Молекулярная организация и эволюция ДНК зонтичных подсемейства Apioideae Вальехо-Роман Кармэн Мануэльевна

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 6

1. Организация уникальных иг повторяющихся последовательностей в ДНК. растений 6

2. Эволюция геномов растений 28

3. Межгеномная дивергенция повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК-растений 34

2. Экспериментальная часть 41

1. Объекты исследования 41

2. Выделение и очистка препаратов ДНК 42

3. Получение коротких и длинных фрагментов ДНК и определение их длины 43

4. Изотопное мечение фрагментов ДНК 45

5. Определение нуклеотидного состава ДБК ж плавление препаратов ДНК. 47

6. Кинетика реассоциации ДНК 47

7. ДНК - ДНК. гибридизация в растворе

8. Таксономия семейства Umbelliferae 50

3. Результаты и обсуждение 56

1. Организация нуклеотидных последовательностей В геноме Seseli петогоsum 56

2. Молекулярная гибридизация повторяющихся и уникальных последовательностей ДІЖ Umbelliferae 65

3. Роль полиплоидии в эволюции ДНК. зонтичных 89

Выводы 95

• Эволюция геномов растений
• Выделение и очистка препаратов ДНК
• Таксономия семейства Umbelliferae
• Молекулярная гибридизация повторяющихся и уникальных последовательностей ДІЖ Umbelliferae

Введение к работе

В последнее время со всё большим успехом при разработке общей теории эволюции используются разнообразные сведения о принципах организации и эволюции генетического материала, ДНК. С неменьшим успехом эти данные, наряду с результатами изучения структур отдельных генов и первичных генопродуктов / РНК и белков /, применяются в систематике.Разные группы высших эукариот изучены в этом плане неодинаково. Причина этому заключается главным образом в том, что новые методы и подходы на первых этапах их применения исследователям казалось целесообразным применять при изучении таксонов, достаточно хорошо разработанных при помощи классических подходов. К числу их относятся и высшие растения.Можно думать, что по аналогии с другими группами высших эукариот, на основе результатов сравнительного исследования ДНК могут быть разработаны количественные критерии ранга таксонов, проведен анализ роли отдельных факторов, таких как полиплоидия, в эволюции генотипов растений.

Сложность организации геномов у изученных в настоящее время растений неодинакова. Ядра клеток растений обычно содержат больше ДНК, чем это необходимо для кодирования белков, осуществления контроля над синтезом РНК и выполнения других специфических функций. По грубым оценкам фракция "функционально активной" ДНК составляет 5-Ю % для маленьких геномов / например, генома хлопчатника, масса которого 0,8 пкг / и, возможно, даже меньшую долю для больших геномов, таких как геном ржи /8,4 пкг /. Известно, что вне зависимости от размеров, ДНК всех растений содержат уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Из-за сложности определения функций последовательностей ДНК, они характеризуются, в основном, не по их функциям, а по физико-химическим свойствам, например, по числу копий в геноме. В последние несколько лет достигнут зна-

_4- _

чительный прогресс в понимании структуры, организации и эволюции как повторяющихся, так и уникальных последовательностей ДНК в геномах высших растений, однако, еще мало известно о том, какую роль играет тот или иной тип организации нуклеотидных последовательностей в функционировании генома растительной клетки.

Настоящее исследование было начато в то время, когда наши знания о строении и механизмах эволюции геномов растений были весьма ограничениями: они были основаны главньм образом на результатах изучения нуклеотидного состава их ДНК и первых результатах опытов по гибридизации нуклеиновых кислот растений. На основе этих данных сложилось представление о необычно высокой вариабельности, выраженной видоспецифичности структур ДНК растений. Логично было предположить, что это разнообразие - следствие высоких темпов эволюции геномов растений.

Предстояло выяснить, какие молекулярные механизмы обеспечивают высокие темпы эволюции ДНК растений, более точно оценить геноти-пическую вариабельность видов в пределах таксонов разных рангов. Для этой цели мы провели изучение ДНК растений из сложного в систематическом отношении семейства зонтичных / Umbelliferae /.

Семейство зонтичных является одним из самых крупных среди цветковых растений. В нем насчитывается до 300 родов и более 3000 видов.Существующие системы зонтичных основаны главным образом на результатах сравнительно-морфологического анализа и по-разному трактуют взаимоотношения родов и таксонов более высокого ранга. Одним из главных спорных вопросов систематики зонтичных является проблема разделения этого семейства на крупные внутшсемейственные группировки: подтрибы, трибы, подсемейства. Достаточно сравнить известные классификации зонтичных / 0 Drude ,1898, Koso-Poljansky, Т9Т6, Сereeau-Ъarrival , Т962 /, чтобы убедиться, что в настоящее

- 5 -время нет общепринятого понимания отношения таксонов внутри этого семейства.Зто свидетельствует о том, что классические методы систематики не всегда позволяют на основании фендатиішческих признаков объективно выявить степень филогенетического родства видов, оценить ранг того или иного таксона. В связи с этим, нам казалось целесообразным проведение анализа филогенетических связей некоторых родов зонтичных, используя геносистематический подход, для выяснения вопроса о том, насколько степень сходства ДНК у зонтичных соответствует общепринятым иерархическим схемам соподчинения некоторых родов, подтриб, триб и подсемейств в пределах этого семейства высших растений.

- 6: -ГЛАВА І. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

І. Организация уникальных и повторяющихся последовательностей в ДНК растений.

В ДНК эукариот обычно выделяют три кинетических класса нук-леотидных последовательностей: быстро реассоциирующие, промежуточные и медленно реассоциирующие. Оценка величины медленно реассо-циирующей фракции, полученная из уравнений кинетики, обычно совпадает с оценками размера генома, полученными цитохимическими методами. Медленнее всего реассоциируют участки ДНК, представленные в геноме единичными копиями. Такие участки ДНК и принято называть уникальными последовательностями / УП /. Наличие быстрореассоции-рующего компонента указывает на то, что в геноме есть участки, концентрация которых много больше, следовательно, они должны быть многократно повторенными / Britten, Kohne , 1967, 1968 /. Такие участки называют повторяющимися последовательностями / ПП /.Группы ПП, имеющие сходную первичную структуру, принято называть семейством ПП. Чило членов такого семейства может варьировать в очень широких пределах, как и число самих семейств в геноме. Число членов семейства / частота повторяемости ш / может быть оценено величиной отношения скорости ренатурации ПП семейства к скорости ренатурации УП ДНК. В результате, ДНК может быть разделена на классы последовательностей с дискретными значениями числа членов семейств ПП. Однако, следует учесть, что такое разделение является рабочим приемом, дающим упрощенное представление о структуре генома, Определение классов последовательностей как ПП или УП является в значительной мере операциональным и зависит от условий реакции: температуры,ионной силы раствора,: размера фрагментов и ряда других факторов / Wetmur, Davidson ,1968 /. Например, при ренатурации фрагментов ДНК пшеницы при 50" С в 0,12 М Na -фосфатном буфере

- 7" -

по крайней мере, 80 % всего материала реассоциирует как ПП , тогда как при более жестких условиях инкубации - 60 С и 80 С -доля компонента, выявляемого как ПП, соответственно уменьшается до 75% и 35% /Fiavell, Smith , 1976 /. Аналогичные данные были получены при изучении ренатурации фрагментов ДНК гороха. В стандартных условиях / 60 С, 0,12 М Na-фосфатный буфер / около .30% ДНК ведет себя как УП, а при снижении температуры инкубации до 50 С, вся эта часть ДНК обнаруживается во фракции ПП / Thompson, Murray, Cuellar , 1980 /.Это является следствием того, что в геномах растений члены семейств ПП обычно не идентичны. Последовательности, реассоциирующие как УП в стандартных условиях, ведут себя как ПП при понижении температуры реассоциации.Дело в том, что часть УП / "single сору" / является на самом деле сильно диверги-ровавшими ПП. Такие последовательности получили название "ископаемых" / fossil / повторов / Murray et ai., , 1981 /.Если принимать во внимание происхождение этих последовательностей, следует считать, что доля УП, выявляемая в стандартных условиях, возможно, завышена.В геномах с малым содержанием ДНК, доля "ископаемых" повторов обычно меньше, чем в больших геномах.Эта взаимосвязь была выявлена при сравнительном изучении геномов гороха и золотистой фасоли / Thompson, Murray, 1981, Murray et al., 1981 /. По грубым оценкам, в геноме растений экспрессируется несколько тысяч генов,которые образованы ^10 нуклеотидными парами /н.п Исходя из данных по гибридизации кДНК с тотальной ядерной ДНК, большая часть РНК транскрибируется с УП. Таким образом, по крайней мере -^10 н.п» УП ДНК, вероятно, должны сохранятся как "уникальная" ДНК во всех геномах растений. Эта фракция генома получила название - "истинные" уникальные последовательности. Тот факт, что в очень маленьком геноме золотистой фасоли /0,5 пкг /

на долю единичных копий ДНК приходится 3 10 н.п., дает пред-

ставление о томнасколько велика доля "ископаемых" повторов во фракции УП в больших геномах, поскольку число структурных генов у растений с большим содержанием ДНК, вероятно, должно быть того же порядка, что и у золотистой фасоли. Поэтому не удивительно, что существенная часть УП в больших геномах происходит из эволюцион-но "старых" семейств повторов с сильно дивергировавшими членами и не осуществляет функции кодирования белков /Thompson, Murray, 1980, Murray et al., 1981 /.

В настоящее время в литературе широко используются понятия: ПП, УП, "ископаемые" повторы и "истинно уникальные" последовательности. При проведении сравнительного изучения геномов растений всегда нужно помнить, что эти понятия - чисто операциональные, что иногда может затруднить сопоставление результатов разных авторов. Тем не менее, метод реассоциации ДНК все же дает представление о степени внутригеномной гетерогенности различных семейств нуклео-тидных последовательностей, позволяет получить значительное количество информации о строении, организации и путях эволюции генетического материала высших растений. Новый подход, использующий клонирование определенных участков генома, позволяет сделать еще более четкие выводы о структуре индивидуальных семейств нуклеотидных последовательностей.

Уникальные последовательности. Среди всех эукариот наименьшая доля УП обнаруживается в ДНК высших растений.Как было показано ранее, доля их может варьировать от 17% до 60% всей ЛНК / Мирошниченко и др.,1972, Мирошниченко и др., 1974, Шнеер, Антонов, Т976, Янева, Антонов, 1976,

Wimpee, Rawson, 1979» Rimpau et al., 1978, Hake, Walbot, 1980, iValbot, Dure, 1976, Zimmermann, Goldberg, 1977, Kiper, Herzfeld, 1978, Stack, Comings, 1979» Murray et al., 1978, Murray et al., 1979» Wenzel, Hembelen 1979» Pellegrini, Goldberg, 1979, Cullis, 1981 /.

-9.-

Анализ данных, касающихся содержания доли уникальной фракции у растений с различным содержанием ДНК. на ядро, позволил выявить определенную зависимость между долей УП и размером генома /рис.1/. Эти данные получены в разных лабораториях в стандартных условиях: температура инкубации 60 С, в 0,12 М Na-фосфатном буфере РН 6,8, хроматографией на гидроксиапатите / ГАИ / для разделения одно- и двунитчатых молекул ДНК. Уникальная фракция ДНК у видов с размером генома больше 2 пкг составляет от 20% до 35%. У видов с содержанием ДНК на гаплоидный набор меньше 2 пкг, доля уникальной фракции обратно пропорциональна размеру генома. На основании представленной на рис.1 зависимости доли УП от размера генома, можно сделать заключение, что содержание ПП в маленьких геномах меньше, чем в больших. Однако, по массе абсолютное количество УП ДНК, 'обычно, но не обязательно, уменьшается 6 уменьшением размера генома. Скорость, с которой'уменьшается количество ЙГ 'замедляется в геномах, содержащих менее 2'пкг ДНК| / Elavell, 1980 /.

