Содержание к диссертации
Введение стр. 4
Глава I. Литературный обзор
1.1 Ангиогенез: непременное условие для роста ракового новообразования стр. 9
Ангиогенез и онкогенез стр. 9
Механизмы ангиогенеза стр. 10
Особенности опухолевых сосудов стр. 12
1.2 Биохимия ангиогенеза , стр. 14
Ангиогенный переключатель стр. 14
Основной игрок: сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецепторы , стр. 16
VEGF- ключевой фактор ангиогенеза
Семейство VEGF
Рецепторы VEGF
Регуляция экспрессии VEGF
Биологическое действие VEGF
Эпителиальный фактор роста и его рецептор стр. 27
Прочие про-ангиогенные факторы стр. 30
1.3 Анти-ангиогенез , стр. 33
Эндогенные анти-ангиогенные факторы стр. 33
Обоснование анти-ангиогенной терапии., стр. 34
Обзор современных анти-ангиогенных препаратов стр. 36
Гипотеза о нормализации сосудов. Потребность в надежных биомаркерах раннего ответа на анти-ангиогенную терапию стр. 38
Глава И. Материалы и методы
Клеточная культура і стр. 41
Флуоресцентные пробы '. стр. 42
П.З Контрастные MP-агенты стр. 42
Н.3.1 Gd-DTPA («Магневист»)
Н.3.2 PGC-Gd
П.3.3 Gd-DTPA-diSer
П.4 МР-релаксометрия в изучении ангиогенеза стр. 45
П.4.1 Метод релаксометрии стр. 46
П.4.2 Описание РЧ-последовательностей для релаксометрии стр. 48
II.5 MP-оценка изменения объема крови в опухоли, проницаемости сосудов и прочих
параметров методами МРТ стр. 50
П.5.1 ТІ-метод оценки гемодинамических параметров. Описание
последовательности SPGR стр. 50
II.5.2 Опухолевые модели '. стр. 53
П.5.3 Магнитно-резонансное исследование мышей и анализ данных стр. 54
Радиоизотопное исследование по определению фракции эритроцитов для коррекции значений абсолютного объема крови стр. 55
Коррекция.значений Vb стр. 56
П.5.6 Гистологические методы для подтверждения соответствия данных МРТ происходящим
в тканях процессам стр. 57
Н.б Визуализация молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза методом магнитно-
резонансной амплификации стр.59
II.6.1 Метод магнитно-резонансной амплификации стр. 59
И.6.2 Синтез конъюгатов HRP-mab425 и GO-mAb425 (mAb Clone 425, anti-EGFR, Merck
R&D) стр.60
11,6.3 Определение концентрации белка методом ВСА стр. 62
Н.6.4 Электрофорез SDS-PAGE (с додецилсульфонатом натрия) стр. 63
П.6.5 Определение молярного соотношения замещения (Molar Substitution Ratio - MSR) для
промежуточных продуктов GO-SHNH, HRP-SHNH, mab-SFB) стр. 64
11,6.6 Гель-фильтрация (гель-хроматография) стр. 64
П.6.7 Количественное определение EGFR на клеточной культуре (методом ELISA) стр. 65
Н.б.8 Тест конъюгатов на клеточной культуре (МРТ).., стр. 66
Н.6.9 In vivo MP-эксперимент. Визуализация маркера карциномы L6 стр. 69
Глава III. Результаты
III.1. Объем опухоли и объем крови в опухоли. Магнитно-резонансная томография
ангиогенеза '......;.....,.. стр. 70
Ш.2 Поправочные коэффициенты по гематокриту в опухолевой и мышечной ткани стр. 76
Ш.З Результаты гистологических исследований (изменения микрососудов в ответ на анти-
ангиогенную терапию VEGFR2-TKI) .*. стр. 77
ІІІ.3.1 Гистология препаратов контрольной группы , стр. 77
Ш.3.2 Гистология препаратов экспериментальной группы (терапия VEGFR2-TKI) стр. 78
Ш.4 Характеристика и релаксационные свойства парамагнитного субстрата
Gd-DTPA-diSer стр.81
Ш.5 Характеристика биоконъгогатов для специфичной визуализации молекулярных маркеров
с помощью парамагнитного субстрата Gd-DTPA-diSer стр. 84
Ш.6 In vitro исследования работы системы биоконъюгаты-парамагнитный субстрат стр. 86
III.7 Визуализация молекулярных мишеней in vivo стр. 90
Глава 4. Обсуждение результатов и выводы
IV.1 Обсуждение результатов по анализу гемодинамических параметров стр. 92
IV.2 Обсуждение результатов по визуализации молекулярных маркеров стр. 94
IV.3 Основные итоги работы стр.96
Общее примечание стр. 98
Список работ, опубликованных по теме диссертации стр. 99
Список литературы стр.100
