Содержание к диссертации
Стр.
УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
I. РОЛЬ NF-кВ в клеточных процессах и особенности
СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА (Литературный обзор) 12
1.1. Роль NF-кВ в клеточных процессах 12
-
Семейство NF-кВ 13
-
Роль NF-кВ в иммунном ответе организма и онкогенезе 17
-
Сигнальные пути активации NF-tcB 20
-
Регуляция транскрипционной и ДНК-связывающей активности белка 23
-
Регуляция активности NF-кВ с помощью фосфорилирования сериновых остатков белка 23
-
Окислительно-восстановительная регуляция активности NF-кВ в клетке 24
1.1.5. Специфичность узнавания NF-кВ 26
1.2. Особенности структурной организации NF-кВ и его комплексов с
ДНК 29
-
Структура р50 субъединицы NF-kB 29
-
Структура комплекса р50 субъединицы NF-кВ с ДНК 36
-
Кристаллическая структура комплекса р50 субъединицы NF-кВсДНК 36
-
Исследование конформационных особенностей комплекса р50 субъединицы NF-кВ с ДНК и механизма связывания белка р50 с ДНК в растворе 39
Стр. II. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АСПЕКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ р50 СУБЪЕДИНИЦЫ NF-kB С ДНК-ДУПЛЕКСАМИ В РАСТВОРЕ
(Обсуждение результатов) 47
II.1. Сравнение физико-химических характеристик рекомбинантных
белков p50-GST и p50-His6 49
11.1.1. Исследование конформации белков p50-GST и
p50-His6 в растворе 49
11.1.2. Анализ структуры белков p50-GST и p50-His6
методом кругового дихроизма 57
11.1.3. Изучение влияния пептидных довесков на ДНК-
связывающий центр белков p50-GST и p50-His6 59
Н.2. Структурные аспекты взаимодействия белка р50 NF-kB
с ДНК-дуплексами в растворе 73
-
Структура комплекса белка р50 с ДНК в растворе 73
-
Структура ДНК-связывающего центра белка р50 NF-kB 76 H.2.2.I. Изучение влияния замены аминокислотных
остатков Cys62, Lysl47 и Lys278 на Ala в белке
р50 NF-kB на его структуру 78
-
Изучение влияния замены аминокислотных остатков Cys62, Lysl47 и Lys278 на Ala в белке р50 NF-kB на его комплексообразование с ДНК 84
-
Изучение влияния замены аминокислотных остатков Cys62, Lysl47 и Lys278 на Ala в белке р50 NF-kB на ДНК-связывающий центр белка 86
II.3. ПУТИ ИНГИБИРОВАНИЯ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ
NF-kB В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ 90
Стр.
11.3.1. Модифицированные ДНК-дуплексы как потенциальные
регуляторы активности NF-kB в клетке 90
11.3.2. Ингибирование NF-kB с помощью антиракового препарата -
кобальт-фталоцианинового комплекса 100
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 104
ВЫВОДЫ 119
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Ш
5 *
>
УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
4 ПААГ - полиакриламидный гель
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
GST - глутатион-8-трансфераза
His-Tag- 19-звснная аминокислотная последовательность, содержащая
шесть His
His6 - пептид Ilis-Tag
IIEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
DTT - дитиотреитол
SDS - додецилсульфат натрия
„ NF-kB - ядерный фактор к-легких цепей энхансера иммуноглобулина в В-
клетках
IPTG - изопропил-р-О-тиогалактопиранозид
TNF-a - фактор некроза опухоли a
ІкВ - ингибирующий белок фактора транскрипции NF-kB
IL- интерлейкин
RHR - участок высокой гомологии с онкобелком Rel
л NLS - сигнал ядерного транспорта
NES — сигнал ядерного экспорта
NEMO - необходимый модулятор NF-kB
IKK. - ІкВ киназный комплекс
КД - круговой дихроизм
УФ - ультрафиолет
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
Кд - константа диссоциации
Ig-кВ - кВ-участок узнавания из энхансера гена легких цепей
иммуноглобулина к
Id-кВ - идеализированный палиндромный кВ-участок узнавания
ТЗПГ - тризамещенная пирофосфатная группа
PC А - рентгеноструктурный анализ
ЭДК - 1-этил -3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид
ФДЭ - фосфодиэстераза
ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид
НСТ-116 - клеточная линия карциномы кишки человека
РС-3 - клеточная линия карциномы простаты человека
FBS - эмбриональная телячья сыворотка
ECL - система усиленной хемилюминесценции
TRJTC - тетраметилродаминизотиоцианат
FITC - флуоресцеинизотиоцианат
КЛСМ- конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
Для обозначения нуклеотидных и аминокислотных звеньев, олиго- и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и Международного союза биохимиков (ШВ). Префикс "d" (дезокси) при обозначении олигодезоксирибонуклеотидов и ДНК-дуплексов опущен.
Введение к работе
Одним из наиболее важных и необходимых процессов жизнедеятельности клетки, который обеспечивает начальный этап передачи генетической информации от нуклеиновых кислот к белкам, является транскрипция. Многие биологические процессы регулируются на уровне экспрессии генов. Изучение генетических процессов на молекулярном уровне позволило выявить важнейшую роль белковых факторов в регуляции генной экспрессии на различных ее этапах. Одним из ключевых эукариотических факторов транскрипции является ядерный фактор транскрипции NF-kB. Этот белок впервые был описан в 1986 году как специфический ядерный фактор В-клеток, ответственный за экспрессию гена к-иммуноглобулина [1].
В клетке NF-kB участвует в процессах инициации транскрипции генов, кодирующих различные белки, в том числе сигнальные белки и белки иммунного ответа, поэтому главным следствием участия белка NF-kB в регулировании активности большого числа генов является повышение защитных функций организма.
К настоящему времени известно, что многие вирусы, включая ВИЧ-1, используют NF-kB для транскрипции собственных генов. Кроме того, предпринятые исследования молекулярных механизмов онкогенеза нормальных клеток в опухолевые, мультилекарственной резистентности опухолевых клеток и программируемой клеточной гибели, позволили установить важнейшую роль транскрипционного фактора NF-kB в развитии этих явлений. В опухолевых клетках наблюдается высокий уровень экспрессии NF-kB, который запускает в них целый каскад реакций, ведущих к активации транскрипции онкогенов. В связи с этим в настоящее время уделяется большое внимание поиску эффективных путей модуляции активности NF-kB в опухолевых клетках человека.
8 Создание регуляторов активности фактора транскрипции NF-кВ как нуклеотидной, так и белковой природы представляет собой одно из основных направлений фармакотерапии, поэтому актуальной задачей является изучение тонкой структуры комплекса ДНК-NF-kB в растворе при физиологических условиях.
На сегодняшний день известно около десяти кристаллических структур фактора транскрипции с различными ДНК и РНК-лигандами, а также ингибирующими белками ІкВа и 1кВр\ Для самих белков семейства NF-кВ вне комплекса структуры с высоким разрешением пока не получены. 11а данный момент закристаллизованы только С-концевые димеризационные домены белков р50 и р65 NF-kB [2]. Поскольку кристаллические структуры являются отражением лишь одного из состояний молекулы в растворе и не полностью отражают функциональные особенности белка, их нельзя использовать для прогнозирования точного поведения фактора транскрипции в клетке. Следовательно, важным элементом при исследовании фактора транскрипции NF-кВ является изучение его физико-химических и биологических характеристик в растворе.
Настоящая работа посвящена исследованию структурных особенностей р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ человека, ответственной за связывание с ДІIK, и ее комплексов с ДНК-дуплексам и в растворе.
В данной работе впервые с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния проведено исследование конформации белка р50 NF-кВ в растворе. Метод малоуглового рентгеновского рассеяния позволяет описать форму молекулы на основе модельных вычислений. Основной вклад в кривую рассеяния вносят общие размеры частицы и их форма. Из кривой рассеяния в этой области можно извлечь информацию об электронном радиусе инерции, молекулярном весе, объеме, площади поверхности, гидратации молекулы и ряде других интегральных характеристик объекта. До настоящего времени исследования структурных особенностей белка р50 в растворе практически не проводилось. Были получены лишь некоторые данные о
9 молекулярной массе образующегося в растворе белкового ассоциата и степени гомогенности белка методом равновесной седиментации [3,4], Кристаллическая структура для белка р50 вне комплекса с лигандами еще не получена.
Методом малоуглового рентгеновского рассеяния также впервые изучены конформационные изменения в белке р50, происходящие при его комплексообразовании с ДНК. л Для исследования изменений в геометрии центра связывания белка при введении единичных замен как в структуру ДНК-связывающего центра белка р50, так и в структуру участка узнавания белка в ДНК впервые использован метод региоселективного ковалентного связывания [5,6], разработанный в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Метод региоселективного ковалентного связывания базируется на создании с помощью химического лигирования синтетических ДНК-дуплексов, содержащих в одной из цепей вместо природной м межнуклеотидной фосфатной группы химически активную тризамещенную пирофосфатную фосфатную группу (ТЗПГ). Такие ДНК-дуплексы являются * эффективными фосфорилирующими агентами в водной среде и способны образовывать ковалентную связь с нуклеофильными группами аминокислотных остатков Lys, Туг или His НК-связывающих белков в составе специфического < комплекса НК-белок. Необходимым условием образования ковалентной связи между белком и ДНК является стерическая сближенность реагирующих группировок. Ковалентное связывание белка с серией модифицированных
ДНК-дуплексов, содержащих химически активную группу в одной из позиций участка узнавания, позволило прозондировать ДНК-связывающий центр белка.