Ответ на вопрос о том, что представляют собой УП, как они расположены в хромосоме, какова их длина - был получен с помощью опытов по ренатурации фрагментов ДНК. различной длины. Этот методический подход, предложенный Давидсоном и др./Davidson et al.,1973. состоит в том,что при ренатурации длинных фрагментов ДНК, можно определить какая часть УП присутствует во фрагментах, содержащих ПП. Меченые фрагменты ДНК длиною от 200 н.п. до нескольких тысяч н.п. ренатурируют с избытком коротких немеченых фрагментов ДНК. Затем количественно определяется содержание ПП хроматографией на ГАПе. Ренатурацию ведут в таких условиях, чтоз лишь ПП могут взаимодействовать с комплементарными себе последовательностями, а фрагменты, содержащие только УП не реассоциируют. Во'Многих случаях не удается достичь полнопо разделения фрагментов ПП и

i

2. A A

РАЗМЄР [71ПЛОІІДНОГО ГЕНОМИ. ПКГ.

2 о

Л о⁴

Рис. І. Доля УП в ДНК. и их распределение по длине у растений с разным содержанием ДНК на гаплоидное ядро / Piaveii, I9S0 /.

Виды растении: А - золотистая фасоль / Murray et al., 1979/;

В - хлопчатник /ffalbot, Dure, 1976 /; С - соя /Goldberg, 1978,
Gurley et al., 1976 /; -D - петрушка /Kiper, Herzfeld, T978 /;

E - табак /Zimmermann,Goldberg, 1977' /; 3P- горох /Murray et al.,

1978 /;G - пшеница. /Plavell, Smith, 1976, Rimpau et al., 1978 /;

H - рожь /Rimpau et al., 1978 , Smith, Flavell, tq?? /.

диа.ЕРгнровлбинг Послов ьдтельн -с-ги

ЛНРЕГРЭПМРОЬКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

"і^пл и f

Рис. 2. Схема циклической эволюции некоксервативной часті ДНК растении / Js'lavell, 1980 /.

- її -

фрагментов, содержащих только УП. Надо учитывать, что скорость реассоциации зависит от длины фрагментов и вносить соответствующие поправки / Hinnebush et al. , 1978, Murray et al., 1978 /.

При изучении подобным образом организации УП в г&номах растений с содержанием ДНК более 2 пкг оказалось, что от 75% до 95% этих последовательностей имеют длину менееэ 2000 н.п. Более 70% оказалось длиной менее 1400 н.п. У маленьких геномов с содержанием ДНК менее -2 пкг небольшая часть УП представлена короткими последовательностями, а у основной части последовательностей длина более 4000 н.п.. Зависимость между содержанием длинных УП и общей доли УП от размера генома изученных видов представлена на рис.1. Из сопоставления двух кривых на этом рисунке следует, что; существует положительная корреляция между длиной УП и их долей в геноме. / Elavell , 1980 /. Однако, при изучении генома гороха оказалось, что длина практически всех УП, чередующихся с ПП, меньше 1000 н.п. В этой работе было показано, что средняя длина УП порядка 300 н.п. / Murray et al. , 1978 /.В дальнейших исследованиях выяснилось, что не менее:. 97% медленно реассоциирующей фракциш ДНК гороха являются "ископаемыми" повторами / Murray et al., 1981 /,

Длина повторяющихся участков ДНК, чередующихся с короткими УП, невелика и составляет в среднем несколько опт / 200 - 600 / пар нуклеотидов у всех изученных видов с большим геномом /piavell, Smith, 1976, Gurley et al. , 1979, Kiper, Herzfeld , 1978, Murray et al. ,1978, Smith, Plavell, 1977, Zimmermann, Goldberg, 1977 /. В маленьких геномах / хлопчатник, золотистая фасоль, просо /

ПОВТОРЫ, перемежающиеся С УП, имеют ДЛИНУ ^--^ 1000 Н.П. /Murray et al., 1979, Walbot, Dure ,1976, Wimpee, Hawson , 1979/. Для геномов высших растений характерно чередование единичных копий ДНК / 200 - 4000"У с короткими ПП / 50 - 2000 н.п. /.

- 12 -Например, около 80% генома хлопчатника имеет такой тип распределения последовательностей. При возрастании размера генома уменьшается часть ДНК, организованная таким образом: 40-50% в гєшоме сои / Goldberg ,1978, &urlay et al. , 1979 / и 30% в геноме ржи / Rimpau et al. , 1978 /. У животных также встречается такой тип чередования нуклеотидных последовательностей /Davidson et al.,I975/

Условия ренатурации оказывают сильное влияние на получаемую картину распределения последовательностей ДНК. Когда изучали рена-турацию ДНК пшеницы в очень жестких условиях, оказалось, что основная часть ДНК ведет себя как УП длиною 1000-4000 н.п., чередующиеся с недивергировавшими семействами ПП /Plavell, Smith , 1976 /. Эти данные показывают, что оценка длины, доли и картины распределения УП зависит от степени дивергенции семейств повторов и от использованных условий ренатурации,,

Большой интерес к фракции УП ДНК объясняется тем, что в ней находится большинство структурных генов, однако, не все , УП представляют собой участки, кодирующие белки. Доля этих участков составляет не более 1-2% для ДНК гороха / Murray et al. , 1981 Таким образом, вопрос об избыточности УП остается нерешенным. С другой стороны, известно, что многие гены растений являются членами "семейств", объединяющих структурно-функционально сходные гены.Существует несколько интересных гипотез, пытающихся объяснить это явление, которые будут рассмотрены далее.

Обращенные повторы. Бее изученные до сих пор геномы высших растений содержат обращенные повторы / инвертированные повторы, палиндромы /, кш>-рыалщэедставляют собой комплементарные последовательности, находящиеся на одной цепи и повернутые одна относительно другой на 180 . При реассоциации ДНК эти последовательности ренатурируют

- ІЗ -друг с другом, образуя "шпилечные" структуры, которые могут быть выделены хроматографией на ГАПе / "нулевая" фракция Cot < 1-0" / и изучены электронномикроскопическими методами. Если обращенные повторы / 0П / разделены другой последовательностью, то после ренатурации "ствол" шпильки заканчивается однонитчатой петлей. Для обозначения 0П, не образующих при отжиге петель, в литературе используется термин - палиндромы.

Содержание 0П составляет от 1% до 1% в геномах хлопчатника /Walbot, Dure , 1977/, пшеницы /fifeumann ,1976 /, ржи / Smith, Plaveii, 1977 /, табака / Zimmermann, Goldberg , 1977 /, СОИ /Goldberg , 1978, Gurley et al. , 1979 /, петрушки / Kiper, Herzfeld , 1.978 /, кукурузы /Hake, Walbot , 1980 /, лука / staek_: Comings , 1979 /, ЗОЛОТИСТОЙ фасоли /-Murray, .Palmer eb^J aS79 /, гороха /Murray et al., 1978 /, льна / Cullis , 1981 /.

Как показали электронномикроскопические исследования, длина шпилечного "ствола" варьирует у хлопчатника, пшеницы и кукурузы ot_l 50 н.п. / разрешающая способность ЭМ / до 1000 н.п. /H.ugaeteiaJ.J^j 1975, Bazetoux et al,, 1978,. Walbot, Dure,1976,Hake, Walbot,1980 /.

Часто 0П разделены короткими последовательностями в хромосоме; например, в ДНК пшеницы до 20% 0П имеют однонитевые петли размером 300-1500 н.п. /Bazetoux et al., , 1978 /.

Количество 0П в геноме пропорционально размеру генома. 7 пшеницы в гаплоидном наборе содержится 3 * 10 0Ш/ Neumann, 1976 /, а у хлопчатника, геном которого существенно меньше, число их 4І- Ю⁴ /Walbot, Dure , 1976 /.

Распределение 0П в хромосомах носит неслучайный характер. По крайней мере, данные хроматографии на ГАПе для ДНК пшеницы / Neumann , 1976 /,ржи / Smith, Elavell , 1977 /, хлопчатника / Walbot,Dure , 1976 /, петрушки / Kiper, Herzfeld , 1978 / и данные ЭМ-исследований для ДНК хлопчатника / Walbot, Dure , 1976 ,

_ 14 -пшеницы / Bazetoux et al. ,1978 / и кукурузы /_Hake, Walbot, 1980 / показали, что большая часть ОП организована в группы. В ДНК пшеницы и ржи группы из четырех ОП с расстоянием между цен-трами 500-1000 н.п. отдалены друг от друга на расстояние 25000 н.п. В геноме кукурузы 0П длиною 50-100 н.п. образуют!'группы из трех-четырех инвертированных повторов, чередующихся с нуклеотид-ными последовательностями порядка 1000 н.п.. Размер "шпильки" в ДНК хлопчатника 150-200 н.п.; группы из двух-трех таких 0П находятся на расстоянии менее 3000 н.п. друг от друга.

Такие группы могут быть рассеяны не по всему геному, а лишь по небольшой его части / около 20% /, как показали исследования ДНК льна / Cullis , 1981 /.

Анализируя инвертированные последовательности, надо иметь в виду, что в молекулах ДНК они могут быть расположены далеко друг от друга. Видимо, не случайно, что с увеличением длины изучаемых фрагментов ДНК, увеличиваются размеры петель.

Механизмы образования 0П в геномах эукариот пока еще не выяснены. Существует гипотеза, согласно которой в процессе эволюции геномов растений 0П могут возникать при транслокациях ПП в новые места, при которых фрагменты ПП оказываются рядом, но повернуты друг относительно друга на 180" . Однако, поскольку многие 0П встречаются в хромосомах группами, более вероятна гипотеза, объясняющая появление этих последовательностей такими процессами, как дупликация с последующей инверсией последовательностей. Такие 0П, первоначально образующие группы, затем, с течением времени, рассеиваются по геному / Eiaveir , 1980 /. .

Функциональное значение групп 0П не известно. Было показано, что часть 0П транскрибируется в составе гяРНК и _тРНК / Тарантул, Газарян, 1981 /, однако количество 0П в ДНК значи-

- 15 -тешьно больше, чем их находят в _m РНК. Существуют предположения, что ОП, находясь на концах хромосом, способствуют их репликации / Cavalier-Smith , 1974, Neumann, 1976, Holmquist, Dane is, 1979 /, но все эти гипотезы имеют спекулятивный характер. Организация, повторяющихся последовательностей.

Существенную фракцию геномов высших растений составляют блоки ПП; сюда не входят Ш, чередующиеся с УЇЇ, длинные блоки УЇЇ и обращенные повторы, Можно выделить два класса таких групп: Г) - состоящие из тандемно соединенных очень сходных повторяющихся элементов и, 2)-состоящие из различных сочетаний не сходных между собой повторяющихся последовательностей.

Примером тандемно организованных сходных Ш могут служить некоторые "сателлитные" фракции ядерной ДНК, выделяемые при равновесном ультрацентрифугировании в градиентах плотности CsCi ieridze , 1972,1975, Беридзе с соавт., 1973, lngle^I973, 1975 /.

