ-фосфорилирования, однако наблюдалось остаточное связывание NF-кВ С ДНК, достоверное продуцирование NF-кВ-регулируемых генов, при этом уровень фосфорилирования р65 почти не изменялся [70, 71]. В отличие от этого в двух других работах было показано, что TNF-a не влиял на уровень фосфорилирования I-кВ и ДНК-связывание NF-KB эмбриональных фибробластов мыши, дефицитных по IKKa [72, 73]. Тем не менее, также сообщалось о значительном понижении уровня связывания NF-кВ с ДНК и подавлении транскрипции генов, контролируемых NF-KB [74]. Существуют доказательство, что именно IKKa, но не 1ККр\ участвует во вспомогательном каскаде реакций, приводящих к активации NF-KB2, содействуя процессингу его предшественника рЮО. Интересно, что этот сигнальный путь не зависит от уровня деградации ингибитора 1-кВ [75, 76]. Тем не менее, пока еще остается неясным, насколько этот путь важен для TNF-опосредованного сигнального пути. О существенной роли IKK-комплекса в TNF-индуцированной стимуляции NF-KB может служить свидетельство, что все эффекты этого ответа полностью отменены у 1ККа/ЧКК3"/ эмбриональных фибробластов мыши [77]. На это также указывают недавно идентифицированные киназы TBK/T2K/NAK и ІКХє, родственные ІКК, которые не могут выполнять функции IKKa и ІКК(3 в TNF-сигналыюм пути [78-81]. Начальным этапом TNF-индуцированной активации киназного комплекса IKK является лиганд-зависимая преассоциация TNF-R1 комплекса (рис.1). В норме домен смерти DD внутриклеточной части трансмембранного TNF-R1 связан с белком SODD (silencer of death domain protein), предотвращающим гомоассоциацию DD доменов рецептора и его взаимодействие с какими-либо адаптерными белками [82]. Связывания с лигандом приводит к диссоциации TNF-R1-SODD комплекса и ассоциации доменов смерти TNF-R1.
Этот процесс протекает очень быстро и уже через минуту после добавления TNF-a происходит связывание кластера доменов смерти TNF-R1 с DD доменом адаптерного белка TRADD [83]. Связь TNF-R1RADD служит своеобразной сборочной платформой для дальнейшего соединения с другим адаптерным белком TRAF-2 (TNF receptor-associated factor) и серин-треониновой киназой RIP (receptor-interacting kinase), содержащей также DD-домен [84]. TRAF-2 является членом семейства филогенетически консервативных TRAF белков. Характерной особенностью членов семейства TRAF является наличие гомологичного TRAF домена размером 180 аминокислотных остатков в С-коицевом участке. Посредством белок-белковых взаимодействий с TRAF-доменом регулируется большое количество сигнальных связей, приводящих к активации различных регуляторов, в том числе МАРЗ киназ и членов семейства TNF рецепторов, не содержащих DD-домена в своем составе. Все члены семейства TRAF в N-концевом участке имеют домен RING, структуры, состоящей их пяти или семи равномерно протяженных «цинковых пальцев», кроме TRAF-1 [85]. Ассоциация TRAF-2 с комплексом TNF-R1RADD опосредована взаимодействием С-концевого TRAF-домена с N-концевым DD доменом TRADD [86]. При этом связь RIP и образования комплекса TNF-R1RADD-RIP осуществляется посредством его С-концевого DD домена. RIP также способен взаимодействовать и с TRAF-2 через его N-концевой киназный домен, а также промежуточный домен [84]. Результаты, полученные на эмбриональных мышиных фибробластах с дефицитом по TRAF-2 и RIP, показали, что обе эти молекулы могут активироваться независимо друг от друга в TNF-Rl-сигнальном пути. Более того, было обнаружено, что для формирования киназного ІКК-комплекса в TNF-R1 -сигнальной системе достаточно TRAF-2, тогда как отсутствие R1P приводит к сильному снижению активности этого комплекса [87]. С помощью дрожжевой двухгибридной системы было показано, что RIP способен взаимодействовать с регуляторной киназой ІККу [62,88]. Однако в экспериментах на клетках, дефектных по RIP, стало очевидным, что такая кооперация несущественна для формирования ІКК-комплекса в TNF-R1-сигнальной передачи [87]. Таким образом, упрощенная схема активации транскрипционного фактора NF-KB, индуцированная TNF-a, включает в себя TRAF-2, используемого в качестве ближнего рецепторного адаптера (посредством связывания с TRADD). Далее происходит формирование 1KKNF-R1-сигнального комплекса, что дает возможность RIP индуцировать активацию киназ IKK- комплекса (рис. 1.2). Однако существует несколько независимых доказательств, что взаимодействие TRAF-2, RIP и ІКК-комплекса является более сложным процессом.