Условные обозначения и единицы измерения стр. 111
Введение к работе
Ангиогенезом называют формирование новых сосудов на базе существовавших ранее. Более 25 лет назад Judah Folkman впервые сформулировал основные положения теории взаимосвязи ангиогенеза и онкогенеза [1]: (і) большинство первичных солидных опухолей проходит через стадию небольшой аваскулярной массы (размерами 1-2 мм в диаметре), могущей длительное время находиться в неактивном, «спящем» состоянии. При этом кислород и питательные вещества доставляются в процессе пассивной диффузии; (іі) эти микрообразования каким-то образом могут «включить» ангиогенез, заставляя окружающие сосуды выпускать «ростки» в сторону опухоли, которые впоследствии интегрируются В опухолевую массу. Этим самым новообразование получает возможность роста и метастазирования (через кровоток); (іІ і) ангиогенный «переключатель» активируется при помощи семейства эндогенных белков, факторов роста; (iv) рост опухоли можно остановить путем блокирования ангиогенеза, либо через «переключатель» либо напрямую разрушая эндотелиальные клетки новых сосудов. Последний подход предполагает, что новообразованные сосуды по своей структуре и клеточному составу отличаются от зрелых «обычных» сосудов; (v) будучи успешным, такой терапевтический подход направлен на лишение раковой опухоли возможности расти и метастазировать; в лучшем случае это может привести к ее регрессу до 1-2 мм в диаметре и достижению «спящей» стадии, когда выживание уже не зависит от наличия кровеносной сети.
В настоящее время анти-ангиогенная терапия является одним из самых перспективных направлений в терапии раковых заболеваний, причем особенно эффективен «двойной удар» -совместно с цитотоксической терапией, направленной против опухолевых клеток. Идут клинические испытания эндогенных ингибиторов ангиогенеза (эндостатин, апгиостатин, тромбоспондин), антител против ключевых ангиогенных факторов (VEGF, интегрины) и низкомолекулярных ингибиторов "тирозин-киназной активности их рецепторов (VEGFR2-TKI). Первый анти-VEGF препарат (bevacuzimab, Genentech, Inc., San Francisco, CA) уже одобрен в США для лечения метастатического рака кишечника совместно с химиотерапией, десятки находятся на различных стадиях клинических испытаний.
Особо остро встает вопрос об эффективном мониторинге действия анти-ангиогенных препаратов при клинических испытаниях для определения оптимальной биологически активной дозы и «временного окна» для введения. Пока, несмотря на явные положительные
результаты, клинические исследования ингибиторов ангиогенеза не оправдали радужных перспектив, возникших после пре-клинических исследований. По крайней мере, частично, это обусловлено сложностью дизайна клинических исследований в этой области. Терапия не цитотоксична - это благоприятно для пациента, но определение оптимальных биологически активных доз и оценка ответа на терапию представляют большую проблему. Подход, применяемый в химиотерапии ~ максимально возможная доза - является неприемлемым для анти-ангиогенной терапии, поскольку а) побочные эффекты этих лекарств все еще непредсказуемы и б) наиболее эффективная доза может быть намного меньше максимальной. С другой стороны, оценка оптимальной дозы по измерению уменьшения размеров опухоли или времени прогресса болезни не представляется практически обоснованной, поскольку сам механизм действия анти-ангиогенных препаратов таков, что до появления видимого уменьшения размеров опухоли могут пройти многие месяцы и даже годы. Кроме того, в большинстве случаев раковые опухоли крайне гетерогенны и поэтому индивидуальные особенности будут иметь очень большое влияние на исход терапии. Следовательно, для получения статистически достоверных результатов нужны систематические, охватывающие большое число пациентов, а, следовательно, очень дорогостоящие клинические исследования.