Эти последовательности отделяются от основного компонента ДНК либо потому, что имеют иное содержание ГЦ, либо потому, что) они могут избирательно связывать лиганды / Ag⁺ , Hg⁺ или актиномицин d /в градиентах плотности CsCi или Cs₂so. /тішпііб et al., 1975, Deumling,e-f<1976, Ranjekar, ef *, 197&i/. Хотя сателлитные ДНК нередко состоят из очень длинных блоков почти идентичных повторяющихся элементов, у большинства детально изученных, таких как сателлитная ДНК дыни - Cucumis melo /Bendich, Anderson, 1974, Sinclair et al., 1975, Bendich, Taylor, 1977,, Smokler et al., 1981, Grisvard, Tuffet-Anghileri, 1980 /, томата - bycopersicon eseulentum /Chilton, 1975/, ячменя -Hordeum vulgare /Dennis et al., 1980, Ranjekar et al., 1978a/, пшеницы - Triticum aestivum / Dennis et al., 1980, /,

сои -.Glycine max „/Gurley et al., 1979 /, орхидеи - Cymbidium pumilum / Capesius et al. , 1975, Capesius, 1976 /, льна - Linum usitatissimum и тыквы - Cucumis sativus / Timmis, Ingle, 1977 /, моркови - Daucus carota / Duhrssen, Neumann, 1980 /, лимона « Citrus limon / Беридзе, 1980 /, кукурузы - Zea mays / Peacock et al. ^І981 /» ^{имеется не} Д^на повторяющаяся единица в блоках. Длина элементарной единицы в блоке может быть от нескольких пар оснований до нескольких тысяч, а число таких единиц варьирует от нескольких сотен до миллиона.

В настоящее время у некоторых сателлитных ДНК растений расшифрована последовательность нуклеотидов повторяющейся единицы и изучено расположение таких единиц в хромосоме. Примером могут служить сателлитные ДНК пшеницы и ячменя. Эти тандемно повторенные последовательности: идентичны у обоих видов и состоят из мономерных единиц ( GAA ) ( gag ) с преобладанием GAA ; длина таких полипуриновых блоков колеблется от 1300 до І80Ж нуклеотидов в каждой цепи / Dennis et al., /I98G /. Другим примером является ДНК. сателлитной кукурузы, повторяющаяся единица которой / 185 н.п. / была проклонирована в плазмиде pBR 322 Определена её полная первичная последовательность нуклеотидов. В геноме кукурузы содержится около 10. копий такой последовательности / Peacock et al., I981 /.

Использование рестрикционного анализа позволило выявить еще более сложно устроенные семейства ПП. Гетерогенность семейств последовательностей ДНК ржи была показана Бедбруком /Веаъгоок et al., '1980b/. Около 10% генома ржи состоит из четырех семейств ПП с мономерными единицами по 120, 480, 610 и 356 н.п. Эти мономерные единицы четырех семейств ПП были проклонированы и выделаны в чистом виде, был определен их точный размер. Как известно,

только применение нескольких различных рестриктаз позволяет определить размер повторяющейся единицы. 480, 610, 120 н.п. мономерные единицы содержат по одному сайту для рестриктаз МЪо И,. Tag і и Нае III. При частичном переваривании высокомолекулярной ДНК ржи этими рестриктазами, был получен набор фрагментов различной длины, начиная с длины повторяющейся единицы и кончая фрагментами большого молекулярного веса для каждого семейства повторов, причем размер фрагментов всегда являлся суммой определенного,числа мономерных единиц. Это является прямым доказательством того, что одинаковые мономерные единицы сгруппированы в длинные блоки в хромосоме. Длина таких блоков достигает 10 н.п.

Следующее доказательство существования длинных тандемных блоков, состоящих их идентичных последовательностей, могло быть получено при обработке нуклеазой ^s І ПП после ренатурации, если бы удалось получить достаточно длинные молекулы. Однако, в этих экспериментах были получены довольно короткие фрагменты длиною от 50 дб 800 н.п. у сои / Goldberg, 1978, Gurley et al., 1979/, у петрушки /Kiper, Herzfeld, 1978 /, у ржи / Smith, Flavell et al., 1977 /, у табака / Zimmermann, Goldberg, 1977 /, у пшеницы / Flavell, Smith, 1976 / и гороха / Murray et al., 1978 /.. Из этих данных было сделано заключение о том, что ПП, чередующиеся с УП, - короткие, что большая часть длинных хромосомных участков состоит из различных семейств ПП, члены которых перемежаются между собой в различных сочетаниях / Flavell _t 1980 /. Однако, следует с большой осторожностью относиться к интерпретации таких данных. Как было показано при исследовании ДНК сои /Gurley et al., 1979 / и ДНК хлопчатника /WaTbot, Dure, 19763/,при реассоциации ПП из одного семейства, члены которого сильно дивергированы, образуются дуплексы с большим количеством неспаренных оснований, кото-

- 18 -рые перевариваются нуклеазой S 1 . Следовательно, блоки идентичных ПП с высокой степенью дивергенции между его членами, могут казаться, блоками, состоящими из различных семейств ПП.Также следует иметь в виду, что, если длинные блоки идентичных ПП , находящиеся в различных хромосомах, гомологичны друг другу, то после реассоциации члены этих двух блоков будут образовывать гетеродуплексы, большая часть которых будет перевариваться нуклеазой S 1 . Примером существования отдельных тандемных блоков идентичных повторов с частичной гомологичностью являются два гена для разных 5 S РНК пшеницы / Barber, Nichols, 1978 /.

По этим причинам довольно трудно установить какая часть блоков ПП ДНК в геноме растений состоит из членов одного семейства, а какая часть из чередующихся членов различных семейств ПП. Однако, при детальном изучении структуры тандемных блоков ПП геномов злаков было показано, что участки ДНК, которые амплифици-руются с образованием длинных блоков семейств ПП, часто являются составными /Bedbrook et al., 1980 a, Bedbrook et al., 1980 Ъ , Flavell, 1980, Rimpau et al., 1978 /. Каждый член семейства ПП состоит из двух или более элементарных последовательностей. Взаиморасположение составляющих элементов было детально изучено у семи индивидуальных семейств ПП в геноме ржи / Bedbrook et al., I98Q Ъ /, пять из которых оказались сложными. Первое семейство является :__._.- простым и состоит из последовательностей длиною в 120 н.п. Другое семейство, с повторяющейся единицей в 480 н.п., состоит из участка в 230 н.п. и двух близких последовательностей по 130 н.п. Семейство в 610 н.п. состоит из последовательности в 270 н.п. и трех тандемно организованных последовательностей по 120 н.п. Авторы предлагают модель образования таких сложных семейств, считая, что предковая последовательность имела длину в 120 н.п., в

процессе эволюции происходило встраивание между ними других последовательностей, которые затем амплифицировались, давая тандемно организованные сложные семейства ПП /Eimpau et al., 1978 /.

Как было показано при изучении длинных блоков ПП, они могут быть локализованы в различных хромосомах и в различных транскрип-ционно инертных участках, таких, как конденсированный, центромер-ный и интерстициальный гетерохроматиновый районы хромосом / Bedbrook et al., "I98Q а,Ъ , Dennis et al., 1980, Gerlach,

Peacock, 1980, Pearson et al., 1954 /. В области ядрышкового организатора локализованы тандемно расположенные гены рибосомаль-ных РНК/ Pardue, Gall, 1975, Phillips et al., 1971 /. Все данные о структуре и локализации таких групп ПП свидетельствуют о том, что они непосредственно не участвуют в кодировании клеточных белков. В основном все предполагаемые функции такого типа последовательностей связывают с поддержанием структурной целостности хромосом, стабилизацией центромер, а также узнаванием гомологичных хромосом при мейозе, контролем за размером и содержанием ДНК в ядре / Holmquist, Dancis, 1979, Bennett ,19Н 1972 /.

Типы чередования нуклеотидных последовательностей.

Исследование взаимного расположения коротких и длинных повторяющихся последовательностей и уникальных последовательностей в геномах растений и других эукариот позволили выделить два основных типа чередования нуклеотидных последовательностей : короткого и длинного. Короткий период характеризуется чередованием коротких ПП / 200-400 н.п. / с УП длиною менее 2000 н.п.; длинный период характеризуется чередованием УП и ПП длиною несколько тысяч пар оснований. Эти два типа чередования последовательностей могут по- разному сочетаться в геноме. Известны геномы, в которых сочетаются и короткий и длинный периоды чередования / Flaveli,

- 20 ~ Smith, 1976, Gurley et al., 1978, Kiper, Herzfeld, Г978, Тарантул и др. 1982 /. Существуют геномы только с коротким периодом чередования, например у гороха / Murray et al., 1978 / и только с длинным периодом чередования, например, у льна / Cullis, 1981 /. Б геноме золотистой фасоли представлен весь спектр различных типов чередования последовательностей /Murray et al.,I979 /., Тип чередования нуклеотидных последовательностей не может служить таксономическим признаком. Известны случаи, когда у -близкородственных видов геномы имеют различные периоды чередования последовательностей / горох - золотистая фасоль /. Правда, удается выявить взаимосвязь между количеством ДНК и типом чередования УП и ПП. По мере увеличения размера генома уменьшается длина Ш и уменьшается доля длинных ПП, а количество коротких ПП увеличивается. Существование различных типов чередования последовательностей скорее всего отражает особенности механизмов образования тех или иных групп последовательностей.

Внутригеномная дивергенция семейств нуклеотидных последовательностей.

После ТОГО, как были открыты ПП / Britten, Kohne, 1968 / была предложена модель эволюции геномов, согласно которой ПП возникают в результате "скачкообразных" амплификации, а большая часть УП образуется за счет накопления нуклеотидных замен из ПП.

Бендич И Андерсон /Bendich, Anderson, 1977 /, исследуя геномы ячменя, нарцисса и двух видов папоротников, показали, что' семейства ПП могут быть гомогенными и гетерогенными. Гомогенными были названы семейства ПП, которые произошли от одной предковой последовательности. После амплификации такой последовательности! все члены семейства в процессе эволюции накапливают точечные мутации; в результате, они имеют одинаковую степень дивергенции

- 21 -всех членов относительно предковой последовательности.Еетеро-генные семейства образуются при повторной амплификации членов дивергирующих семейств ПП, тогда как часть членов семейства будут сильно дивергировавшие ПП, а часть, вновь амплифицированные, будут относительно мало дивергированы. Гомогенные семейства ПП были найдены в геноме папоротника Thelipteris normalis /Bouchard, Swift, 1977 /. Оказалось, что у двух видов одного_ подсемейства - гороха и золотистой фасоли -, которые различаются по содержанию ДНК в девять раз, различается и организация ДНК: ПП гороха образуют гетерогенные семейства, а у золотистой фасоли в ДНК преобладают гомогенные семейства ПП. Авторы / Preisler, Thompson, 1981 / объясняют эти различия тем, что скорость амплификации была выше у ДНК гороха, и, что это характерно в целом для больших геномов с большим содержанием ПП, а у маленьких геномов, таких, как геном золотистой фасоли, скорость амплиг-фикации ниже и меньше общее количество ПП.

То, что новые семейства ПП образуются путем амплификации блоков уже существовавших ПП и рядом находящихся последовательностей было доказано при изучении клонированных семейств ПП ржи /Bedbrook et al., 1980b /.