Липидные микродомены клеточной мембраны как функциональные модуляторы сигнальных путей семейства рецепторов TNF-a
В состав различных плазматических компартментов входят обогащенные холестерином и сфинголипидами нестабильно-организованные липидные микродомены, называемые «липидными плотами или рафтами» (lipid rafts) из-за их способности оставаться на поверхности неоднородного по плотности градиента при лизисе неионными детергентами [155]. Как было показано, такие участки служат платформами при проведения сигнала от рецепторов BCR, TCR и антигена Fee, сближая эти рецепторы с активирующими киназами, входящими в состав таких микродоменов [156]. Локальное окружение мембраны может оказывать влияние на эффективность проведения сигнала и образование сигнального комплекса рецепторов семейства TNF-a, учитывая, что участие в TNF-сигнальных путях киназ, связанных с мембраной, обнаружено не было. Недавно была продемонстрирована различная роль липидных микродоменов при передачи сигналов рецепторами Fas и TNFR1 (рис. 1.4) После связывания TNF-a с TNFR1 на поверхности клеток линии НТ1080 фибросаркомы человека рецептор траислоцируется в течение 2 мин к липидным микродоменам, где происходит дальнейшее формирование комплекса белками R1P1, TRADD и TRAF2. Было показано, что адаптерные молекулы TRAF2, участвующие в активации транскрипционного фактора NF-кВ, входят в состав таких липидных участков [157]. Нарушение структуры липидных микродоменов агентами, вызывающими истощение холестерина, препятствует фосфорилированию природного ингибитора ІкВа и индукции апоптоза при действии TNF-a, однако эффект определяется типом клеток. Как было показано, в клетках линии U937 индукция апоптоза TNF-a зависела от целостности липидных плотов, хотя на клетках первичной культуры мышиных макрофагов липидные плоты позволяли проводить сигнал через TNFR1 для активации ERK, но не NF-кВ пути [158]. Данные о необходимости целостности липидных компонентов при проведении сигнала в значительной степени противоречивы, что видно на примере изучения Fas-индуцируемого апоптоза [159-161]. Некоторые из этих различий объясняются тем, что в ряде исследований использовались Fas-лиганды, в других анти Fas антитела. Более того, механизм передачи сигнала Fas-лигаида сильно зависит от типа клеток. В клеточных линиях, относящихся к «І-типу», в которых формируется хорошо обнаруживаемый комплекс смерти (DISC), содержащий Fas, FADD и прокаспазу-8, гиперэкспрессия антиапоптотических белков семейства Вс1-2 не блокирует Fas-индуцируемый апоптоз. В клеточных линиях «II типа», где DISC гораздо сложнее детектировать, гиперэкспрессия членов Вс1-2 может ингибировать Fas-опосредованный апоптоз [162].
Недавно была показана корреляция между способом, эффективностью передачи сигнала и сублокализацией Fas-рецептора. Так в клетках первого типа большая часть Fas-R локализована в липидных микродоменах, в клетках второго типа рецептор обнаруживается как в микродоменах, так и в мембране в свободном состоянии на начальной стадии передачи сигнала [163]. Наличие Fas-R в липидных микродоменах клеток первого типа способствует индукции апоптоза даже слабыми бивалентными анти-Fas антителами, что не происходит в клетках второго типа. Снижение уровня холестерина, приводящее к разрушению структуры липидных компонентов, уменьшает эффективность передачи сигнала в клетках 1-типа, но не в клетках II типа. Т.е. липидные микродомены могут регулировать Fas-опосредованную передачу сигнала за счет модуляции предассоциации рецепторов, которая очень важна в Fas- микродоменах не показано, анти- Fas антитела и Fas-лиганд вызывают клеточную гибель при уменьшении содержания холестерина [157]. Таким образом, нарушение липидных микродоменов может уменьшать восприимчивость клеток к Fas-индуцируемому апоптозу и к тому же повышать чувствительность клеток к TNFR1-опосредованному апоптозу, хотя при этом остается невыясненным, как сигналы преобразуются через эти рецепторы. TNF-R1 осуществляет передачу сигнала к NF-кВ посредством образования рецепторного комплекса I и клеточную гибель через комплекс II, несвязанного напрямую с рецептором (рис. 1.3). Тем не менее, Fas может индуцировать апоптоз посредством комплекса смерти «DISC». Следовательно, различающиеся результаты по влиянию разрушения структуры липидных микродоменов могут отражать функцию таких липидных компонентов для усиления эффективности проведения сигнала в первичных сигнальных комплексах, ассоциированных с рецептором (рис. 1.4). Действительно, разрушение липидных микродоменов приводило к блокированию убиквитинизации адаптерных белков RIP1 и TRADD в TNF-R1-сигнальном комплексе и предотвращало формирование NF-кВ-комплекса [157]. 1.5. Участие различных протеаз в сигнальных каскадах, индуцируемых TNF-a Рецепторы TNF-a участвуют во многих клеточных процессах, но главным образом их связывают с индукцией клеточной гибели [165]. Их также называют рецепторами смерти из-за способности инициировать разрушительные реакции в клетках, приводящие к программированному самоуничтожению клетки [166]. Ключевую роль в индукции апоптоза в большинстве типов клеток играют эндопептидазы, относящиеся к семейству цистеиновых протеаз, насчитывающему около 14 различных ферментативных форм. Эти протеазы содержат консервативные последовательности участков связывания и катализа субстрата и расщепляют свои субстраты по связи Asp-X, и вследствие чего получили название каспаз (caspases, cysteinyl aspartate-specific proteinases). Белки-предшественники каспаз - прокаспазы-обычно активируются путем их протеолиза или образования димерных/олигомерных форм.
В присутствии АТР и цитохрома с прокаспаза-9 взаимодействует с адаптериым белком Apaf-1, что приводит к ее активации и инициации последующего каскада биохимических реакций с участием каспазы-3,-6, и 7 [167]. При олигомеризации TNF-R1 или Fas рецепторов происходит активация каспазы-8, а также каспазы-10, которые через DED-домен связаны с белком FADD. При этом индукция олигомеризации каспазы-8 или -9 приводит к их аутоактивации и развитию апоптоза. [168]. Активация касназы-2 связана с действием адаптерного белка RAIDD [169]. Активация эффекторных прокаспаз-3,-6,-7 осуществляется посредством частичного протеолиза, олигомеризации и дальнейшей аутоактивации, при участии инициаторных каспаз-2,-8,-9,-10, находящихся вверху апоптотического сигнального пути [167]. Каспаза-1 индуцирует превращение предшественника провоспалительного цитокина интерлекина-1р в зрелую форму, таким образом, как и каспаза-11, участвующие также в процессинге цитокинов. К настоящему времени функции каспаз-4,-5,-12,-13,-14 мало изучены. Однако неоспоримые доказательства о важной роли каспаз в TNF-опосредовашюй апоптотической, но не некротической гибели клеток показаны в экспериментах с использованием белков-блокаторов вирусного происхождения, например белка-серпина СппА вируса оспы (cytokine response modifier А), способного подавлять апоптоз посредством блокирования активности каспазы-8 и каспазы-1 [170-174]. Применение небольших пептидных соединений, имеющих альдегидную (-cho) или карбонильную группу (-fmk, -cmk), являющихся псевдосубстратами каспаз и ингибиторами их активности за счет конкурирования за их клеточные субстраты, таких как zVAD-FMK, помогло выяснить роль членов семейства каспаз в индукции лиганд-зависимого апоптоза [175]. Однако результаты дальнейших исследований показали несоответствие требующейся специфичности таких фармакологических блокаторов их реальному действию при использовании в концентрационном диапазоне в подобных экспериментах. Поэтому роль некоторых членов семейства протеаз остается до конца невыясненной. Эксперименты с трансгенными мышами показали, что при отсутствии каспаз-1,-2,-3,-9 индукция апоптоза TNF-a неэффективна.
