Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛІТЕРАТУРИ.* 9
ГЛАВА I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОРТОМЙКСОВИРУСОВ 9
-
Класси<|икаыия, морфология и физико-химические свойства.......... 9
-
Структура и полипептидный состав вирионов гриппа................... 10
ГЛАВА П. РНК СРТОМЙКСОШРУСОВ *. 13
-
Структура и <|изико-химические свойзтва РНК вируса гриппа. 14
-
Характеристики отдельных сегментов РНК...... 15
A. Гены, кодирующие полимеразные белки...... 18
Б. Ген., кодирующий гемагглютинин 20
B. Ген, кодирующий //Р-бзлок................ 20
Г. Ген, кодирующий нейрашнидазу....... 21
Д. Ген, кодирующий М-белки.. 23
Е. Ген, кодирующий Л/$1 и /^ белки... 25
ГЛАВА Ш. НУКЛЕОКАПСМД ОРТОМЙКСОВИРУСОВ 26
1. Структура и физико-химические свойства
оэлков РНП вируса гриппа............... 26
А. Белок нуклеопротеида ( УР-белок)..# 26
Б. Белки полимеразного комплекса (РВІ, РВ2
и РА) 30
2. Структура РНП вируса гриппа......... 35
A. Физико-химические свойства РНП.. 35
Б. Морфология РНП 37
B. Природа РНК-бэлкового взаимодействия..... 39
3. Взаимодействие РНП вируса гриппа с М-белком. 41
ЧАСТЬ П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНА РЕЗУЛЬТАТЫ 46
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
ГЛАВА П. ШЗШ-ЖШЧЕСКЙЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РНП
ВИРУСА ГРИППА 62
1. Основные характеристики интактного РНП
вируса гриппа................... 62
2. Протеолитическое расщепление /Р-белка
ферментом броме л ином. 63
ГЛАВА Ш. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА РНК ШРУСА ГРИППА
В РАСТВОРЕ 74
-
Использование катионного детергента петил-триметил-аммоний бромида (ЦГАБ) при выделении РНК вируса гриппа. 74
-
Исследование влияния ионной силы на тепловую денатурацию РНК вируса гриппа в растворе 77
-
Определение содержания А-У и Г-Ц пар оснований
в двухпепочечных участках РНК вируса гриппа. SO
4. Спектр кругового дихроизма РНК вируса
гриппа в растворе.... 84
ГЛАВА ІУ. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ РНП ВИРУСА ГРИППА
МЕТОДОМ КРУГОВОГО ДОРШЗМА 85
-
Спектры КД. 85
-
Исследование термоденатурации РНК и РНП вируса гриппа.. 87
-
Исследование природы связей в РНП вируса гриппа....... 91
А. Влияние мочевины на спектры КД РНП вируса
гриппа 93
Б. Влияние солей ( fact и rtf&L )
на спектры КД РНП вируса гриппа 95
ГЛАВА У. ОБРАТИМАЯ ДЙССОЩАЩЯ РИБОНУКЛЕОПРОТЕЙДА
ШРУСА ГРИППА 100
-
Условия диссоциации РНП .......100
-
Морфология и физико-химические характеристики белка, полученного в результате диссопиащи
комплекса 101
3. Peaceопиапия РНК-белкового комплекса До5
ГЛАВА УІ. ПОЛУЧЕНИЕ МШОСПЕЦРИЧЕСКЙХ СЫВСРОГОК К
/ИР-БЕЛКУ ВИРУСА ГРИППА И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА
МЕТОДАМИ РАдаШММУНШРЕЩПИТАЩИ И ИММУНО-
ФЕРМЕНТНОГО AHAJM3A ... 109
-
Анализ сывороток методом двойной иммуно-дифіузии НО
-
Радионммунопрепдпитапия.. ПО
3. Иммуноферментный анализ.. ПО
ГЛАВА УП. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗ
-
Протеолитическое расщепление УР-белка и матриксного белка вируса гриппа ферментом бромелином...... ИЗ
-
Вторичная структура РНК вируса гриппа в растворе............. Ц7.