Оказалось, что предковая последовательность в 120 н.п. входит в различные семейства, которые сохраняют эту гомологичную последовательность. Причем, в пределах одного блока ПП могут соседствовать члены индивидуальных семейств в различных комбинациях. В процессе рекомбинаций и транслокаций такие сегменты ДНК будут распределяться по новым участкам как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами / Bedbrook et al., 1980 Ъ /.

Изучение геномов злаков показало, что у разных видов составные семейства ПП различны, но у них есть некоторые общие после-

- 22.-довательности. Это объясняет, почему близкие виды имеют гомологичные последовательности, представленные в различных сложных семействах ПП.Эти гомологичные участки могут быть представлены разным числом копий у близкородственных видов /Flavell et ai.X979,

лішраи, Smith, Flavell, 1978,1980 /. Некоторые последовало тельности у одного вида ржи имеют ICL копий, а у другого -

порядка 50. Одной из причин могут служить делеции, происходящие в процессе эволюции. Таким образом, ПП представлены, как правило, одинаковым набором семейств, однако, количественные соотношения этих семейств могут варьировать в широких пределах. Число членов в "молодых" семействах оказывается больше, чем в "старых". Анализ, количества членов гомологичных семейств ПП у близких видов злаков указывает на то, что семейства с большим числом членов образовались после дивергенции видов от предкового вида.

Члены старых семейств ПП в процессе эволюции накапливали нуклеотидные замены. Результатом этого процесса является образование "ископаемых повторов", которые в стандартных условиях реассоциации ведут себя как УП, а при менее жестких условиях инкубации реассоциируют быстрее, попадая в класс ПП, но при этом образуют дуплексы с большим количеством неспаренных оснований. Например, в геноме гороха до 90% УЛ. длиной .-ЗО н.п. представлены "ископаемыми повторами". Наиболее вероятным представляется объяснение появления таких последовательностей у одних видов и отсутствие их у близких в таксономическом отношении видов различием в частоте амплификации. Чем выше скорость амплификации в эволюции генома, тем больше доля "ископаемых повторов в нём / Murray et al., 1978 /. Оказалось также, что "ископаемые повторы" обнаруживаются у видов с большим геномом и коротким периодом чередования последовательностей, а у видов с маленьким геномом и длинным периодом чередования такие последо-

~ 23; -

вательности не были обнаружены / Murray et al., ,1978,1979 /. Таким образом, удалось показать, что существует определенная зависимость между размером генома, долей "ископаемых повторов" и типом чередования нуклеотидных последовательностей ДНК.

Основная часть ДНК," особенно в больших геномах, вероятнее всего, прямо не участвует в обеспечении жизненноважных функций организма^ может быстро эволюционировать.в то же время, небольшая часть генома, в которой возникающие мутации элиминируются отбором, будет в процессе эволюции образовывать консервативную фракцию ДНК. Сюда относятся структурные гены, ответственные за синтез клеточных белков, представленные, как правило, немногочисленными копиями, и тандемно организованные гены гистонов, рРНК и 5 s рРНК. К консервативным принадлежат промоторные, термина-торные и другие последовательности, выполняющие регуляторные функции.

В последнее время, появились работы, в которых изучались организация и экспрессия структурных генов растений /Goldberg et al.,I978, Kiper et al., 1979, Sullivan et al., 1981, Murray, Thompson, 1980 /. Было использовано два методических подхода для определения количества экспрессируемых генов. Числсю различных типов последовательностей, представленных в тРНК полисом петрушки и табака, определяли, измеряя скорость гибридизации ДНК, комплементарную к mРНК / к ДНК /, с большим избытком клеточной РНК. или гибридизируя следовые количества ядерной меченой уникальной ДНК с избытком суммарной клеточной РНК. Оценки,полученные двумя методами, различаются: одним методом выявлено от 10.000 до 15.000 молекул РНК, а другим - от 25.000 до 35.000. Число РЖ , выделеннЫл из полисом ячменя , равнялось 33.000 / Heinze et al., 1980 /. Таким ,обра-зом> если

ЕЖ/ снимаемая с полисом, есть матричная РНК,, то число молекул m РНК, будет равно числу, экспрессируемых генов. Были приведены доводы, что корректно минимальное значение - 15.000 генов /Kiper, 1979/.

Считается, что средний размер молекул m РНК, - порядка 1200 н.п. Если имеется около 15.000 генов на гаплоидный набор и каждая тРНК является копией только одного гена, то около: 1,8 10 пар оснований ДНК. кодируют специфические последовательности mPHK /Plavell, 1980 /. Покрытосеменные растения с маленьким размером генома / Arabidopsis / образованы из

ТО

2 'ID- н.п. J-хотя известны виды с размером генома 8 ' ICL н.п.

/Bennett, Smith, I97S/. Отсюда следует, что доля ДНК, кодирующая тЕНК^ составляет лишь малую часть всего генома. Дла ДНК гороха эта доля не превышает L-2% / Murray et ai., 1981 /. До сих пор было выделено и охарактеризовано лишь несколько структурных генов растений. Одной из первых появилась работа, где были выделены и проклонированы два леггемоглобиновых гена сои / Sullivan et аі., 1981 /. Они не являются генами растительного ядра, а вносятся при заражении соответствующими видами Bhizobium , Эти два гена существенно отличаются друг от друга, и в одном из них имеется интрон. Эти гены встречаются на определенном участке ДНК длиной более чем 3Q.0001 н.п.

Затем было показано, что группы сходных генов определяют синтез запасных белков кукурузы, Зезгаа и так называемого

ASG - белка /Lewis et al., I981, Hagen, Rubenstein, 1981, ^Esen et al., 1982, larkins et al., 1983, Burr, Burr, 1982 /. Различия между отдельными членами семейства зеиновых генов находят, в основном , в той части их молекул, где имеются повторяющиеся аминокислотные последовательности / Redersen, 1982 /.

Аналогичные данные получены при изучении запасного белка фасоли фазеолина /Sun et ai., I981 /, легумина гороха /croy etai., 1-982./,гордеина ячменя / Forde et al., 1981 / и ряда других белков / Brisson, Verma, 1982, Goldberg et al., 1983,. Meagher et al., І983 /, в том числе и фарментов растений,'/Hart, langston, 1977, Gottlieb, 1977 /.Стелень сходства первичных структур индивидуальных генов в пределах этих семейств варьирует в широких пределах.

Некоторые консервативные повторяющиеся последовательности генома растений изучены довольно хорошо. Методом молекулярного клонирования ДНК растений в бактериях были выделены индивидуальные гены 18 S , 5,8 S и 25 S рибосомальных РНК пшеницы, ячменя / Gerlach, Bedbrook, 1979 / и сои / Varsanyi-Breiner et al., 1979/. Несколлко генов 5LS рибосомальной РНК пшеницы были не только проклонированы, но и полностью была определена последовательность нуклеотидов в этих клонах / Gerlach, Dyer, 1980/.

В геномах растений гены рибосомных РНК представлены тысячами копий / Ingle et al., 1975 /. Цистроны г РНК локализованы в гетерохроматиновых сегментах ядрышкового организатора, где они образуют группы из тандемно расположенных г ДНК. генов. Эти участки иногда видны как уплотнения метафазных хромосом, но могут быть также картированы при гибридизации in situ, при использовании в качестве зондов ^{1 5}Х или % рибосомальных РНК / Pardue, Gall, 1975 /. Число групп этих генов варьирует как внутри одного вида, так и между различными видами растений /Cullis, Davies, 1975, Plavell, Smith, 1974, Phillips et al., 1971 /. Анализ клонированныхгеноыРНК пшеницы и ячменя выявил гетерогенность повторяющихся блоков по дли-

не. J пшеницы сорта Chinese Spring гены г ДНК представлены блоками длиною 8,8 т.н.п., но существует небольшая фракция., у которой размер блока 8. т*н.п.. У линии ячменя Sultan размер г ДНК может быть 9 т.н.п. и 10 т.н.п. / Gerlach, Bedbrook, 1979 /. Эти два вида блоков цистронов грнк отличаются, по видимому, размерами нетранскрибируемого спейсера. Повторяющаяся единица для гДНК у сои сорта Prize имеет длину порядка 7,8 т.н.п. и все блоки имеют одну и ту же длину. Подобными блоками представлены гены г ДНК у пшеницы и ржи / Varsanyi-Breiner et al., 1979 /. Можно сделать вывод, что существуют внутри- и межвидовые отличия как по длине НЄКОДД-v рующей ДНК, так и по числу копий г ДНК в геномах растений.

У раЗЛИЧНЫХ ГенОТрофОВ ЛЬНа /binum usitatissimum /

различающихся по количеству гДНК_т кодирующая 18 S и 25 S гРНК состоит из тандемных блоков, построенных их повторяющихся единиц длиною 8,6 т.н.п.. Показана идентичность гддк у этик генотрофов по размеру повторяющейся единицы, по числу и положению сайтов рестрикции. Таким образом, различия в количестве гДНК у двух генотрофов льна не являются результатом изменений в определенном типе повторяющихся единиц /Goldsbraugh, Cullis, 1981 /.

Известно, что транскрипция гДНК РНК-полимеразой начинается с точки проксимальной к 5¹ концу 18 S РНК посла-довательности, затем, через ген 5,8 s РНК и ген 25 s РНК и заканчивается после гена 25 s РНК. Гигантский первичный транскрипт затем процессируется, в результате получаются 18 s , 5,8 s и 25 s РНК / Сох, Turnock , 1973 /. Можно предполагать, что участок ДНК перед 18 S РНК геном содержит участок, узнаваемый РНК-полимеразой, и сигнал для терминации тран -

- 27 -скрипции после конца гена для 25 S РНК, Некоторая информация

об организации последовательностей, осуществляющих регуляцию транскрипции, была получена при изучении генов 5s г РНК пшеницы. Эти гены были проклонированы в бактериальных плазмидах и полностью определена первичная последовательность нуклеотидов у двух, различающихся по длине повторяющейся единицы, цистронов 5 s г РНК. Оказалось, что гены 5S г РНК собраны в группы из тан-демно расположенных повторяющихся единиц, подобно большинству рибосомных генов. В геноме пшеницы выявлена внутригеномная гетерогенность длины повторяющихся единиц. Одна из повторяющихся единиц состоит из 410 н.п., а другая - из 500 н.п.. Оказалось возможным локализовать кодирующую 5 s г РНК последовательность длиною в 118 н.п., так как известна полная первичная последовательность нуклеОТИДОВ ДЛЯ 5 S РНК / ВагЪег, Nichols, 1978 /. Эта последовательность длиною 118 н.п. очень консервативна у разных видов растений / Pa^ne, Dyer, 1979 /. Прямое определение нуклеотиднои последовательности у четырех генов 5s гРНК показало, что кодирующие РНК участки почти одинаковы. Исключение составила дупликация в 15 н.п. в кодирующей области у повторяющейся единицы длиною в 500 н.п. Такое изменение в кодирующей последовательности приводит к тому, что она уже не транскрибируется. Участки в 70 н.п. перед 5' концом кодирующей последовательности имеют 90% гомологии у двух семейств 5) S гРНК генов. Остальная, некодирующая часть спейсерной ДНК у двух семейств 5 s г РНК сильно варьирует как по длине, так и по последовательности нуклеотидов / Gerlach, Dyer, , 1980 /. На основании того, что известно об организации 5S г РНК и других генов у животных и дрожжей /^ederoff, 1979, Gannon et al., 1979, Korn, Brown, 1978 /, можно предположить, что наиболее консервативный участок в 70 н.п., примыкающий к началу структур-

- 28 _

ного гена, содержит промотор, последовательность, узнаваемую РНК-полимеразой III или последовательности,определяющие правильную инициацию транскрипции? Особенно интересно, что участок от 29 до 25 нуклеотида перед началом кодирующей части имеет последовательность ATAAG . Очень похожие последовательности найдены в том же положении от 5¹ конца кодирующей области у ЖИВОТНЫХ И дрожжей / Federoff, 1979, Gannon et al., 1979, Korn, Brown, 1979 /. Непосредственно за 5S rPHK кодирующей частью следует блок из 14 или 17 AT н.п. с преобладанием ти-мина в некодирующей цепи ДНК. Эта последовательность служит сигналом терминации транскрипции РНК / Federoff, 1979, Korn, Brown, 1978 /.Эти работы по изучению организации генов растений позволяют предполагать, что структура кодирующей части и окружающие её последовательности играют важную роль в осуществлении контроля экспрессии генов. И, несмотря на то, что рибо-сомные гены отличаются от других генов растений многократной повторенностью, вероятно, что консервативные участки, выявленные для этих генов, будут найдены и у структурных генов, кодирующих белки растений.