Исследование влияние гексапептида TGENHR и L-глутаминовой кислоты на TNF-индуцированную гибель HL-60 клеток
Протекторное действие гексапептида HLDF-6 и L-глутаминовой кислоты на TNF-индуцированную цитотоксичность дополнительно проверялось еще двумя независимыми методами - окрашиванием клеток трипановым синим и цитопроточной флуориметрией (двойным окрашиванием клеток FITC-меченным аннексином V и пропидиум йодидом). В первом случае клетки инкубировали с исследуемыми индукторами в течение 4, 24 и 72 ч. Обработка клеток TNF-a приводила к значительному увеличению числа погибших клеток в течение 24 и 72 ч, гексапептид и I-Glu не оказывали влияния на процесс гибели клеток (рис 2.7. а, б). Однако, в присутствии как HLDF-6, так и Z-Glu наблюдалось увеличение устойчивости клеток к цитотоксическому действию TNF-a Эти данные были подтверждены цитофлуориметрическим анализом клеток HL-60 после 24 ч инкубации (табл. 2.2). Было установлено, что TNF-a повышает количество анексин-У(+) и Р1(+) клеток, т.е. клеток, в которых произошла индукция апоптоза, в то время как, ни гексапептид, ни L-Glu индукторами апоптоза не являются. Одновременная стимуляция клеток TNF-a либо гексапептидом, либо L-Glu приводила к снижению количества апоптотических клеток практически до контрольного уровня. Следовательно, дифференцирующее действие как HLDF-6, так L-глутаминовой кислоты способствует снижению восприимчивости HL-60 клеток к цитотоксичному действию TNF-a. Молекулярный механизм развития резистентности клеток к цитотоксичному действию TNF-oc еще не достаточно изучен в отличие от детально охарактеризованного процесса гибели, вызываемого этим цитокином. После связывания с TNF-oc передача сигнала рецептором TNF-R1 приводит к образованию двух пространственно независимых молекулярных комплексов [137]. Взаимодействие TNF-oc с рецептором в течение первых нескольких минут ведет к формированию «комплекса I», содержащего рецептор и адапторные белки RIP1 (Receptor-Interacting Protein), TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor) и TRADD (TNF-R1-Associated Death Domain Protein). Такой комплекс преобразует сигналы, ведущие к активации транскрипционного фактора NF-кВ и/или стресс-активируемых протеинкиназ (SARKs/JNK) [138]. На более позднем этапе проведения сигнала после стимуляции происходит диссоциация «комплекса I», и формируется «комплекс II» (DISC или «комплекс смерти»), в состав которого входит также адапторный белок FADD (Fas-Associated Death Domain Protein) и прокаспаза-8. «Комплекс I» выполняет регуляторную роль за счет активации NF-KB, контролирующего экспрессию антиапоптотических генов, тем самым, определяя возможность «комплекса И» индуцировать апоптоз[137].