Таким образом, возникает потребность в определении надежных биомаркеров раннего ответа на анти-ангиогенную терапию, по которым можно будет предсказать последующий клинический эффект. Такие биомаркеры будут полезны не только для облегчения клинических исследований новых препаратов, но и для определения индивидуальной схемы лечения для каждого пациента.
Выше уже упоминалось длительное время, необходимое для видимых морфологических изменений в опухоли. Несмотря на то, что клинический ответ на терапию ингибиторами ангиогенеза является медленным, некоторые метаболические и физиологические изменения можно зафиксировать уже вскоре после начала лечения. Поскольку терапия ингибиторами ангиогенеза направлена на аномальные опухолевые сосуды, то естественно предположить на роль маркеров такие гемодинамические параметры, как объем крови в опухоли, поток крови через опухоль, проницаемость опухолевых сосудов и их плотность. Еще одним подходом является дизайн контрастных агентов, взаимодействующих с молекулярными маркерами ангиогенеза. Поскольку ингибиторы ангиогенеза специфичны по отношению к определенным ангиогенным молекулам (VEGF, EGFR, ctvp3 ) или же косвенным способом направлены на их подавление их активности, то оценка изменения количества в опухоли даст представление о ходе терапии. Также показано, что эти факторы могут представлять собой диагностическую
и прогностическую ценность. Помимо прочего, для индивидуализации терапии было бы крайне ценным так называемое «типирование» опухолей, то есть создание индивидуального профиля по ключевым молекулярным маркерам. Мониторинг этих факторов в процессе лечения был бы также крайне полезен.
Самым простым способом, позволяющим следить за терапевтическим эффектам, является биопсия опухоли. Однако частое взятие биопсийного материала из опухоли многие врачи считают слишком обременительным для пациентов. Намного более предпочтительной была бы неинвазивная методика исследования новообразования. При биопсии гетерогенность опухоли не позволяет надеяться увидеть картину в целом, а не локально, да и погрешность в зависимости от области опухоли будет велика. Возникает потребность в воспроизводимой методике, которая бы позволяла проводить мониторинг всей опухоли в целом или отдельных ее областей.
Магнитно-резонансная томография (МРТ) является незаменимым инструментом при изучении ангиогенеза in vivo, поскольку а) это неинвазивная методика б) она позволяет делать множество повторных воспроизводимых снимков с хорошим анатомическим разрешением в) не сопровождается ионизирующим излучением г) позволяет измерять абсолютный объем крови, изменение которого предшествует регрессии опухоли. Современные достижения в молекулярной МРТ также позволяют неинвазивно исследовать молекулярные мишени, однако возможности визуализации молекулярных биомаркеров рака пока являются ограниченными.
Цель данной работы заключается в изучении методами МРТ биомаркеров ангиогенеза и раннего ответа на анти-ангио генную терапию в карциномах человека на животных моделях.
Для достижения этой цели поставлено ряд задач.
Разработать животную модель (ксенографты человеческой карциномы ободочной кишки) и чувствительный протокол для MP-экспериментов по изменению гемодинамических параметров в ответ на терапию ингибитором тирозин-киназной активности VEGFR-2.
Определить содержание эритроцитов для нахождения поправки по распределению контрастного МР-агента.
Им му но гистохимическими методами показать соответствие данных МРТ сопровождающим анти-ангио генную терапию и ангиогенез изменениям.
Оптимизировать методику синтеза и очистки конъюгатов ферментов (глюкозоксидазы и пероксидазы хрена) и антитела (анти-EGFR или анти-Ь6) с целью их дальнейшего использования в экспериментах по визуализации соответствующих молекулярных мишеней.
Применить метод магнитно-резонансной амплификации для визуализации EGF-рецептора, который регулирует активность VEGFR и L6 - маркера карциномы кишечника.
Защищаемые положения
Благодаря магнитному полю семи неспаренных электронов парамагнитный внутрисосудистый контрастный Т1-агент PGC-Gd активно изменяет релаксационные свойства окружающих протонов. Он укорачивает время спип-решеточной релаксации (ТІ) накапливающих его областей, благодаря чему при использовании Т1-взвешенной последовательности их изображение становится ярче. По причине большого гидродинамического диаметра концентрация PGC-Gd в сосудистом русле остается постоянной на все время MP-исследования, что позволяет рассчитать объем крови в опухоли по изменению интенсивности МР-сигнала.