2. Эволюция геномов растений.

Итак, геном растений организован из разных групп последовательностей ДНК, которые изменяются с различной скоростью в процессе эволюции. Некоторая часть ДНК, мутации в которой элиминируются отбором, остается высоко консервативной. Сюда, пови-димому, входят структурные гены и их регуляторные зоны. Остальная часть ПП и УП может существенно изменяться в ходе эволюции.

Геном растений отличается от геномов других эукариот тем, что содержание ДНК на ядро у разных видов варьирует более чем в 100 раз, и практически не существует корреляции между содер-

жанием ДНК и положением таксонов в системе. Например, данные, суммированные Беннетом и др. /Bennett, Smith, 1976 /, указывают на 26-кратное различие в содержании ДНК в пределах одного семейства Leguminosae Большие различия, которые наблюдаются в содержании ДНК на ядро, в картине чередования нуклеотидных последовательностей, в содержании ПП и УП, возможно, объясняются тем, что значительная часть последовательностей может быстро эволюционировать независимо от других частей генома. В настоящее время известно три механизма, объясняющих возникновение этой части ДНК.

Первый из них предложили Бриттен и Кон /Britten, Konhe, 1968 /. Согласно их гипотезе, ПП возникают в результате "скачко-образных"'репликаций". В какой-то момент происходит амплификация отдельных последовательностей, в результате образуются тандемно расположенные идентичные последовательности. Эти группы последовательностей ДНК затем дивергируют и распространяются по геному.

Второй путь связан с перераспределением генетического материала кариотипа при неравном кроссинговере, транслокациях и делециях некоторых участков хромосом /Pincham, Sastry, 1974 /.

Третий путь - это гибридизация и полиплоидизация, процессы, играющие важную роль особенно в эволюции покрытосеменных растений / Ehrendorfer, 1976 /.

В эволюции геномов большую роль играют и противоположные процессы: амплификации сопровождаются делениями, за полиплоиди-зацией часто следует диплоидизация генома путем хромосомных перестроек / Ehrendorfer, 1976, Smith, Flavell, 1974 /.

Одна из циклических моделей эволюции ДНК /jjaavell, 1980 /, основанная на экспериментальных данных, касающихся структуры и организации быстро эволюционирующих нуклеотидных последователь-

- зо -

ностей генома растений, приведена на рис. 2 / Elaveii, ,1980 /. Согласно этой модели, существенная часть / 50% / всего генома состоит из коротких ПП, чередующихся с УЇЇ / ПП-УП-ПП-УП / или их перемежающихся между сабой различных Ш / ПП-Шг-ШР /, которые образовались за счет перемещений и перегруппировок коротких ПП или путем дивергенции из групп ПП. Если амплифицирует-ся сегмент ДНК длиною в несколько сотен н.п. в одном из таких участков, то с большой вероятностью в этот процесс могут вовлекаться примыкающие друг к другу последовательности. Возникшее таким образом новое семейство будет составлено из тандемно расположенных сложных повторяющихся единиц. / ПП-ПП -ПП-ПП /. Если амшифицируется короткий участок внутри УП или внутри уже существующей повторяющейся единицы, то образуется группа тандемно организованных простых повторов/ПП-ПП-ПП /. После амплификации, члены семейств ПП начинают дивергировать, а также подвергаются транслокациям и перестановкам, в результате чего происходит распространение возникшего чередования последовательностей по геному.

Существование разных типов чередования нуклеотидных последовательностей подтверждается многими экспериментальными данными. Изучение картины распределения ПП и УП у двух близких видов / горох, золотистая фасоль /, сильно различающихся содержанием ДНК, указывает на то, что, возможно, не существует прямой зависимости между типом чередования последовательностей и сложностью организма /Thompson et al., 1980 /, Несомненно также, что упорядоченное расположение ПП и УП в хромосомах должно иметь определенный функциональный смысл. Флавелл / Elavell, 1980 / предложил гипотезу, согласно которой определенный тип чередования коротких последовательностей некодирующей ДНК., обеспечивает структурную уникальность каждого сегмента хромосомы. Каждая хро-

- ЗІ -

мосома и многие короткие участки хромосом должны обладать такой уникальной структурой, которая сможет обеспечить в нормальных диплоидных клетках безошибочное узнавание сегментами гомологичных хромосом только друг друга при мейозе. Хотя эту гипотезу трудно проверить экспкрименталыю, ценность её состоит в том, что она объясняет чередование нуклеотидных последовательностей в геноме эукариот с точки зрения универсальной функции, которая определяется типом чередования, а не специфическими функциями последовательностей. Тип чередования УП и ПП может быстро меняться в процессе эволюции, не нарушая структурную уникальность отдельных сегментов ДНК.

Важной составной частью эволюции ДНК. являются амплификации некоторых последовательностей ДНК. Тот факт, что амплификации могут происходить периодически в щ&ессе эволюции геномов растений, был прямо показан Флавеллом и др. / Flavell et ai., 1980 /. Амплификации, приводящие к образованию значительных количеств ПП в ДНК, не являются единственным фактором, определяющим большие различия в содержании ДНК у растении.

Уменьшение количества ДНК в геноме может сопровождаться специализацией видов / Hinegardner, 1976 /. Фактором, определяющим уменьшение количества ДНК.в геноме, являются делеции групп последовательностей. Анализ экспериментальных данных по организации последовательностей ДНК видов рода Atriplex / Вelford, Thompson, 1981a »1981 b / указывает на то, что делеции могут затрагивать различные группы последовательностей ДНК в геномах высших растений в процессе видообразования. Многие различия, которые накапливаются в хромосомах в процессе видообразования, могут объясняться амплифакацией различных последовательностей и / или делецией сегментов ДНК, тогда как структурные гены бу-

дут оставаться относительно стабильными / Rimpau et al., 1978, Himpau et al., 1980 /.Гипотеза эволюции геномов, предложенная Томпсоном и Мюрреем / Thompson, Murray, 1981 /, основана на предположении, что частота и величина амплификации и делеций является главной переменной величиной в различных эволюционных ветвях, а дивергенция последовательностей за счет мутаций происходит с относительно постоянной скоростью. Размер генома в таком случае будет определяться равновесием между скоростью амплификации и делеций в эволюционной истории генома. Чем больше геном,

.і, тем больше в нём относительная доля быстро эволюционирующей за счет амплификации, делеций и транслокаций "избыточной" ДНК. Различия в скорости амплификации и делеций / "скорость оборота" - turnover / у отдельных организмов будут обуславливать различия в организации нуклеотидных последовательностей ДНК. Согласно этой гипотезе скорость "оборота" в геномах растений выше, чем у животных и амплификации имеют тенденцию происходить чаще, увеличивая количество ПЇЇ на единицу "исходной" ДНК. Эта достаточно спекулятивная гипотеза помогает представить почему у растений, как группы, геномы имеют тенденцию быть больше и более вариабельными по размеру, чем геномы животных.

Третьим путем увеличения количества ДНК на клетку является полиплоидия.

Полиплоидными называют клетки, особи, популяции, содержащие три или более набора хромосом / геномов /. Полиплоидии принадлежит важная роль в эволюции, о чем свидетельствует её широкое распространение в природе, особенно среди покрытосеменных растений. Она встречается и у других растений: у зеленых и бурых водорослей / Sarma, Ranjee, 1971 /, папоротников / Cole, Г967 /.По подсчетам Стеббинса /stebbins, 1971 / до 35$~покры—

тосеменных растений представлены естественными полиплоидами, а во многих быстро эволюционирующих порядках их доля еще выше и достигает 80% / Зосимович, 1974 /. Все это указывает на то, что полиплоидия является одним из важнейших факторов микроэволюции

Anglospermae

Полиплоиды могут формироваться разными путями и, в зависимости от своей природы, подразделяться на автополиплоиды, алло-полиплоиды, сегментные аллополиплоиды и автоаллополиплоиды / Stebbins, 1956 /.

Примером сложного естественного аллополиплоида может служить мягкая пшеница, содержащая геномы однозернянки - Tr. mono-coccum / геном А / и двух видов эгилопсов - Aegilops Speltоides / геном В / и Aegilops squarrosa / геном D / /Sax, 1922, Sears, 1941, Riley, Bell, 1959/. Было показано, что у этих видов уровень гомологии ДНК довольно высок / Янева, Антонов, 1977, Elaveii et al., 1979 /.

Одна из характерных особенностей полиплоидов - их повышенная устойчивость к действию ионизирующего излучения. Это свойство полиплоидов, открытое Л.Стадлером / Stadler, 1929 /, проявляется в меньшем влиянии облучения на угнетение роста и развития, на снижении плодовитости, на выживаемость облученных растений.

Отмечено также снижение чувствительности полиплоидов к мутагенному действию алкилирующих агентов. Согласно Стадлеру / stadler, 1929 /, наличие большого числа повторяющихся генов у полиплоидов способствует тому, что нарушения, возникающие в одном из этих генов, не проявляются.

До недавнего времени ничего не было известно о характере изменении в ДНК, происходящих при полиплоидизации геномов. Необходимо дальнейшее изучение полиплоидии различными методами, вклю-

чая методы молекулярной биологии, поскольку все проявления ' - свойств полиплоидов определяются прежде всего генетической информацией, которая заключена в последовательностях нуклеоти-дов ДНК.

3. Межгеномная дивергенция Ш1 и Ш ДНК растений..

Очень немного известно о том, как связаны между собой видообразование и дивергенция отдельных групп последовательностей ДНК, особенно у растений.

Теоретически, с момента дивергенции двух популяций, иными словами с момента возникновения генетической изоляции, в ДНК начинают накапливаться различия. Эти различия обусловлены ампли-фикациями и делениями некоторых участков ДНК и накоплением точечных мутаций, которое выражается в замене отдельных пар оснований нуклеотидов. Если делеции и амплификации нуклеотидных последовательностей ДНК. _являются редкими, крупными, случайными событиями, то накопление нуклеотидных замен есть результат относительно частых, мелких, случайных событий. Поскольку этих событий на миллион лет приходится много, в силу закона больших чисел можно говорить о скорости этого процесса,/ Wilson et al., 1977 /. Таким образом, количество накопленных нуклеотидных замен у двух видов будет прямо пропорционально времени, прошедшему с момента дивергенции этих видов от общего предкового вида. Для оценки вклада различных мутационных процессов в степень дивергенции повторяющихся и уникальных последовательностей обычно применяется метод ДНК-ДНК гибридизации.

