Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Методы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК 11
1.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ІТЦР-РВ .... 16
1.3. Лигазная цепная реакция - ЛЦР 35
1.4. Амплификация смещением цепи - Strand Displacement Amplification (SDA) 43
1.5. Амплификация по типу катящегося кольца или рамификация .. 45
1.6. Технология циклирующей пробы 48
1.7. Гибридизационная цепная реакция - ГЦР 50
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований 54
2.2. Фосфорилирование олигонуклеотидов 54
2.3. Выделение и очистка нуклеиновых кислот 54
2.4. Получение кДНК 56
2.5. Полимеразная цепная реакция 56
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 57
2.7. Лигазная цепная реакция в реальном времени с красителем SYBR Green I 58
2.8. Лигазная цепная реакция, основанная на FRET-эффекте, в режиме реального времени 58
2.9. Проведение амплификации по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы в реальном времени 58
2.10. Рамификация в реальном времени 59
2.11. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени 60
2.12. Электр офоретическии анализ ампликонов и исходных молекул нуклеиновых кислот 61
2.13. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ... 61
2.14. Использованные в работе обычные и модифицированные олигонуклеотиды 62
2.15. Основные реактивы, использованные в работе 66
2.16. Составы использованных стандартных растворов 67
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 68
3.2. Лигазная цепная реакция в реальном времени . 86
3.3. Амплификация по типу катящегося кольца с дезоксирибозимньтм расщеплением химерной пробы 92
3.4. Рамификация в реальном времени 99
3.5. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени 103
3.6. Применимость реакций амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени для фундаментальных исследований и диагностических целей 126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 138
ВЫВОДЫ 141
ЛИТЕРАТУРА 143
- Методы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК
- Фосфорилирование олигонуклеотидов
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Введение к работе
Актуальность теми. После своего появления в середине 80-х гг. полимеразная цепная реакция (ПЦР) [SaUd et al, 1985; 1988] очень быстро стала по существу методом Jfil а фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностике. Оставаясь таковым и поныне, она все же заметно изменилась, что в первую очередь связано с переводом этой реакции в режим реального времени, где детекция накопления ампликонов ведется в ходе самого процесса амплификации. ПЦР в реальном времени (ГЩР-РВ) сильно повлияла па взгляды как исследователей, использующих метод ПЦР для получения новых знаний о функционировании генов и геномов, так и тех, кто занят исключительно ДНК-диагностикой. Если для первых главным среди других задач является возможность количественного определения с помощью ПЦР-РВ числа копий мишени в стартовом материале, то вторые, помимо этого, отдают ей предпочтение еще и ввиду практически полного исключения загрязнения амплнконами рабочих помещений и сведения, таким образом, риска получения ложнопозитивных результатов х абсолютному минимуму, что при массовом характере анализов при использовании обычной ПЦР удается добиться далеко не всегда. Однако, несмотря на большое количество предложенных вариантов детекции ампликонов в ПЦР-РВ [Higuchi et а!., 1993; Lee et al., 1993; Tyagi et al, 1996; Nazarenko et at., 1997; Whitcombe et aL, 1999; Rasmussen et aL, 2003; Costa et al., 2004; Sherrill et aL, 2004; Monis et al., 2005 и др.], остается возможность разработки новых способов, по некоторым параметрам превосходящих существующие.
Вслед за ПЦР на рубеже 90-х тг, появился целый ряд других реакций амплификации и способов высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК или РНК, среди которых можно отметить лигазную цепную реакцию (ЛЦР) [Ватагу, 1991], амплификацию смещением цепи [Walker et aL, 1992], ее разновидность в вице амплификации катящимся кольцом [Lizardi et aL, 1998], технологию цнклирующей пробы [Duck et aL, 1990], самоподдерживающуюся репликацию [Guatelli et al, 1990; Compton, 1991], Qp-реплнказную амплификацию [Lomeli et al., 1989], разветвленную гнбридизационную пробу [Horn, Urdea, 1989]. К настоящему времени большинство из них переведены в передовой и наиболее удобный для ди-
агностики режим реального времени, однако в ряде случаев такой перевод оказался не очень эффективным и не лишенным серьезных недостатков.
Особый интерес эти реакции вызывают еще и тем, что все они (за исключением ЛЦР и стандартной ПЦР) протекают в изотермических условиях, благодаря чему нет потерь времени на смену температур и за счет этого не происходит искусственного сдерживания работы ферментов, что в ряде случаев более технологично. Цели иш30йачи цсследования. Цели исследования заключались в разработке новых вариантов управляемых сменой температур или протекающих изотермически в режиме реального времени реакций амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот и демонстрации их применения на практике.
В задачи исследования входило:
-
разработать основанный на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET-зффекге) способ детекции ампликоиов в ходе ПЦР-РВ на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) и показать возможность его применения для фундаментальных и прикладных исследований;
-
разработать способ детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ, основанный на временном гашении свечения флуорохрома, находящегося с гасителем в одном праймере, и возникновении флуоресценции вследствие расщепления ам-пликоиа термостабилыюй рестркшионной эндонуклеазой;
-
разработать основанный на FRET-эффекте способ детекции ампликонов в ходе ЛЦР-РВ, обеспечивающий отсутствие нематричного Актирования;
-
разработать новый способ детекции специфичных фрагментов ДНК путем объединения технологии циклнрующей пробы с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием множественных дезоксирибозимов 10-23;
-
разработать новый способ детекции ампликонов на платформе "УФА* в ходе двухпраймерной амплификации катящимся кольцом (рамификации) в реальном времени;
-
преобразовать гибридизационную цепную реакцию нуклеиновых кислот в режим реального времени (ГЦР-РВ);
-
показать применимость разработанных методов амплификации и высокочувствительной детекции на практике.
Научная новизна и практическая значимость. Разработан улучшенный способ детекции накопления ампликонов в ПЦР-РВ на платформе "УФА", по большинству параметров превосходящий аналогичные методы. Показана применимость данного способа ПЦР-РВ для проведения как ДНК-диагностики, так и для фундаментальных исследований, где он может быть использован для определения уровня экспрессии генов, содержащих нитроны, а также беэынтронных генов без ДНКазноЙ обработки. Разработан способ детекции ампликонов в ПЦР-РВ, основанный на временном гашении свечения флуорохрома, расположенного с гасителем в пределах одного праймера и возникновении флуоресценции вследствие их разобщения в процессе расщепления ампликона термостабильной рестриктазой Trul в ходе самой амплификации. Путем использования FRET-эффекта ЛЦР переведена в режим реального времени и при этом нематричное лнгирование с помощью LiCl сведено к минимуму. Разработана ЩР-РВ, основанная в варианте I на временном гашений свечения флуорохрома темповым гасителем, а вариант Ц рассчитан на эффект FRET. Продемонстрирована высокая специфичность данной реакции, позволяющая дискриминировать иннциаторные молекулы с единичными заменами нуклеотидов, что может быть использовано при анализе однояуклеотидного полиморфизма ДНК человека. Показана возможность использования в ГЦР молекул РНК в качестве инициатора самосборки без их перевода в кДНК. Произведено объединение технологии амплификации ДНК катящимся кольцом с регистрацией этого процесса с помощью циклирующих проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных деэоксирибозимов. Показано, что протекание двухпраймерной рамификации в реальном времени может контролироваться с помощью регистрации FRET-зффеіоава платформе "УФА".
Практическая значимость работы заключается в значительном расширении спектра методов амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени специфичных последовательностей ДНК или РНК. Показана возможность их использования как для фундаментальных, так н прикладных целей, в том числе для детекции коронавируса, хантавируса, вируса птичьего гриппа субтипа H5N1, выявления генетически модифицированных ингредиентов (ТМИ) путем обнаружения наиболее часто используемого для создания трансгенных растений промотора 35S.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Ш съезде ВОГиС (Москва, 2004), международном симпозиуме 'Трансгенные растения и проблемы биобезопасности" (Москва, 2004), II и III съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2005), 2-ой международной конференции "Бнотехно-логня-Биомедицнна-Окружаюшая среда" (Пушино, 2005), 3-ей международной конференции "Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность" (Пущине, 2005), ХШ международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006" (Москва, 2006), международной школе* конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка о почечным синдромом" (Уфа, 2006).
Конкурсная поддержка работы.. Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ—НШ-2217.2003.4, НШ-1003.2006.4 и Государственных контрактов ФЦНТП , 02.445.11.7381.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов н их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 176 работ. Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 53 рисунка и 2 таблицы.
Методы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК
Прежде всего, считаем необходимым пояснить какой различный смысл мы вкладываем здесь в слова "амплификация" и "высокочувствительная детекция", хотя часто под этими терминами понимается одно и тоже. В ряде реакций происходит амплификация в виде наработки ампликонов, представляющих определенные фрагменты ДНК или РНК, обычно ограниченные праймерами или олигонуклеотидами. И хотя такая амплификация тоже есть высокочувствительная детекция мы решили ее все же отграничить от реакций, где исходное количество интересующих экспериментатора тех или иных участков ДНК или РНК остается неизменным, но благодаря их присутствию в реакционной смеси происходит фактически накопление или иначе амплификация какого-либо сигнала (в наших случаях - флуоресцентного), обеспечивающая эту самую высокочувствительную детекцию.
В основе всех методов амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов нуклеиновых кислот лежит принцип комплементарности азотистых оснований и возможность образования гибридных молекул, как ДНК/РНК, так: и ДНК/ДНК или РНК/РНК, где одна цепь выступает мишенью, а другая - гибридизационнои пробой. Разработка методов молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и способов детекции гибридных молекул стала развиваться в начале 60-х гг. прошлого столетия, когда для разделения гибридов было применено ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия [Hall, Spiegelman, 1961]. Чуть более производительным был предложенный тогда лее метод агаровых колонок [Bolton, McCarthy, 1962], где гибридизацию нуклеиновых кислот уже можно было считать твердофазной. Гибридизация же в растворе получила свое продолжение в виде метода кинетики реассоциации ДНК, сыгравшего очень значительную роль в познании структурной организации геномов различных организмов [Britten, Kohne, 1968].
Наибольший вклад в то время в развитие метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот был сделан S.Spiegelman и его коллегами. Так, в одной работе ими был разработан метод деления гибридных молекул с помощью хроматографии на метилированном альбумине, сорбированном на кизельгуре [Hayashi et al., 1965]. Однако серьезный прорыв в этой технологии был сделан, когда для сорбции одноцепочечной ДНК были применены мембранные фильтры из нитрата целлюлозы [Gillespie, Spiegelman, 1965], после чего последовали другие работы, направленные на улучшение этого метода [Denhardt, 1966; Warmaar, Cohen, 1966 и др.]. Новый прогресс в молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в середине 70-х гг. был обусловлен объединением метода электрофоретического разделения рестриктазных фрагментов ДНК с гибридизацией на мембранных фильтрах, на которые ДНК из геля (первоначально только агарозного) переносилась методом, получившим название "блоттинга по Саузерну" по фамилии экспериментатора, его разработавшего [Southern, 1975].
Фосфорилирование олигонуклеотидов
При выполнении данной работы объектами исследований служили как искусственные молекулы ДНК (олигонуклеотиды) и РНК (рибоолигонуклеотиды), синтезированные химическим путем методом фосфорамидитного синтеза (табл. 2.1.). Олигонуклеотиды были синтезирована в ИБҐ УНЦ РАН, в ЗАО "Синтол" (Москва) и НПО "Литех" (Москва). В работе также были использованы природные молекулы ДНК и РНК, имеющие вирусное происхождение (вирус птичьего гриппа субтипа H5N1, хантавирус серотипа PUU), бактериальное {Е.соН, Agrobacterium tumefaciens), растительное (табак) и животное (лосось, курица, человек) происхождение.
Фосфорилирование олигонуклеотидов
Те олигонуклеотиды, использовать которые не планировалось иначе как для лигирования, сразу подвергались химическому фосфорилированию еще в процессе синтеза во время этапа введения фосфатной группы с помощью специального фосфорамидита Chemical Phosphorylation Reagent П.
Для олигонуклеотидов, использование которых предполагалось и без фосфатной группы на 5 -конце, применялось ферментативное фосфорилирование, которое проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержавшей буфер (50 мМ Трис-HCl (рН7.8), 10MMMgCl2, 5 мМ ДТТ, 0.1 мМ спермидина, 0.1 мМ ЭДТА), 0.2 - 0.5 о.е. олигонуклеотида, 10 мМ АТФ, 10 ед. акт. полинуклеотядкиназы фага Т4. После инкубации в течение 30 мин при 37С, раствор прогревали 10 мин при 65С и хранили в холодильнике при -20С.
Выделение и очистка нуклеиновых кислот
Учитывая сверхвысокую чувствительность ПЦР и остальных используемых в данной работе реакций амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот, особая забота, направленная на исключение возможного перекрестного загрязнения образцов ДНК и РНК, была проявлена при их выделении из разных образцов и объектов, С этой целью экстракция ДНК или РНК, включая стадию гомогенизации, велась в одноразовых полипропиленовых микроцентрифужных пробирках. ДНК из разных биологических объектов выделяли фенольно-детергентным методом [Graham, 1978] с некоторыми модификациями. Экстрагентом служил раствор 100 мМ трис-HCl рН 8.0, 20 мМ ЭДТА, 1%-ный ДДС натрия с последующим добавлением 5 М NaC104 до конечной концентрации 1 М. После нескольких депротеинизации смесью щелочного фенола с хлороформом (взятых в соотношении 1:1) и центрифугирования, ДНК из водно-солевой фазы осаждали этанолом. Осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола и хлороформа и растворяли в соответствующем объеме буфера 1хТЕ (10 мМ трис-HCl рН 7.6,1 мМ ЭДТА).
РНК выделяли, используя гуанидинтиоцианатный буфер, содержащий 4 М гуанидинтиоцианат, 2%-ный саркозил, 50 мМ трис-HCl (рН 8.0), 10 мМ ЭДТА, 1%-ный Р-меркаптоэтанол [Chomczynski et al., 1987]. После депротеинизации смесью фенола и хлороформа РНК осаждали изопропанолом. Осадок РНК промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола, хлороформа и изопропанола и растворяли в соответствующем объеме буфера 1хТЕ.
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса [Birnboira, Doly, 1979]. Клетки E.coli собирали центрифугированием при 3000g в течение 10 мин. Осадок суспендировали в одной части раствора I соответствующего объема, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7.8) и 20 мМ ЭДТА. Затем добавляли две части раствора II, содержащего 1%-ный раствор ДДС натрия и 0,2 М NaOH и помещали на 10 мин на лед. К лизату добавляли полторы части (по отношению к исходному объему раствора I) 5 М ацетата калия и оставляли на льду в течение 20 мин. Для удаления высокомолекулярной ДНК и обломков клеток образовавшуюся суспензию центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин. Осторожно сливали супернатант и плазмидную ДНК из него осаждали этанолом. Депротеинизацию сформировавшегося осадка проводили встряхиванием с равным объемом смеси щелочного фенола и хлороформа. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока не исчезала интерфаза, состоящая из денатурированного белка. Затем супернатант встряхивали с равным объемом хлороформа с последующим центрифугированием и осаждали ДНК двумя объемами этанола. Спиртовой осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола и хлороформа и растворяли в соответствующем объеме буфера ТЕ.
Концентрацию РНК или ДНК в образцах определяли по оптической плотности на спектрофотометре SmartSpec Plus (Bio-Rad, США).
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Несмотря на огромное количество всевозможных вариантов ПЦР-РВ, рассмотренных нами в соответствующем разделе литературного обзора, все они принципиально отличаются от разработанного нами как расположением праймеров, так и их мечением. Считается, что в ПЦР праймеры должны отстоять друг от друга на некотором расстоянии и, пожалуй, главной причиной этого служит некий стереотип мышления. Действительно, одно из главных предназначений ПЦР - это давать новую информацию, заключенную между праймерами, да и для ДНК-диагностики по конечной точке детектировать электрофорезом продукты ПЦР размером около 300 - 500 пи в агарозном геле (а не более мелкие в полиакриламидном) было гораздо удобнее. Но ПЦР в реальном времени является по существу самостоятельным методом, предназначенным лишь для выявления или количественной оценки тех или иных последовательностей ДНК или РНК, и размер ампликонов в нем может и даже, более того, должен быть небольшим. И такими они, надо признать, уже стали. Так, во многих высоко специфичных вариантах размер амплифицируемого фрагмента ДНК укорочен до 70 - 80 пн, 40 - 50 пн из которых приходятся на места отжига праймеров, а остальная последовательность с двух-трех нуклеотидными брешами между праймерами и гибридизационным зондом приходится на эту самую срединную часть в вариантах TaqMan или Molecular Beacon, например. Однако и в менее специфичных вариантах без применения гибридизационных зондов их авторам не удалось уйти от этого стереотипа, и размеры ампликонов остаются по-прежнему довольно большими. Наиболее короткие продукты ПЦР-РВ размером от 46 до 70 пн упоминаются в работах по низкоспецифичной амплификации ДНК в присутствии нового красителя LCGreen с последующим плавлением ампликонов, поскольку длина фрагментов ДНК в этом методе весьма критична [Liew et al., 2004].
В плане укорочения продуктов ПЦР-РВ мы, можно сказать, пошли дальше всех и в нашем варианте праймеры встык (или иногда почти встык с небольшим "зазором", что зависит от особенностей нуклеотидиых последовательностей в конкретном выбранном месте) прилегают друг к другу, приводя к наработке ампликонов размером всего 40 - 50 пн (рис.3.1.1).
Подбор олигонуклеотидных праймеров велся нами с таким расчетом, чтобы они обеспечивали специфичность реакции и ограничивали собой фрагмент нуклеотидной последовательности РНК (или ДНК) размером 40 -50, соответственно, нуклеотидов или пар нуклеотидов. При подборе праймеров во внимание принимались следующие обстоятельства - чтобы в процессе синтеза олигонуклеотидных праймеров (или постсинтетически) последние могли быть помечены так называемыми внутренними метками, представляющими собой соответствующие флуоресцентные красители и гасители, характеризующиеся подходящими длинами волн возбуждения и испускания и, таким образом, представляющими собой или пару донор/акцептор, или пару краситель/гаситель. Причем в результате амплификации расположение красителей друг от друга в целевом двуцепочечном продукте должно оказываться на таком расстоянии, где перенос флуоресцентной резонансной энергии или гашение одного из флуорохромов эффективно происходят.
