Введение к работе
Актуальность проблемы.
Прошло уже более пяти лет с тех пор, как молекулярная генетика перешагнула важнейший рубеж в своем развитии - определение полной нуклеотидной последовательности генома человека Наличие подобного ресурса информации обеспечило прорыв в комплексных исследованиях функционирования генов, однако не дало окончательного ответа на вопрос, каким образом один и тот же набор кодирующих последовательностей позволяет формировать огромнейшее разнообразие типов клеток До сих пор однозначно неизвестно, какие именно механизмы участвуют в переключении активности генов и, таким образом, в образовании профиля экспрессии генов, необходимого для того или иного вида ткани Среди возможных факторов, определяющих эту дифференцировку и называемых "эпигенетическими", рассматриваются модификации ДНК, а также гистонов - белков, отвечающих за компактизацию хроматина В совокупности со специальными ДНК- и гистон-связывающими белками эти две эпигенетические модификации способны в разных тканях и на разных стадиях развития изменять набор экспрессирующихся генов Изучение подобного эпигенетического влияния ведется уже не первый десяток лет и метилирование ДНК (по пятому положению цитозинового основания) общепризнано считается одним из факторов, определяющих связывание транскрипционных факторов в промоторных областях генов Также имеются данные о вовлеченности этой модификации в процесс опухолеобразования эпигенетической инактивации онкосупрессоров и активации онкогенов Кроме того, считается, что метилирование ДНК ответственно за супрессшо мобильных элементов, а также, предположительно, за поддержание стабильности хромосомного материала
Тем не менее, данные в этой области исследования ограничиваются достоверными, но все-таки фрагментарными сведениями о влиянии отдельных или нескольких сайтов метилирования ДНК на экспрессию тех или иных генов в конкретных наборах тканей Это обусловтено ограниченностью методической базы исследователей, использующих, главным образом, те подходы, которые позволяют опредетять статус метилирования локальных областей генома длиной не более нескольких тысяч пар оснований После полного секвенирования генома человека стали возможны и приобрели особую актуальность комплексные исследования целых геномных локусов Это может позволить получить представление о системной совместной работе генов, принадлежащих одному семейству или просто
располагающихся рядом в геноме, а также понять, какие изменения происходят на мультигенном уровне в процессе дифференцировки той или иной ткани или ее опухолевого перерождения Поскольку неметилированные области генома обычно содержат активно транскрибируемые гены, то создание протяженных и даже полногеномных профилей метилирования ДНК могло бы позволить косвенным образом определить характер экспрессии в исследуемом образце
Сравнительно недавно в Лаборатории Структуры и Функций Генов Человека ИБХ РАН был предложен, разработан и успешно применен новый подход к определению профиля метилирования ДНК на протяженных участках генома размером от нескольких сотен тысяч пар оснований (NGSCC, Nonmethylated Genomic Sites Coincidence Cloning, Azhikina et al, 2004) Метод заключается в картировании неметилированых сайтов той или иной метил-чувствительной эндонуклеазы рестрикции Однако он сопряжен с довольно большим объемом секвенирования, влекущим за собой значительные временные затраты и дороговизну рутинных исследований Данная работа была направлена на создание нового экспериментального подхода, значительно снижающего количество времени и ресурсов, необходимых для картирования сайтов расщепления генома (в данном случае - последовательностей узнавания метил-чувствительной эндонуклеазы)
Цели и задачи работы
Цетью настоящей работы являлась разработка и применение нового метода
быстрого картирования сайтов расщепления заданных сегментов генома длиной от 1 до нескольких млн п о (RIDGES, Rapid IDentification of GEnomic Splits) на примере сайтов расщепления метил-чувствительной эндонуклеазой рестрикции Этот метод представляет собой эффективный подход к изучению метилирования протяженных участков генома, который можно использовать для рутинных исследований одновременно большою количества образцов Работа состояла из двух основных частей 1 Разработка нового экспериментального метода экспресс-картирования 2 Создание комплекса компьютерных программ, осуществляющих обработку результатов и их визуализацию
Были поставлены следующие задачи
Создание и оптимизация метода быстрого картирования сайтов расщепления протяженных фрагментов геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами рестрикции
Разработка теоретической базы и создание программного обеспечения, потяостью автоматизирующего процесс картирования
Разработка принципов визуализации получаемых результатов и создание комплексного программного обеспечения, осуществляющего эту задачу
Получение карты распределения неметилированных ЯраІІ-сайтов для локуса D19S208-COX7A1 19 хромосомы человека (длина 1 млн по) в ткани легких и подтверждение полученных результатов независимыми методами
Научная новизна и практическая ценность.
Был впервые разработан и протестирован новый методический принцип, отличающийся от ранее использовавшихся распространенных экспериментальных подходов, позволяющий с минимальными затратами времени картировать сайты расщепления генома Метод характеризуется в первую очередь быстротой применения и подходит для рутинной исследовательской работы, включающей изучение большого количества образцов С его помощью был впервые подробно исследован профиль метичирования протяженного мультигенного локуса генома человека длиной более 1 млн пар оснований
Для облегчения и ускорения обработки получаемых массивов данных был создан комплекс программных продуктов, позволяющих также гибко изменять параметры анализа результатов
Так как получаемые результаты сложно интерпретировать в исходном "сыром" виде, были предложены несколько подходов к их визуализации, а также разработано программное обеспечение, осуществляющее эту визуализацию максимально простым для пользователя способом
Таким образом, основным практическим результатом работы стало создание принципиально новой разработанной методической базы для исследования статуса метилирования ДНК Методика может быть применена для комплексного и даже полногеномного исследования влияния метилирования как эпигенетического фактора на дифференцировку тканей, неоплазию и другие фундаментальные клеточные процессы
Структура диссертации
Диссертация изложена на ^листах машинописного текста, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего /(^""ссылок, и приложений
Основные экспериментальные данные и разработки, представленные в диссертации, получены лично автором Исследования проводились в соавторстве со Скворцовой Ю В (ЛСФГЧ, ИБХ РАН)