Суть этого метода заключается в том, что денатурированные ДНК разного происхождения реассоциируют совместно. Оценивая эффективность образования гибридных молекул в такой гетерологичной реакции с результатами реассоциации гомологичных молекул, можно

судить о степени сходства и различий полинуклеоидных последовательностей ДНК разных организмов. Истинные оценки уровня дивер-генцифогут быть получены только путем прямого сопоставления полных первичных нуклеотидных последовательностей ДНК растений, что в настоящее время неосуществимо. Оценки уровня дивергенции, получаемые методом гибридизации, зависят от условий проведения реакции и от характера взаимодействующих фракций. Мерой дивергенции могут служить два параметра: количествр образующихся гибридных молекул / в % от гомологичной реакции / и их термостабильность - понижение средней точки температуры плавления гибридных дуплексов ( л Т пл. ) Оба показателя зависят от скорости фиксации точечных мутации, то есть от количества накопленных нуклеотидных замен. При определении процента гомологии учитывается вклад и таких процессов как амплификации и делеции ДНК.

Метод гибридизации был впервые применен для сравнения бактериальных ДНК / Schildkraut et al., 1963 /, а вскоре были проведены первые опыты по молекуляоной гибридизации ДНК растений /'Bendich, Bolton, 1967, Dutta et al., 1967 /, которые показали, что у представителей из более близких родов образуется больше гибридных дуплексов ДНК, чем у видов из отдаленных родов, а также, что ДНК из разных порядков покрытосеменных растений имеют до 10% гомологичных последовательностей. Однако, как показали более поздние работы, эти оценки следует считать завышенными. И тем не менее, уже первые работы дали важную информацию о том, что степень сходства в ДНК покрытосеменных у филогенетически отдаленных видов очень мала, что говорит в пользу гипотезы о высокой скорости эволюции геномов растений / Антонов и др., 1972., Антонов, 1974 /.

Следует отметить, что при интерпретации данных по молеку-

лярной гибридизации необходимо учитывать ряд факторов : I) условия проведения реакции; 2) сложность организации геномов растений, где,кроме УП, существуют различные семейства ПП, различающиеся как по количеству числа членов, так и по степени комплементарности в пределах одного генома; 3) размер сопоставляемых геномов и сравниваемых фракции ДНК.

Учитывая влияние этих факторов, можно с известной долей вероятности оценивать скорость межгеномной дивергенции УП и ПП ДНК в процентах накопленных нуклеотидыых замен за единицу времени. Из рассмотренных ранее данных о сложной организации УП и ПП ДНК растений следует, что накопление нуклеотидных замен не будет постоянной величиной для функционально различных последовательностей ДНК. Так, для оценки степени дивергенции давно эволюционирующих независимо групп желательно сравнивать наиболее, консервативные последовательности ДНК с низкой скоростью фиксации точечных мутаций., а при исследовании микроэволюционных процессов - наиболее быстро эволюционирующие последовательности ДНК. Однако, следует иметь в виду, что оценки степени межгеномной дивергенции, полученные для отдельных фракции ДНК, вряд ли можно сопоставлять при построении филогенетических схем.

За последние годи появился ряд работ, посвященных изучению степени межгеномной дивергенции, выполненных методом гибридизации на индивидуальных ПП и УП ДНК как в пределах отдельных родов - bathyrus / Rees, Narayan, , 1977 /, Allium /Ranjekar et al., 1978 /, Atriplex /Belford, Thompson, I98I"b,^a/, так и отдельных семейств - Compositae /Bachmann, Price, 1977 /, Gramineae /ilavell et al., 1977, Flavell et al., 1980 / покрытосеменных растений.

Изучение гибридизации ДНК нескоьких видов из рода bath jrus с разным содержанием ДНК на ядро, показало значи-

тельную дивергенцию повторяющихся и уникальных нуклеотидных последовательностей ДНК / Narayan, Rees , 1977 /. Скорость накопления нуклеотидных замен во фракциях умеренных повторов и уникальных последовательностей оказалась одного порядка. Высокая скорость дивергенции УII монет служить косвенным подтверждением того, что лишь незначительная часть УП осуществляет функции кодирования белков, а существенная часть УП может являться "ископаемыми" повторами. Результаты гибридизации УП позволили выявить положительную корреляцию между снижением го-мологичности во фракции УП в ДНК видов iathyrus и уменьшением количества ДНК на ядро, при относительно постоянной доли УП в ДНК сравниваемых видов.

Гибридизация ДНК четырех видов злаков - пшеницы, ржи, ячменя и овса - показала, что филогенетические отношения между этими видами, установленные на основе полученных данных, согласуются с теми, которые были установлены систематиками при рассмотрении многих фенотипических признаков / Elavell et ai., 1977 /. Было установлено, что в геномах исследованных растений существует несколько групп ПП, одни из которых присутствуют в ДНК всех четырех злаков, а другие - только у отдельных видов. Авторы предполагают, что появление новых групп ПП совпадает с дивергенцией видов злаков. С точки зрения авторов, от общего предкового вида первым дивергировал предок овса. На более поздних этапах эволюции дивергировал предок ячменя, а затем от общего предка произошла дивергенция пшеницы и ржи. Эта филогенетическая модель основана на том, что семейства ПП, появляющиеся в процессе амплификации отдельных последовательностей на определенных этапах эволюции, сохраняются в ДНК всех четырех видов злаков, дивергирующих затем на более поздних стадиях видообра-

зования / tflavell et al., 1980 /.

Сравнение отдельных фракции ДНК, методом гибридизации было использовано для уточнения филогенетических отношений трех видов папоротников - Osmunda cinnamomea, O.claytoniana И O.regalis /"Stein et al., 1979 /. Анализ термостабильности гибридных дуплексов ПП и УП ДНК.позволил сделать вывод о том, что как по гомологичности, так и по количеству накопленных нуклеотидных замен O.regalis и 0.cinnamomea в равной степени дивергиро-вали от O.claytoniana . Была предложена филогенетическая схема, согласно которой, все три вида папоротников разошлись от общего предкового вида практически одновременно. Наличие палеонтологических данных дало возможность оценить скорость дивергенции УП ДНК папоротников, которая оказалась соизмеримой со скоростью дивергенции ДНК приматов. При гибридизации ПП были получены данные, которые позволили предположить, что процесс видообразования сопровождался амплификацией предсуществовавших ПП и, что скорость амплификации в эволюции папоротников была ниже, чем у покрытосеменных растений / Stein et al.,I979 /.

Изучение степени дивергенции УП ДНК восьми видов рода Atriplex / Belford, Thompson, 1981а / позволило авторам сделать вывод о том, что эволюция геномов сопровождалась делениями значительных участков ДНК. Эти результаты были использованы для решения одного из спорных вопросов систематики рода Atriplex . Был сделан вывод о монофилетичности происхождения, связанного с фиксацией С^ - пути фотосинтеза /Belford,Thompson, Г981Ъ /.

Известно, что в пределах одного таксона разница в содержании ДНК на клетку связана с вариацией в количестве ПП, тогда

Как КОЛИЧеСТВО УП ОСТаеТСЯ ОТНОСИТелЬНО ПОСТОЯННЫМ /Narayan,

Rees, 1977, Bedhrook et al., 1980a/. Однако, различие в

содержании ДНК у двух родов растений - Lathyrus И Lolium оказалось связанным с вариацией как ІЇЇІ, так и УЇЇ ДНК /Hutchinson et al., 1980 /. Вместе с тем, в пределах каждого рода существует строгая корреляция между количеством ПЇЇ и УП в "дополнительной" ДНК. Отношение ПП и УП в "дополнительной" ДНК остается постоянным в пределах каждого рода растений. Это характерно также для амфибий, беспозвоночных и млекопитающих, где это отношение варьирует от 0,3 ДО 12,3 /Hutchinson et al., 1980 /. На основании этих данных делается вывод о том, что процесс видообразования может быть связан с отдельной специфической фракцией ДНК.

В нашей лаборатории проводились работы, в которых данные сравнительного изучения первичной структуры ДНК растений использовались для решения некоторых спорных вопросов систематики. Первые работы были проведены на "модельных" системах, под которыми подразумеваются таксоны, хорошо разработанные классической систематикой.

Методом молекулярной гибридизации была изучена группа видов растений из нескольких родов семейства Tridaceae / Шнеер, Антонов, 1975 /. Была выявлена значительная вариабельность гомологичности ДНК видов, принадлежащих, к разным таксонам, что позволило оценить степень родства таксонов ранга рода, подрода и секции. Полученные результаты свидетельствуют о существовании обособленных групп видов, связанных разной степенью родства, в основном согласующиеся с мнением систематиков, которые рассматривают многочисленные фенотипические признаки.

Сравнение первичных структур ДНК. видов родов Triticum и Aegilops указывает на значительное сходство их геномов, что может служить аргументом в пользу мнения тех систематиков, которые предлагают объединить эти два рода в один. Интересно отме-

тить, что особенно высок уровень гомологичности ДНК эгилопсов с ДНК диплоидных пшениц / 92-98% /; этот уровень снижается по мере увеличения плоидности пшениц / до 87-57% /. Весьма вероятно, что уменьшение количества гомологичных последовательностей является отражением тех изменений, которые происходят в ДНК в процессе полиплоидизации геномов / Янева, Антонов, 1976 /.

Эти работы продемонстрировали целесообразность использования методов геносистематикж⁷ для решения спорных вопросов систематики / Антонов, 1973,1974 /. Сравнение первичных структур ДНК разных видов методом молекулярной гибридизации и кинетики реассоциации может давать информацию о степени и скорости дивергенции сравниваемых геномов и, следовательно, о родстве сравниваемых форм и об их систематическом положении.

Анализ однодольных, проведенный в нашей лаборатории / Шнеер, Антонов, 1975, Янева, Антонов, 1976 /, дал результаты, хорошо согласующиеся с представлениями систематиков. Это позволило нам перейти от исследования "модельных" систем к практической работе с более сложными группами растений.

В качестве объекта настоящего исследования было выбрано семейство Umbelliferae - одно из самых сложных в таксономическом отношении среди семейств цветковых растений.

В задачу настоящего исследования входило, используя методы геносистематики / кинетика реассоциации, гибридизация индивидуальных фракции ДНК с последующим определением термостабильности гибридных дуплексов/, сравнить темпы дивергенции отдельных фракций ДНК видов, связанных разной степенью родства и попытаться оценить роль полиплоидии в эволюции растений.

.-41 ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Материалы и методы. I.Объекты исследования. Список видов растений, использованных в работе. Систематическое положение видов дано в работе согласно классификации О.Друде/ Drude , 1898/. Семейство Umbelliferae

подсемейство

триба

Saniculoideae Saniculeae
Apioideae Scandiceae

Smyrnieae

Ammineae

Eryngium giganteum Bieb. Anthriscus glacialis lipsky Anthriscus ruprechtii Boiss. Smyrniopsis aucheri Boiss. Lecokia cretica DC Prangos pabularia lindl. Elaeosticta hirtula /Regel et Schmalh, Kljukov,M.Pimen et V.Tichomirov/ Bupleurum aureum J^isch. Pimpinella anthriscoides Boiss. Siella erecta /Huds./ M.Pimen. Seseli condensatum /L/ Reichnb.

Seseli mucronatum /Schrenk/ M.Pimen. et

Sdobn.

Seseli libanotis /L/ Koch

Seseli nemorosum /Когоv./ M.Pimen.

laraligusticum discolor /Ledeb./ V.'i'icho

mirov

Peucedaneae Conioselinum latifolium Rupr.

Angelica komorovii /Sch.isch./V.Iichomiro' Ferula kokanica Hegel et Schmalh. Peucedanum latifolium Bieb. Pastinaceae Heracleum lehmannianum Bunge

baserpitieae Laserpitium latifolium L»

бл-лио¹ *'-.;>

С С (- У

им. в. и. ^p;_:--j.

- 42 -Материал для исследования собран на участке систематики зонтичных Ботанического сада МГУ , где выращивались растения, привезенные из районов их естественного распространения / Средняя Азия, Украина, Казахстан /. Этот материал любезно предоставил М.Г.Пименов.

2. Выделение и очистка препаратов ДНК.

Препараты ДНК выделяли фосфатно-мочевинным методом / Britten et ai., 1974 /. Молодые листья тщательно промывали 1% додецилсульфатом и многократно дистиллированной водой, затем листья измельчали в жидком азоте в высокоскоростном гомогенизаторе типа " Blender " при 107000 об./мин. в течение 5 минут. К одному объему измельченной ткани добавляли 4 объема буферного раствора следующего состава: 10 М мочевина, 0,3 М натрий-фосфатный буфер РН 6,8, 1,25 М КаСЮд г 22.,5 тМ ЭДТА_ и добавляли 20% раствор додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1%. Лизис ткани проводили при 60 С в течение Г часа. По окончании лизиса проводили депротеинизацию ДНК смесью хлороформ - изоамиловый спирт / 24 : Г / 20 минут и центрифугировали на центрифуге К-23 при 4.000 об./мин. 20 минут.

Верхний водный слой, содержащий экстрагированную ДНК, наносили на колонку с гидроксиапатитом / ГАП /. ГАП готовили по принятому в нашей лаборатории способу / Петров, 1980 /, который является сочетанием методов приготовления гранулированного ГАПа / Mazin et ai., , 1974 / и лабораторного варианта крупномасштабного способа /Atkinson et ai., 1973 /. На Г мл ГАП, уравновешенного раствором 8 М мочевины с 0,24 М натрий-фосфатным буфером РН 6,8, наносили не более 9 мл водной фазы обычно сильно окрашенной пигментами. Колонку промывали сначала раствором 8 М мочевины с 0,24 Na -фосфатным буфером РН 6 „8 ,1 М

NaCiO. и I/o sds , которым хорошо смываются примеси пигментов. Затем колонку промьшали 10 объемами 8 М мочевины с 0,24 М

Na-фосфатным буфером РН 6,8 до исчезновения поглощения при 260 нм, после чего через колонку пропускали 10 объемов 0,01 М Na -фосфатного буфера РН 6,8 для удаления мочевины. ДНК элюиро-вали с колонки при 80 С 0,5 М ФБ. Из фосфатного буфера ДНК осаждали, добавляя раствор 0,4 М NaCl с 1% цетавлоном / цетил-триметиламмоний бромистый / из расчета : 4 мг цетавлона на Г мг ДНК / Сулимова и др. 1976 /. Осадок собирали центрифугированием, промьшали несколько раз водой, затем раствором 0,6 М ацетата натрия в 70% этиловом спирте и окончательно - 70% этиловым спиртом. Препараты ДНК под спиртом хранили на холоде. Выход составлял 2-3 мг ДНК на 10 гр молодых листьев. Судя по физико-химическим свойствам ^{/ S}20,w = 20 S ; Е_2б0 / B_2QQ =2,0 ; E_26Q / Е^ = 2,2 ; гиперхронизм 25% /, использованный метод позволяет получить высо-коочищенные препараты. Хотя в литературе имеются указания, что при этом комплексе методов препараты ДНК могут иметь полисахарид-ные примеси? /Murray, Thompson, 1977, Мирошниченко, Дьяченко, 1981 /, наши опыты по аналитическому ультрацентрифугированию ДНК в градиенте плотности CsCi их не выявили, что свидетельствует о хорошей очистке от полисахаридов.

3_± Получение коротких и длинных фрагментов ДНК

и определение их длины.

Короткие фрагменты ДНК длиною 300-500 нуклеотидов получали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-І / СССР / или ультразвуковом дезинтеграторе фирмы " MSE " / Англия /. Чтобы уменьшить возможность химических повреждений, раствор ДНК перед обработкой дезаэрировали в вакуум-эксикаторе, а затем насыщали азотом. Дезинтегрирование во всех случаях проводили, охлаждая раствор ДНК

_ 44 -в бане со льдом. Раствор ДНК. с концентрацией 560-1000 мкг/мл в 0,3 М ацетате Na или 0,IZM ФБ / N а-фосфатный буфер РН 6,8 / объемом 20 мл озвучивали трижды по 5 минут при минимальной мощности и частоте 22 килогерц на УЗДН-І. Фрагментировали ДНК на ультразвуковом дезинтеграторе "MSE " / Англия / 21 минуту /3x7/ при мощности 200-250 ватт и частоте 21 килогерц. Полученные фрагменты осаждали изопропанолом и подвергали дополнительной очистке.

Для приготовления длинных фрагментов ДНК применяли гомогенизатор производства ПНР, тип 302 / Петров, 1980 /. Раствор ДНК. в 0,3 ацетате jua или в 0,12 М ФБ с концентрацией 500 мкг/мл обрабатывали при охлаждении в течение 15-30 минут при 10.000-12.000 оборотов в минуту, Таким образом получали фрагменты ДНК длиной Г500-2000 нуклеотидов.

Определение длины фрагментов немеченой ДНК проводили с помощью аналитического улътрацентрифугирования в центрифуге " . Spinco" модель Е / США / со сканирующей приставкой и монохроматором. Центрифугирование проводили в щелочном растворе 0,9 М NaCl, 0,1 М NaOH, / рн Т2 /, при концентрации ДНК 10 мкг/мл. Молекулярный вес фрагментов вычисляли по формуле ^s20,w = »528 х М⁰'⁴⁰⁶ / Studier, 1965 /.

Окончательную очистку немеченых длинных и коротких фрагмен-товтов ДНК проводили хроматографией на колонках с ГАПом. Через колонки с необходимым колрічєством оксиапатита, расчитанным исходя из его ёмкости, щзи комнатной температуре пропускали раствор фрагментов ДНК в 0,12 М ФБ. Затем вымывали ыесвязавшиися материал 0,12 М ФБ до исчезновения поглощения. Короткие фрагменты элюиро-вали с колонки 0,4 М или 0,5 М ФБ. Длинные фрагменты смъюали 0,12 М ФБ, повышая температуру колонки до 97 С. Фрагменты ДНК

осаждали цетавлоном. Осадок собирали центрифугированием, промывали водой и раствором 0,6 М ацетата натрия в 70% этаноле. Фрагменты в 70% этиловом спирте хранили на холоде.

4. Изотопное мечение фрагментов ДНК

Метилирование фрагментов ДНК. Метилирование Фрагментов ДНК с помощью метилаз из E.Coli проводили по методу Нестеренко с соавт. / Нестеренко и др.,1979 /, используя в качестве донора метальной группы S-аденозил-Ь

І метил- НІ- метионин ( SAM ) . Для получения меченых фрагментов смесь объемом 0,150 мл, содержащую 15 мгк фрагментов ДНК, 20 тМ калий фосфатного буфера РН 7,8, 7 тМ 2-меркаптоэтанола, 10 m М ЭДТА, 3,3 ткМ SAM , 60 мкл Е_со ДАМ, 30 мкл E_CQ R1 инкубировали 3 часа при 37 С и затем 15 часов при комнатной температуре. По окончании инкубации, к инкубационной смеси добавляли 2 объема 10 М мочевины с 0,3 М ФБ РН 6,8 и пропускали через колонку с 0,3 мл ГАПа, уравновешенную 8 М мочевиной с 0,24 М ФБ РН 6,8 при комнатной температуре, промьюали 5 объемами / по 0,3 мл/ буфера, содержащего 8 М мочевину с 0,24 М фосфатным буфером, затем вымывали мочевину 0,01 М ФБ и элюировали меченые фрагменты ДНК 5 порциями по 0,3 мл ФБ. Меченые таким образом фрагменты ДНК Seseli петогоsum имели удельную активность 520.000 имп./мин. на I мкг ДНК. Все просчеты радиоактивности меченой тритием ДІЖ проводили на счетчиках "Mark і", "Mark III" /Nuclear Chicago США /. Образцы осаждали цетавлоном и добавляли диоксановый сцинтиллятор ЖС-8 в соотношении 10 : I и просчитывали в гомогенной системе; эффективность счета 30%.

Йодирование фрагментов ДІЖ.

Йодирование фрагментов ДНК из разных видов зонтичных проводили ПО Модифицированному Методу КоММерфорда / Commerford, 1971,

Orosz, Wetmur, 1974, Prensky, 1976 /. 20 мкг ДНК в 0,5 мл де-ионизированной воды денатурировали нагреванием и быстро охлаждали на ледяной бане. Реакционную смесь объемом 0,75 мл , содержащую денатурированные фрагменты ДНК, 1,5 mKu ¹²5 _т 2,5 * 10⁴ М KI , 15 * Ю"⁴М Тісі₃ в 0,14 М ацетатном буфере РН 5,о, инкубировали 20 минут при 60 С. Останавливали реакцию подщелачиванием среды 0,25 мл I М ацетата амлония РН 9,0. Затем нагревали йодированную ДНК до 60 С при РН 9,0 в течение 20 минут, чтобы перевести промежуточные 5 йод-6 окси- 5,6 дигидро-производные цитозина в 5-йодцитозин. После инкубации доводили концентрацию фосфата в смеси до 0,01 М, наносили её на термостатированную /60 С / колонку с 0,3 мл ГАПа и пропускали смесь через колонку с ГАПом, уравновешенным 0,01 фосфатным буфером. Несвязавшийся I отмывали 10 объемами / по 0,3 мя / буфера, содержащего 0,01 М ФБ и элюировали ДНК 5 объемами 0,4 М ФБ дробно по 0,3 мл. Удельная активность меченых фрагментов ДНК состав-ляла 2-5 * 10 имп./мин. на I Мкг ДНК. Эффективность счета - 60%. Измерение 'радиоактивности проводили на счетчике "Gamma-Guard 150" / Франция /.

Длину меченых фрагментов ДНК определяли ультрацентрифугированием в щелочном линейном градиенте концентрации сахарозы / 5-20% / при РН 12 в центрифуге "Spinco Ъ" / США /, ротор

⁰ г /

SW -50, 16 часов при 5 С, со_скоростью 41.000 об./мин., используя в качестве маркера немеченые фрагменты ДНК известной длины. Градиенты фракционировали со дна с помощью перистальтического насоса и определяли во фракциях оптическую плотность и радиоактивность. Коэффициент седиментации рассчитывали относительно маркера по таблицам Мак Эвена / Мс Ewen, 1967 /. Размер меченых тритием или -¹ С фрагментов ДНК определяли гель-фильтрацией на

колонках 0,6 х 50 см с СЬ - 4В сефарозой, уравновешенных буфером, содержащим 0,3 М NaCl +0,1» NaOH ;_: каждую фракцию нейтрализовали 1,85 М NaH₂P0₄ в качестве маркера добавляли немеченые фрагменты ДНК длиною 200 нуклеотидсв, предварительно охарактеризованные с помощью аналитического ультрацентрифугирования. Во фракциях определяли оптическую плотность и радиоактивность. Во всех случаях сколько-нибудь заметной деградации фрагментов ДНК в ходе мечения не происходило, так как коэффициенты седиментации немеченых и меченых фрагментов ДНК были одинаковы.

