Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
ПРОТЕИНКИНАЗЫ РАСТЕНИЙ 8
КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОТЕИНКИНАЗ РАСТЕНИЙ 10
Кальций-зависимые протеинкиназы 10
Протеинкиназьи родственные SNF1 11
Рецептор-подобные протеинкиназы 12
Подсемейства МАР-киназ (МАРЮ, МАРКК и 13
МАРККК
Циклин-зависимые киназы 13
Подсемейства казеин-киназы 1 (КК1) и казеин-киназы 2
(КК2) 14
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ 15
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ
ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ 16
Фосфорилирование транспортного белка вируса
табачной мозаики (ВТМ) и его роль в развитии
вирусной инфекции 16
Фосфорилирование транспортного белка вируса
мозаики томата 23
Фосфорилирование транспортных белков других
вирусов растений 26
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ
ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ 29
Фосфорилирование 2а компонента репликазы вируса
мозаики огурца 29
Фосфорилирование и убиквитинирование РНК-
зависимой РНК-полимеразы вируса желтой мозаики
турнепса (ВЖМТ) 31
Фосфорилирование NS-белка вируса розеточной
карликовости пшеницы 32
Фосфорилирование белка Pnsl2 вируса карликовости
риса 34
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ
ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ 35
Фосфорилирование капсидного белка вируса мозаики
цветной капусты 35
Фосфорилирование белка VPg А-вируса картофеля 36
Фосфорилирование белка оболочки А-вируса картофеля 37
Фосфорилирование и гликозилирование белка оболочки
вируса шарки сливы 43
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
Электрофоретический анализ белков в денатурирующем
поли акри л_амидн ом геле 46
Получение препарата растворимой
(цитоплазматической, S1Q) фракции 47
Фосфорилирование in vitro 47
Анализ протеинкиназной активности S10-фракции
листьев N.glutinosa с использованием ингибиторов
протеинкиназ 48
Трансляция в бесклеточной белрксинтезирующей
системе из экстракта зародышей пшеницы 49
Иммуноблот 50
Заражение растений ХВК 51
Измерение уровня протеинкиназной и
протеинфосфатаз-ной активности SlO-фракции листьев 51
N. glutinosa
Выделение препарата Х-вируса картофеля 52
Обработка препарата ХВК трипсином 53
Выделение плазмидной ДНК 54
Получение мутанта ХВК с заменами остатков серина и
треонина в N-конце белка оболочки (ST-мутанта1) 55
Высокоэффективная жидкостная хроматография 56
Анализ углеводных остатков в составе триптических
пептидов 56
Гидролиз карбоксипептидазой Y 57
Масс-спектрометрия 57
Инфракрасная спектроскопия 58
РЕЗУЛЬТАТЫ 59
В фосфорилировании белка оболочки ХВК растворимой фракцией листьев N. glutinosa in vitro, участвует протеинкиназа. сходная с казеинкиназой 2 61
Смесь КК 1 и КК2 способна фосфорилировать белок оболочки ХВК в составе вирионов и трансляционно активировать инкапсидированную РЫК 63
Фосфорилирование белка оболочки ХВК in situ не влияет на инфекционность вируса 64
Уровень протеинкиназной и протеинфосфатазной активности в хозяйских клетках изменяется в ходе развития вирусной инфекции 66
Удаление N-концевого фрагмента БО в составе
вирионов ХВК подавляет способность вируса
трансляционно активироваться фосфорилированием 70
Инфекционность препаратов XBK-Ptd снижена по сравнению с нативным ХВК 75
Замена потенциально фосфорилируемых аминокислотных остатков в N-конце БО влияет на способность инкапсидированной РНК транслироваться 78
Изменения структуры вирусной частицы, внесенные фосфорилированием, являются необратимыми 79
51-конец РНК ХВК доступен для взаимодействия с комплементарным олигонуклеотидом в составе фосфорилированного ХВК и ST-XBK, но не нативного
или комплекса ХВК-ТБ1 83
N-концевой фрагмент белка оболочки ХВК О-гликозилирован 84
Структура N-конца белка оболочки ХВК влияет на способность вириона связывать воду 90
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 93
ВЫВОДЫ 102
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 103
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
На современном этапе развития вирусологии растений большой интерес представляет изучение молекулярных механизмов межклеточного транспорта вирусной инфекции, регуляции процессов трансляции и репликации вирусных нуклеиновых кислот, а также принципов взаимодействия вируса с клетками растения-хозяина.
В момент заражения растения вирусом только небольшое число клеток оказывается инфицированным. Для дальнейшего распространения инфекции необходим межклеточный транспорт, который является активным процессом, осуществляется через плазмодесмы и требует участия одного или более кодируемых вирусом транспортных белков. Вирусная РНК перемещается из зараженной в соседние здоровые клетки в составе нуклеопротеидной структуры (транспортной формы). По-видимому, в составе транспортной формы вирусная РНК исключается из процессов трансляции и репликации, а после проникновения в здоровую клетку вновь становится доступной рибосомам для трансляции и продолжения развития инфекции. Механизмы регуляции описанных процессов и роль факторов клетки-хозяина в процессе транспорта инфекции мало изучены. На примере транспортной формы ВТМ было показано, что РНК в комплексе с транспортным белком недоступна для рибосом, однако фосфорилирование транспортного белка подавляет его репрессирующую активность, делая возможной трансляцию (Karpova et al., 1997', 1999). Трансляция РНК ВТМ родительских частиц в первично зараженных клетках происходит в результате процесса котрансляционного «раздевания» РНК рибосомами (Wilson & Shaw, 1987).
Объект нашего исследования, X вирус картофеля (ХВК) -типичный представитель рода Potexvirus. Роль транспортной формы потексвирусов выполняют либо зрелые вирусные частицы (Chapman et at, 1992; Oparka et al, 1996; Santa Cruz et al, 1998), либо комплекс РНК с белком оболочки (БО) и одним из трёх транспортных белков (ТБ1) (Lough et ai, 1998, 2000). Ранее в нашей лаборатории было показано, что, в отличие от ВТМ, РНК ХВК в составе вирусных частиц недоступна для трансляции in vitro, но приобретает способность транслироваться в результате: (а) взаимодействия вириона с транспортным белком ТБ1 ХВК либо (б) фосфорилирования белка оболочки (БО) (Atabekov et я/., 2000, 2001). Настоящая работа была посвящена дальнейшему исследованию роли фосфорилирования белка оболочки ХВК в трансляционной активации инкапсидированной РНК, характеристике протеинкиназ, способных фосфорилировать БО ХВК в клетках растения-хозяина, выявлению сайтов фосфорилирования и анализу влияния их мутационной модификации или делеции на свойства вириона и возможность трансляционной активации РНК.