Рассчитанные по изменению интенсивности MP-сигнала после внутривенного введения PGC-Gd гемодинамические параметры (абсолютный объем крови в опухоли) позволяют неивазивно оценивать ранние эффекты анти-ангиогенной терапии.
В присутствии перекиси водорода и фермента-о ксиредуктазы (например, пероксидазы хрена) парамагнитный субстрат Gd-DTPA-diSer олигомеризуется с образованием продуктов, укорачивающих ТІ накапливающих их областей в большей степени, нежели мономер (эффект магнитно-резонансной амплификации).
Система конъюгатов пероксидаза хрена-антитело и глюкозоксидаза-антитело обеспечивает селективный эффект магнитно-резонансной амплификации путем доставки оксиредуктазы и генерирования Н202 in situ. Предварительная инъекция системы биоконъюгатов обеспечивает селективную олигомеризацию парамагнитного субстрата и специфичное увеличение интенсивности MP-сигнала в присутствии маркеров-мишеней in vitro и in vivo.
Новизна работы
На примере экспериментального тирозин-киназного ингибитора VEGF-рецептора второго типа показано, что разработанный МРТ-метод может применяться для оценки ранних анти-ангиогенных эффектов в ксенографтах аденокарциномы кишечника человека.
Впервые осуществлена эктопическая животная модель аденокарциноми кишечника человека.
Оптимизирована схема метода визуализации молекулярных маркеров, основанная на селективном связывании системы антитело-фермент, вызывающей олигомеризацию парамагнитного субстрата.
Впервые показана эффективность in vitro и in vivo визуализации молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза (EGFR, L6) методом магнитно-резонансной амплификации. Практическая ценность работы
Представленные в диссертационной работе методы МРТ позволяют достоверно оценивать как гемодинамические, так и молекулярные маркеры анти-ангиогенеза в опухоли.
Так, примененный MP-подход позволяет неинвазивно оценивать ранние эффекты анти-ангиогенной терапии (изменение объема крови), предшествующие морфологическим изменениям (регрессу опухоли). При внедрении в клинику данная схема позволит проводить мониторинг анти-ангиогенного лечения и корректировать терапевтическую схему, исходя из ответа конкретного пациента.
Разработанная в диссертации ортотопическая животная модель аденокарциноми ободочной кишки человека может использоваться для дальнейшего изучения этого заболевания и пре-клинических испытаний направленных против него препаратов.
Осуществленный подход к МРТ-визуализации молекулярных мишеней (магнитно-резонансная амплификация) имеет перспективы в диагностике и мониторинге лечения различных заболеваний. В частности, применение указанного метода может использоваться для типирования и «молекулярного окрашивания» раковых новообразований in vivo, для проведения испытаний новых анти-ангиогенных препаратов и определения их оптимальных доз.
Исследование ангионеза и анти-ангиогенеза, проведенное в данной работе, имеет большое значение для понимания причин, ведущих к активации этих процессов. Апробация работы
Основные результаты работы были доложены на 11 научных конференциях, в том числе на 5й ежегодной конференции Society for Molecular Imaging (SMI-2005, Кельн), на 2й международной летней школе по медицинской физике («Методы ядерной физики и ускорители в биологии и медицине», Познань, 2003), 8й, 9й и 10й Всероссийских конференциях студентов-физиков и молодых ученых (Екатеринбург, 2002; Красноярск, 2003;
Москва, 2004), а также на международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2002-2003 гг.). Принят тезис на 14ю международную конференцию International Society for Magnetic Resonance in Medicine (ISMRM-14, Сиэтл, 2006). Был сделан доклад на семинаре ЦМТС МГУ «Магнитный резонанс в биологии, химии и медицине». Публикации
По материалам диссертационной работы было опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи и 2 препринта. Структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы с постановкой задачи, описания методик теоретических расчетов и экспериментов, описания результатов, их обсуждения и выводов, а также списка цитируемой литературы. Диссертация включает 111 страниц текста, 37 рисунков и 11 таблиц. Список литературы содержит 120 наименований.