-
Вторичная структура РНК в составе рибонуклео-протеида вируса гриппа. 119
-
Природа РНК-белковых взаимодействия в РНП
вируса гриппа. 121
-
Обратимая дассопиапия РНП вируса гриппа........ 124
-
Иммунологические свойства //Р-белка вируса
гриппа 128
ВЫВОДЫ 130
ЛИТЕРАТУРА 131
СІШСОК OGHOBHbK СОКРАЩАЙ
Введение к работе
Актуальность и значение работы. Грипп является одним из самых распространенных эпидемических заболеваний человека и животных. В последнее время достигнут значительный прогресс в изучении молекулярной организации вируса гриппа, особенно структуры его внешних компонентов, а также в определении нукле-отидной последовательности его генов. Однако., до настоящего времени остаются практически неясными структура и характер взаимодействия нуклеиновой кислоты с внутренними белками вири-она в составе вирусного нуклеопротеида. Изучение этого вопроса для вируса гриппа, как и для других вирусов с негативным геномом» является крайне важным, так как известно., что геном этих вирусов попадает в клетку и функционирует в ней не в свободном виде., а в виде комплекса с вирусепери $ическими белками, то есть в виде вирионного РНП. При этом вирусспецифіческие белки не только не препятствуют транскрипции, но,, возможно., имеют определенное значение в ее регуляции., обуславливая последовательность в доступности ферментам тех или иных участков РНК. В связи с этим несомненный интерес имеет изучение таких вопросов., как структура РНК вируса гриппа в растворе и в составе вирионного РНП, природа связи нуклеиновой кислоты с белком, а также выяснение условий, обеспечивающих стабильность комплекса в целом.
Цель и задачи исследования. Основной целью наших исследований было выяснение структурной организации РНП вируса гриппа и его основных компонентов. В задачу работы входило: разработка методов выделения в препаративных количествах РНК и ЖР-белка вируса гриппа і изучение вторичной структуры РНК в растворе и в
7 составе РНПі выяснение природы РНК-белковых взаимодействий и условий дассопиапии и peace опиапяи РНП комплекса і а также изучение возможности использования выделяемых нами препаратов для получения моноспепифических сывороток» Следует отметить, что в литературе почти нет данных, касающихся этих вопросов.
Научная новизна работы. Основные экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, являются оригинальными и получены впервые.
Разработан метод препаративного выделения РНК из субвирусных частиц вируса гриппа.
Определена вторичная структура РНК вируса гриппа в растворе и в составе РНП.
Установлена природа взаимодействия РНК с УР-белком в составе рибонуклеопротеида вируса гриппа.
Изучено протеолитическое расщепление /VP-бзлка под действием фермента бромелина в системе in- ъъ^о.
Впервые показана возможность обратимой диссоциации РНП вируса гриппа при изменении ионных условий и на ее основе предложен метод выделения чистого УР-бэлка.
Практическое значение работы. Діссертапионная работа имеет теоретический характер. Однако., поскольку полученные в работе данные конкретизируют представление о природе РНК-белковых взаимодействий в составе важнейшей функциональной структуры вируса гриппа - РНП, - они могут иметь и практическое значение., являясь основой для разработки новых химиотерапевтических препаратов, специфически препятствующих формированию вирусного рибонуклеопротеида.
Кроме того, разработанный в процессе работы метод выделения препаративных количеств РНК вируса гриппа может найти применение
8 в лабораторной практике, а предложенный подход к извлечению чистого /ИР-бэлка может быть использован при получении моно-специфических сывороток, необходимых для решения таких важных вопросов, как стандартизация вакцин, разработка методов экспресс-диагностики вирусных заболеваний и др.
Положения, выносимые на защиту.
Предложенный метод препаративного выделения РНК из субвирусных частиц,, полученных при обработке вирионов гриппа кати-онным детергентом цетил-триметил-аммоний бромидом (ЦГАБ)., вдвое увеличивает выход РНК по сравнению с обычно применяемым ^^ -фенольным методом.
Вторичная структура РНК в составе РНП вируса гриппа существенно отличается от структуры РНК в растворе. В свободной РНК 60$ оснований вовлечены в образование двухцепочечных участков ,,а в молекуле РНК в составе рибонуклеопротеида их число составляет 12-14$.
Основной вклад во взаимодействие между РНК и белком в составе РНП вируса гриппа осуществляют ионные связи. ГиДро ;-фобныз взаимодействия и водородные связи существенной роли в этом процессе не играют. Изменение ионных условий среды привода к ассоциации РНП вируса гриппа на РНК и белок, при этом связи меж,пу молекулами УР-белка сохраняются, и такие белковые структуры морфологически сходны с РНП. /1/Р-белок, полученный в результате диссоциации., высоко иммуногенен и может применяться для получения моноспедифіческих антисывороток.
Апробация работы. Материалы по теме диссертации были доложены на научной конференции молодых ученых "Вирусы человека и животных" (Рига., 1981г.)., а также на I Всесоюзном биофизическом
9 съезде (Москва, 1982р.)
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных результатов, обсуждения, выводов и датируемой литературы (238 источников отечественных и зарубежных авторов). В обзоре литературы представлены современные данные по структуре, физико-химическим свойствам, морфологии и молекулярной организации рибонуклеопро-теида вируса гриппа и его основных компонентов. Экспериментальная часть включает материалы и методы исследований, результаты работы и их обсуждение. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, включает 4 таблицы и 27 рисунков.
По теме дассертапии опубликовано пять научных работ. Последняя вышла в декабре 1983 г.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛШРАОТЫ
