Введение к работе
Актуальность темы
На сегодняшний день около трети населения инфицировано микобактериями туберкулеза. Особенно опасными являются микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). МЛУ штаммы, устойчивы как минимум к изониазиду и рифампицину. Каждый год во всем мире МЛУ формами туберкулеза заболевают около 400 тыс. лиц.
При неправильном лечении больных МЛУ-формами противотуберкулезными препаратами второй линии у пациентов могут быть отселектированы штаммы М. tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). Такие штаммы устойчивы не только к рифампицину и изониазиду, но и ко всем фторхинолонам и, как минимум, к одному из трех инъекционных препаратов второй линии (капреомицину, канамицину или амикацину). В развитых странах с наилучшими на сегодня системами диагностики и лечения туберкулеза удалось добиться излечения больных ШЛУ-туберкулезом лишь в 30% случаев.
По данным ВОЗ, на конец 2007 года уже в 41 стране были обнаружены ШЛУ штаммы М. tuberculosis. В России эти штаммы также получили распространение. Только в Томской области в течение 2002-2005 гг. было выявлено 30 ШЛУ штаммов среди исследованных 458 МЛУ изолятов (6,6%). Дальнейшее распространение ШЛУ и МЛУ штаммов угрожает возникновением эпидемии туберкулеза, для лечения которого доступных на сегодняшний день лекарственных средств будет недостаточно.
В 2007 г ВОЗ приняла программу борьбы с распространением МЛУ и ШЛУ туберкулеза в мире. Среди важнейших целей программы - усиление и расширение надзора за МЛУ и ШЛУ туберкулезом, и поддержка исследований, направленных на создание новых тест-систем для быстрого выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза. Цели и задачи исследования
Целью данной работы являлось исследование распространенности МЛУ штаммов М. tuberculosis в Новосибирской области.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
-
Оценить возможность определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицшгу с помощью биочипа.
-
Определить доминирующие механизмы возникновения и распространения МЛУ-штаммов.
-
Выявить очаги заболеваемости лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза на территории Новосибирской области.
Научная новизна
Впервые в Новосибирской области при параллельном исследовании лекарственной устойчивости к рифампицину чистых культур микобактерий туберкулеза бактериологическим методом и с помощью биочипа было установлено, что результаты совпадают в 86% случаев.
На примере штаммов, циркулирующих в Новосибирской области, впервые продемонстрирована возможность использования биочипа, определяющего только устойчивость к рифампицину, для выявления МЛУ-изолятов М. tuberculosis.
Показано, что в Новосибирской области доминируют Пекинские штаммы, доля которых составляет не менее 48%.
Впервые комбинацией двух методов генотипирования - IS6110 и MIRU - среди Пекинских штаммов в Новосибирской области выявлены две генетических группы, в которых доминировали МЛУ изоляты (89 и 100% соответственно).
В ходе изучения механизмов возникновения и распространения МЛУ штаммов М. tuberculosis молекулярно-генетическими методами установлено, что устойчивые изоляты селектировались в ходе лечения и к 2001-2003 гг получили значительное распространение среди населения Новосибирской области, где сформировали очаги заболеваемости МЛУ формами туберкулеза.
Практическая значимость
Разработан и запатентован способ регенерации биочипов, позволяющий использовать один биочип до семи раз.
Путем совмещения двух стадий ПЦР в одной пробирке разработан метод определения устойчивости к рифампицину, позволяющий снизить вероятность кросс-контаминации при проведении исследований, значительно удешевить стоимость и резко повысить производительность анализа.
Показано, что положительный результат определения лекарственной устойчивости биочипом может быть использован при принятии решения о выборе противотуберкулезных препаратов, а отрицательный - нет. Если биочипом изолят определяется, как чувствительный, необходимы дополнительные исследования его лекарственной устойчивости. Апробация работы и публикации
Полученные результаты исследований были представлены: на «Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР СП. Карпова» (Томск, Россия, 2003), XIV научной конференции-конкурсе молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск, Россия, 2003), симпозиуме «Интегративная медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, Россия, 2004), Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», (Новосибирск, Россия, 2005), «26th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology», (Istanbul, Turkey, 2005), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, Россия, 2006), III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова (Томск, Россия, 2007).
По материалам диссертации был получен патент № 2270870 от 25.12.2003 «Способ регенерации нуклеотидных биочипов» Болдырев А.Н. Сивков А.Ю. Татьков СИ.
Личный вклад соискателя
Диссертационная работа была выполнена соискателем в 2002-2006 гг. в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках выполнения проектов МНТЦ №2019 и №1980, а также госпрограммы РФ (договор № 03/2512/1).
На разных этапах в работе принимали участие Татьков СИ., Болдырев А.Н., Боднев С.А., Туманов Ю.В., Кузьмичева Г.А., Азаев М.Ш., Смирнова О.Ю., Ивлев-Дунтау А.П., Филипенко М.Л., Рот М.А., Цильковская И., Ильичев А.А. Всем им автор приносит искреннюю благодарность. Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 160 работ: 18 - отечественных авторов и 142 - зарубежных. Работа иллюстрирована 55 рисунками и включает 6 таблиц.