Наиболее простым кажется предположение о том, что гексапептид и аминокислота каким-то образом регулируют синтез рецепторов TNF-R1 и TNF-R2, тем самым, блокируя передачу цитотоксичного сигнала в клетке. Однако анализ экспрессии рецепторов TNF-a показал, что при инкубации клеток HL-60 с TNF-a, либо с TNF-a и гексапептидом HLDF-6, либо с TNF-a и L-Glu уровень мРНК рецепторов значительно не менялся, что было установлено нами методом полуколичественной конкурентной ГЩР (данные не представлены). Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение влияния TNF-a, HLDF-6 и I-Glu на активацию NF-кВ, так как одной из причин возникновения резистентности клеток к действию многих индукторов апоптоза является изменение уровня активности транскрипционного фактора NF-KB. Каскад реакций, приводящих к индукции NF-кВ, включает фосфорилирование регуляторного комплекса киназ, который, в свою очередь, фосфорилирует белок ІкВ - ингибитор транскрипционного фактора NF-кВ. Это приводит к высвобождению и транслокации в ядро активных субъединиц NF-кВ - RelA/p65 и RelB/p68. Транскрипционная активность фактора NF-кВ коррелирует со степенью фосфорилирования RelA/p65 по остатку серина 536 [225]. Активацию NF-KB оценивали по увеличению уровня фосфорилирования регуляторного комплекса киназ (ІКК) и транскрипционно-активной субъединицы RelA/p65 методом иммуноблот-анализа. Антитела к GAPDH использовали для оценки количества суммарного белка. Обработка клеток в течение 30 мин и 1 ч TNF-a приводила к значительному повышению уровня фосфорилирования комплекса киназ ІКК, в ходе дальнейшей инкубации уровень фосфорилирования снижался до контрольного (рис. 2.8.). Присутствие пептида не оказывало заметного влияния на TNF-индуцируемый процесс фосфорилирования комплекса киназ. Аналогичные результаты были получены при оценке степени фосфорилирования субъединицы RelA/p65. В присутствии Z,-Glu процесс фосфорилирования IKK и RelA/p65, индуцируемый TNF-a, полностью блокировался (рис. 2.8.). Следует отметить, что уровень экспрессии белков комплекса киназ и RelA/p65 в ходе инкубации не изменялся. При обработке клеток только пептидом, либо только глутаминовой кислотой уровень фосфорилирования IKK и RelA/p65 был сопоставим с контрольным (данные не представлены). Следовательно, механизм протекторного действия гексапептида HLDF-6 не связан с его влиянием на активность NF-кВ, ТО есть в присутствии пептида сохраняется проведение TNF-опосредованного сигнала посредством «комплекса I», которое блокируется в случае І-глутаминовой кислоты. 2.7. Влияние TGENHR и L-Glu на TNF- опосредуемую активацию каспазы-3 и каспазы -8 Для изучения влияния гексапептида и L-глутаминовой кислоты на проведение TNF-апоптотического сигнала посредством «комплекса II», было исследовано участие этих индукторов в активации инициаторной каспазы-8, а также ключевой эффекторной каспазы-3 колориметрическим анализом. Обработка клеток TNF-a в течение суток приводила к значительному повышению активности как каспазы-3 (рис. 2.9. а, б), так и каспазы 8 (рис. 2.9. в, г). В присутствии пептида, который сам по себе не влиял на активность этих ферментов, TNF-индуцируемая активация каспазы-3 существенно снижалась (рис. 2.9. а), тогда как уровень активации каспазы-8 был достоверно выше по сравнению с действием TNF-a (рис. 2.9. в). Активация каспаз не наблюдалась как при совместной обработке клеток TNF-a и L-Glu, так и действии одной L-Glu (рис. 2.9. б, г). Помимо прямого рецепторного пути посредством «комплекса II» и каспазы-8, TNF-индуцируемая активация эффекторной каспазы-3 происходит также через митохондриальный путь апоптоза вследствие деполяризации митохопдриалыюй мембраны и освобождения цитохрома С, формирующего апоптосому с Apaf-І и прокаспазой-9, которая приводит в активное состояние каспазу-9, активирующую, в свою очередь, каспазу-3 [226]. Учитывая, что при одновременной стимуляции TNF-a и HLDF-6 происходило повышение активности каспазы-8 и снижение активности каспазы-3 по сравнению с действием одного цитокина, вероятно, что в присутствии гексапептида блокируется проведение апоптотического сигнала на одном из этапов митоходриального пути.
Гель-электрофорез
Выделение продуктов ПЦР из геля производили с помощью набора для экстракции ДНК из агарозного геля "QIAEX II Gel Extraction Kit". К вырезанному и взвешенному фрагменту геля, содержащий ДНК, добавляли буфер QX1 (рН 7.5) из расчета 300 мкл буфера QX1 на каждые 100 мг агарозного геля. К полученной суспензии добавляли 30 мкл силиконовых абсорбирующие частиц QIAEX П. Для солюбилизашш агарозы и связывания ДНК с силиконовыми частицами полученную смесь инкубировали при 50С 10 мин с перемешиванием через каждые 2 мин. После инкубации смесь центрифугировали при 14000xg 30 с и удаляли супернатант. Для удаления остаточных следов агарозы к полученному осадку добавляли 500 мкл буфера QX1 и центрифугировали при 14000xg 30 сек, после чего удаляли супернатант. Для удаления солей осадок промывали два раза 500 мкл буфера РЕ, смесь центрифугировали 14000xg 30 сек. Для элюции ДНК высушенный осадок ресуспендировали в 20 мкл деионизованной воды, инкубировали при комнатной температуре 5 мин, далее центрифугировали при 14000xg 30 сек. Полученный супернатант переносили в чистую пластиковую пробирку на 1.5 мл. Для увеличения выхода ДНК шаг элюции повторяли дважды. Выделенный фрагмент ДНК хранили при температуре -20С. 3.3.11. Уровень клеточной гибели определяли методом окрашивания трипановым синим. Клетки HL-60 (5х106) инкубировали с исследуемыми индукторами 4, 24 и 72ч. После инкубации аликвоты клеточной суспензии окрашивали трипановым синим. Клеточную гибель оценивали по разнице числа окрашенных клеток в опытном образце и контроле, и выражали в процентах. Контролем служили клетки, инкубируемые с PBS. Проведено не менее трех независимых экспериментов в трех повторах. 3.3.12. Апоптоз в клетках регистрировали цитофлуориметрическим методом с помощью набора «Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit» («PharMingen», США) на проточном цитофлуориметре FC 500 («Beckman», США). Клетки инкубировали в течение 24 ч в присутствии исследуемых регентов, затем промывали холодным PBS и окрашивали FITC-меченным аннексином V, и пропидиум йодидом в соответствии с инструкцией производителя. Контролем служили клетки, инкубируемые с PBS.
