Введение к работе
Актуальность темы Ферменты, содержащие в качестве кофактора пиридоксаль-5'-фосфат, играют первостепенную роль в азотистом обмене Они катализируют разнообразные реакции превращений аминокислот трансаминирование, рацемизацию, а- и Р-декарбоксилирование, ретро-альдольное расщепление, р- и у-элиминирование и замещение Центральная роль пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов в метаболизме аминокислот и аминов определяет актуальность исследования механизмов их действия и регуляции их генов
Метионин - у-лиаза (КФ 44 111) - пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый фермент, катализирующий реакцию у-элиминирования L-метионина с образованием метилмеркаптана, аммония и а-кетобутирата
I Нз+ - Ї
о о
К настоящему времени фермент был идентифицирован практически лишь в анаэробных микроорганизмах Многие из этих микроорганизмов являются патогенами, в том числе бактерии, вызывающие бутулизм (Clostridium botuhnum), колиты (Clostridium difficile), разрушение зубов (бактерии рода Porphyromonas), заболевания десен {Treponema denticold) и послеоперационные инфекции (бактерии рода Bacteroides) Кроме того, этот фермент был недавно идентифицирован в двух патогенных одноклеточных эукариотах, в Entamoeba histolytica и в Trichomonas vaginalis
Наличие фермента в перечисленных выше патогенных бактериях и одноклеточных эукариотах и возможность его присутствия в других патогенах указывают на то, что метионин - у-лиаза является перспективной биохимической мишенью для создания новых лекарственных препаратов против ряда анаэробных бактериальных и эукариотических патогенов Нужно отметить, что в настоящее время в мировой практике возрастает интерес к применению метионин - у-лиазы в терапии - в основном, в терапии раковых опухолей, а также при болезни Паркинсона, атеросклерозе, старении и др
\N3J
Метионин - у-лиаза является малоизученным ферментом - данные о ее физико-химических характеристиках и механизме реакции у-элиминирования L-метионина весьма ограничены Всестороннее изучение физико-химических характеристик фермента и механизма его действия необходимо для создания эффективного препарата фермента для онкотерапии, а также для рационального дизайна ингибиторов и суицидальных субстратов метионин - у-лиазы, которые могли бы использоваться в качестве лекарственных препаратов
Цели в задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование каталитических параметров метионин - у-лиазы Citrobacter freundn и получение кристаллов фермента, пригодных для рентгеноструктурного анализа.
В работе были поставлены следующие задачи 1) разработка метода получения гомогенного препарата метионин - у-лиазы Citrobacter freundn, 2) клонирование и секвенирование гена фермента и создание штамма-суперпродуцента, 3) определение стационарных каталитических параметров фермента, 4) поиск условий выращивания кристаллов метионин - у-лиазы, пригодных для рентгеноструктурных исследований
Научная новизна и практическая ценность работы. Ген, кодирующий метионин - у-лиазу, впервые идентифицирован в семействе Enterobactenaceae Разработан метод выделения фермента, позволяющий получать гомогенные препараты метионин - у-лиазы из клеток С freundn и рекомбинантного фермента, экспрессированного в клетках Ecoh Определены параметры стационарной кинетики фермента в реакциях а,(3- и а,у-элиминирования Разработаны условия получения кристаллов фермента, пригодных для рентгеноструктурного анализа, что позволило определить пространственную структуру холофермента с разрешением 1,9 А
Апробация работы. Материалы работы были представлены на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (г Пушино, Россия, 2000 г), на международной конференции "Биокатализ-2000" (МГУ им М В Ломоносова, июнь 2000 г), на третьем международном симпозиуме "Витамин В6 и карбонильный катализ" (Саугхемптон, Великобритания, апрель 2002 г), на III
съезде Биохимического общества РАН (г Санкт-Петербург, июнь 2002 г) и на первом Европейском конгрессе микробиологов (Любляна, Словения, июнь-июль 2003 г)
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах, включает 22 рисунка, 13 таблиц и содержит 181 ссылку на литературные источники Диссертация включает введение, обзор литературы, методы исследования, результаты работы и их обсуждение, выводы и список литературы