В сочетании с методом сайт-направленного мутагенеза белка в работе исследовано влияние замены ряда ключевых аминокислот в белке р50 NF-kB, участвующих во взаимодействии с фосфатными группами ДНК, на центр связывания белка. Кроме того, с помощью набора ДНК-дуплексов, содержащих химически активную группу в различных позициях кВ-участка узнавания белка, проведено сравнение контактов нуклеофильных аминокислотных
10 остатков с фосфатными группами ДНК, реализующихся в составе комплекса белка с ДНК, содержащими участки узнавания из разных генов. Изученная возможность картирования центра связывания белков с помощью метода региоселективного ковалентного связывания может найти применение и для других НК-связывающих белков.
Используемые в работе ТЗПГ-содержащие ДНК-дуплексы могут быть предложены в качестве специфичных ингибиторов NF-кВ благодаря их свойству селективно и необратимо связываться с белком в условиях in vitro. Для анализа специфичности их взаимодействия с NF-кВ в опухолевых клетках в работе проведено ковалентное связывание модифицированных ДНК-дуплексов с клеточным пулом NF-кВ в ядерных и цитоплазматических фракциях лизатов клеток карциномы кишки человека НСТ-116. Показано, что подобные ДНК-реагенты связываются специфично с NF-кВ в лизатах, не затрагивая другие компоненты клетки, что подтверждено иммуноблоттингом с антителами к р50 и р65 субъединицам NF-кВ. Кроме того, сделаны предварительные эксперименты по доставке флуоресцентно-меченного модифицированного ДНК-реагента в опухолевые клетки, и исследована его способность к ковалентному связыванию с NF-кВ в клетке. Методом конфокальной сканирующей микроскопии показано, что такие ДНК-дуплексы проникают через цитоплазмаческую мембрану и локализуются, в основном, по периферии клетки. При воздействии на клетки фактора некроза опухоли а (TNF-а), приводящего к запуску сигнальных путей активации NF-кВ, ДНК мигрирует в ядро, вероятно, в виде комплекса с NF-кВ. Обработка клеток НСТ-116, предварительно инкубированных с родамин-меченным ДНК-реагентом, флуоресцеин-мечеными антителами к р50 субъединице NF-кВ выявила ко-локализацию антител с ДНК-дуплексами. Можно предполагать, что ДНК-дуплексы образуют специфический комплекс с NF-кВ в клетках.
Таким образом, используемые в работе ДНК-реагенты могут служить основой для разработки противоопухолевых препаратов, базирующихся на модуляции активности NF-кВ в клетке, а также в диагностических целях для определения наличия активного NF-кВ в клетке, что позволит выявить онкологические заболевания на ранних этапах.
Кроме того, в работе исследована способность антиракового препарата - фталоцианинового комплекса кобальта - ингибировать ДНК-связывающую активность NF-кВ. Препараты на основе фталоцианинов широко используются 1 в фотодинамической терапии рака благодаря способности избирательно накапливаться в опухолях и вызывать их деструкцию под действием фотоиндуцируемой генерации активных форм кислорода [7]. В работе показано, что кобальт-фталоцианиновый комплекс, содержащий восемь карбоксильных групп по периферии лиганда, конкурентно связывается с участком узнавания NF-кВ в ДНК-дуплексе, препятствуя комплексообразованию белка с ДНК. Кроме того, в присутствии аскорбиновой кислоты он расщепляет ДНК-дуплекс за счет генерации активных форм j кислорода. Таким образом, кобальт-фталоцианиновый комплекс является эффективным ингибитором активности NF-кВ. Однако, высокое сродство фталоцианинов к любым последовательностям ДНК и подавление активности широкого спектра белков (NF-кВ, РНКаза Н, эндонуклеаза рестрикции Ssoll) ^ делает его действие неспецифичным. Специфичность может быть достигнута введением металлокомплекса в структуру модифицированных олигонуклеотидов для адресной доставки к генам-мишеням. Такие конъюгаты могут заложить основу для создания новых противоопухолевых агентов.
Проведенные в работе исследования представляют интерес с точки зрения анализа структурных особенностей белка р50 NF-кВ и его комплексов с ДНК-дуплексами в растворе и для разработок регуляторов активности фактора транскрипции NF-кВ в клетке.