Было проанализировано не менее 10 000 клеток. Было проведено не менее трех независимых экспериментов в трех повторах 3.3.13. Активность клеточных каспаз -8, -3 оценивали по количеству «-нитроанилина (pNA), появляющегося в результате гидролиза модифицированных субстратов каспазы-3 (Ac-Asp-Glu-Val-Asp-pNA) и каспазы -8 (Ac-Ileu-Gluhr-Asp- pNA) при помощи набора реактивов «Caspase-3,-8 Assay Kit, Colorimetric» (Sigma, США). Клетки HL-60 (5xl06) инкубировали TNF-oc (1мкг/мл); HLDF-6 (10 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ); L-Glu (1 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и L-Glu (1 мкМ) в течение 24 ч. После этого лизировали буфером, содержащим 50 мМ HEPES, рН 7.4,1 мМ дитиотреитол, 0.1 мМ EDTA, 0.1% CHAPS и 0.1% Triton Х-100. К суммарному клеточному лизату ( 400 хЮ3 клеток) добавляли субстраты каспаз до конечной концентрации 200 мкМ, согласно инструкции производителя Объем реакционной смеси составлял 100 мкл. Инкубацию с субстратами проводили в течение 2 ч при 37С. Поглощение я-нитроанилина определяли при 405 нм (Є 10.5 мМ" см" ) на приборе Multiskan МСС/340 (Labsystem, Финляндия). Результаты выражали в процентах, принимая количество, образовавшегося и-нитроанилина в контрольном образце за 100%. Эксперименты проводили не менее 3 раз. 3.3.14. SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили по модифицированному методу Леммли на приборе "Midget 2050" ("LKB", Швеция) в пластинах толщиной 0,75 мм в 15% полиакриламидном геле (концентрирующий гель содержал 7,5% акриламида). Сила тока составляла 7 мА при нахождении лидирующего красителя в концентрирующем геле vi 12 мА в разделяющем геле. После проведения электрофореза гель фиксировали в течение 30 мин, окрашивали раствором Кумасси R-250 в течение 2 ч, после чего удаляли избыточную краску путем 3 последовательных промывок отмывочной смесью по 15-30 мин. 3.3.15. Иммуноблот-анализ. После инкубации в течение 30 мин, 1 и 4 ч клетки (5 106), обработанные исследуемыми веществами, осаждали, промывали холодным PBS и ресуспендировали в лизирующем буфере (0.125 М Трис-HCl, рН 6.8, 4% SDS, 20% глицерин, 0.2 М дитиотреитол, 0.2% бромфенолового синего). Аликвоту клеточного лизата 10 мкл ( 200 хЮ3 кн.), предварительно прогретого при 100С в течение 7 мин, подвергали электрофоретическому разделению в 10% SDS-ПААГ геле с последующим переносом на мембрану из иммобилона Р (Millipore, США).
После инкубации в течение 1 ч в буфере PBS, содержащем 5% обезжиренного сухого молока, мембраны инкубировали с первичными антителами (1:1000) в течение ночи при 4С. После отмывки мембраны в течение 1 ч обрабатывали вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Santa Cruz Biotechnology, США) (1:3000). Степень связывания с антителами оценивали по хемилюминесценции на радиоавтографической пленке с помощью набора реактивов «ECL+Plus detection system» (Amersham Biosciences, США). Антитела к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH) использовали для оценки количества суммарного белка. Использовали следующие первичные поликлональные антитела: антитела к GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, США), антитела к комплексу кииаз 1КК и к фосфорилированной форме этого комплекса (p-ІКК), к субъединице RelA/p65 и фосфорилированной форме (p-RelA /р65) (Cell Signaling Technology, США). 3.3.16. Анализ цикла клеточного деления проводили с помощью цитофлуориметрического метода. После инкубации с исследуемыми веществами в течение 48 ч клетки (9хЮб) осаждали, промывали дважды холодным PBS и фиксировали в 70% этаноле при 4С в течение 30 мин. После этого клетки вновь промывали холодным PBS и ресуспендировали в 500 мкл PBS, содержащем 1 мкг/мл иропидиум иодида и 10 мкг/мл РНКазы A (Sigma, Германия). После инкубации образцов в течение 1 ч при 37С проводили анализ клеточного распределения на проточном цитофлуориметре FC 500 (Beckman, США). Было проанализировано не менее 10 000 клеток. Было проведено не менее трех независимых экспериментов в трех повторах. 3.3.17. Анализ экспрессии маркеров дифференцировки CD14 и CD16 проводили с помощью цитофлуориметрического метода на проточном цитофлуориметре FC 500 (Beckman, США). После инкубации с исследуемыми веществами в течение 72 ч клетки (9x106) осаждали, промывали дважды холодным PBS и инкубировали с фикоэретрин-меченными антителами к CD14 и CD16 (Beckman Counter Immunotech, Франция) при 25С в течение 30 мин. Для контроля неспецифического связывания использовали фикоэретрин-меченные антитела IgG (Beckman Counter Immunotech, Франция). Было проанализировано не менее 10 000 клеток. Было проведено не менее трех независимых экспериментов в трех повторах.