5. Определение нуклеотидного состава ДНК и плавление

препаратов ДНК.

Нуклеотидный состав ДНК определяли хроматографически с помощью жидкостного хроматографа высокого давления "Varian" / США. / после гидролиза высушенных осадков ДНК 85% муравьиной кислотой при t 175 С в течение 30 минут в запаянных ампулах.

Кривые плавления снимали на спектрофотометрах SP -700 или S2 -800 "Unicam" / Англия /, снабженных нагревающим устройством и термопарой для измерения температуры непосредственно в кювете.

6. Кинетика реассоциации ДНК.

Измерение кинетики реассоциации меченой ДНК. проводили с помощью хроматографии на колонке с оксиапатитом. Для удаления ионов тяжелых металлов все буферы и реакционные смеси пропускали через колонки с "Лигандес Е" / Венгрия /, уравновешенные соответствую-

щим буфером. Н - меченые фрагменты ДНК Seseli петого sum смешивали с немеченой ДНК того же вида. Апиквоты фрагментов ДНК де-

натурировали при 106 С 6 минут и инкубировали до различных

значений Cot /Со - начальная концентрация ДНК в молях нуклеотидов на литр, t - время инкубации з секундах /в 0,12 М ФБ или в 0,41 М ФБ, который ускоряет реакцию ренатурации в

5" раз / Britten et al., 1974 /. Время инкубации необходимое для отжига до разных значений Cot определялось концентрацией фрагментов ДНК и расчитывалось, исходя из того, что при концентрации ДНК 83 мкг/мл значение Cot = I достигается за I час. Величины Cot рассчитывали по немеченой ДНК.

Реакционная смесь состояла из Н меченых и немеченых фрагментов ДНК S.nemorosum / 10 мкг /, в которую добавляли I мкг

С меченой ДНК Е.соїі в качестве внутреннего стандарта. Аликвоты реакционной, смеси инкубировали в стеклянных запаянных капиллярах. Объем проб 3-50 мкл. Температура инкубации в 0,12 М ФБ - 60 С, а в 0,41 М ФБ - 64 С. Реакцию останавливали быстрым охлаждением в смеси жидкого азота с ацетоном; пробы хранили в замороженном состоянии до разделения. Перед разделением в пробах доводили концентрацию ФБ до 0,12 М, добавляли балластную ДНК для уменьшения неспецифического связывания и фракционировали на колонках объемом 0,3 мл ГАП, уравновешенных 0,12 М ФБ при

температуре 60 С. Несвязавшуюся однонитчатую ДНК снимали 5' объемами / по 0,3 мл / буфера, содержащего 0,12 М ФБ при 60 С, реассоциировавшую ДНК элюировали 5 объемами /по 0,3 мл / буфера,

содержащего 0,12 М ФБ при 97 С. Количество одно- и двунитчатой ДНК определяли по меченой ДНК. К элюатам добавляли 1% цетавлон, диоксановый сцинтиллятор и проводили просчет радиоактивности в гомогенной системе. Эффективность счета по тритию равнялась 25%, а по углероду - 60%.

Кинетические кривые получали, откладывая долю реассоцииро-ванной ДНК в % против соответствующего значения Cot в логарифмической шкале. Кинетические кривые анализировали с помощью БЭСМ-6 до программе, составленной Дубовицким В.А.

7. ДНК.-ДНК гибридизация в растворе.

Меченые фрагменты ДНК разделяли по скорости реассоциации на различные фракции. Гибридизацию выделенных фракций меченой ДНК с тотальной ДНК разных видов вели в растворе при соотношении меченой ДНК. от 1:2500 до 1:5000. В опыт брали 20-50 мкг немеченой ДНК и меченой ДНК от 30.000 до 40.000 имп./мин. / 0,01 мкг /. В опытах по изучению гомологии повторяющихся последовательностей ДНК инкубации вели до значений Cot і и 100, а уникальных последовательностей до Cot - 10.000. Гибридизацию проводили в 0,12 М ФБ, 0,4 М ФБ или в 0,01 М ФБ, содержащем 0,00Г М ЭДТА и Г М NaCl /Britten et al., Г974 /. Параллельно, для учета самореассоциации меченых фрагментов ставили пробы, содер-жащие Н ДНК и фрагменты бактериальной ДНК в таких же соотношениях, как во всех реакциях. Смеси инкубировали в запаянных капиллярах до нужных значений Cot л замораживали в смеси из жидкого азота с ацетоном. Перед нанесением пробы размораживали, доводили в них концентрацию до 0,2 М ФБ с 8 М мочевиной / РН 6,8 / Инкубационную смесь наносили на колонки с 0,3 мл гидроксиапатита в 0,2 М ФБ с 8 М мочевиной и элюировали однонитчатую ДНК этим же Буфером при 40 С. Анализ термостабильности гибридных молекул проводили в том же буфере, ступенчато повышая температуру колонок от 40 С до 80 С с интервалом в 3-5 . После нагрева колонки ' до определенной температуры, её выдерживали 10 минут и элюировали денатурированную ДНК прогретым до температуры колонки буфером. В выделенных при термоэлгации фракциях определяли количество меченой ДНК при каждой данной температуре; на основании этого вычисляли общее количество связавшейся меченой ДНК и температуру плавления гибридных гомологичных и гетерологичных дуплексов.

S. Таксономія семейства Umbelliferae.

Прежде чем перейти к рассмотрению наших результатов, мы сочли целесообразным кратко остановиться на положении в систематике семейства Umbelliferae , которое было объектом нашего исследования.

Семейство Umbelliferae является одним из самых крупных и сложных в таксономическом отношении среди цветковых растений. В нём насчитывается до 300 родов и более 3000 видов. Подразделение Umbelliferae на надродовые таксоны было предложено в работах Друде / Drude , 1898 /, Козо-Полянского / 1916 / и Серсо-Ларри-валь / Cerceau - 1arrival, 1962 /.

Наиболее распространенная в настоящее время система принадлежит О.Друде. Семейство зонтичных обычно делят на три подсемейства / 0.Drude, 1898 / и целый ряд триб, основываясь главным образом на строении плодов. Наиболее приближающееся к аралиевым и иногда выделяемое в особое семейство - подсемейство Hydrocoty-loideae подразделяется на две трибы. Тридцать родов и четыреста видов подсемейства распространены преимущественно в южном полушарии, многие в горах тропиков. Второе подсемейство - Sanicu -loideae тоже делится на две трибы. Оно включает в себя девять родов и около трехсот видов.И, наконец, третье подсемейство -Apioideae ₅ собственно зонтичные или сельдерейные :_

j представлено многочисленными родами и видами, растущими почти исключительно во знетропических странах северного полушария.

Б.М. Козо-Полянский /uoso-Poljansky, 1916 / критиковал эту систему и в 1915 году предложил свею оригинальную систему, лишь отчасти основанную на работах Калестани /Calestani, 1905 /. В Г962 году была опубликована система Серсо-Ларривалъ /Cerceau-Ьarrival, 1962 /, в основе которой лежит анализ признаков

- 51 -пыльцы и проростков. Она дает иную группировку родов, чем в системах Друде и Козо-Полянского. Таксономическое положение изученных нами видов представлено в таблицах I, 2, 3.

В системе Друде / таблица $1/ наши объекты относятся к подсемействам Saniculoideae / I вид / И Apioideae / IS _видов /f в последнем подсемействе - к трибам Scandiceae, Smyrnieae, Ammineae, Peucedaneae, Pastinaceae, Laserpitieae.

В системе Козо-Полянского / таблица 2 / наши объекты при
надлежат к подсемейству Ligusticoideae _f к пяти "легионам":
Exomestomae, Pachystereomae, Cyclocrystallinae, Endotaenieae,
Gymnomestomae и к восьми трибам:Pastinaceae, Ligusticeae,

Caucaleae, Saniculeae, Lecokieae, Critmeae, Peucedaneae, Careae.

В системе Серсо-Ларриваль 15' видов / положение остальных не определено / распространены по четырем подсемействам: Bupleuroideae, Endressioideae, Eryngioideae, Apioideae И двенадцати трибам?ир1еигеае, Ammineae, Scandicineae, Capno-philleae, Laserpitieae, Eryngieae, Heteromorpheae, Pimpinel-leae, Cachrydeae, Heracleae, Angeliceae, Peucedaneae.

Из представленных здесь таблиц Г, 2, 3 - ясно видно, что в
настоящее время нет общепринятого понимания отношения таксонов
/ родов, триб / внутри этого семейства, особенно в подсемействе
Apioideae . Существующие классификации /Drude, 1898,

Koso-Poljansky, 1916,С ereeau-Ьarrival, 1962 /, построенные на чисто морфологической основе дают противоречивую трактовку этих отношений, содержат, наряду с естественными, много явно искусственных, выделенных на основе единичных признаков, групп. Попытки комплексного синтетического исследования крупных родов дают значительно более естественные группировки, однако отношения между крупными родами и, тем более, трибами пока остаются не раскрытыми. Привлечение к решению таксономических проблем

таблица I.

Таксономическое положение изученных видов зонтичных в системе с последующими уточнениями /"Флора СССР", 1950, 1951 /.

O.Drude / 1898 /

аОДСемеиСТВО

триба

вид

Saniculeideae Apioideae

Saniculeae Scandiceae

Smyrnieae Ammineae

Peucedaneae

Pastinaceae Laserpitieae

Eryngiurn giganteum Antiiriscus glacialis Anthriscus ruprechtii Smyrniopsis aucheri Lecokia cretica Prangos pabularia Elaeosticta Mrtula Bupleurum aureum Pimpinella anthriscoides Siella erecta Seseli libanotis Seseli nemorosum Paraligusticum discolor Conioselinum latifolium Angelica komarovii Ferula kokanica Peucedanum latifolium Heracleum lehmannianum Laserpitium latifolium

СЛ J\3

таблица 2. Таксономическое положение изученных видов зонтичных в системе М.Б.Козо-Иолянского / Koso-Poljansky, 1916 /

таблица 3. Таксономическое положение изученных видов зонтичных в системе M.-Th.Cerceau-Larrival / 1962 /

подсемейство

триба

вид

Bupleuroideae Endressioideae

Eryngoideae Apioideae

Bupleureae

Ammineae

Scandicineae

Capnophylleae Laserpitieae Eryngieae Heteromorplfae

Pimpinelleae

Cachrydeae

Heracleae

Angeliceae

Peucedaneae

Bupleurum

Paraligusticum

Anthriscus

Anthriscus

Ferula

Laserpitium

Eryngium

Siella

Seseli

Seseli

Pimpinella

Prangos

Heracleum

Angelica

Peucedanum

aureum

discolor

glacialis

ruprechtii

kokanica

latifolium

giganteum

erecta

libanotis

nemorosum

anthriscoides

pabularia

lehmannianum

komarovii

latifolium

Umbelliferae информации о низкомолекулярных соединениях оказалось наиболее продуктивным в систематике крупных полиморфных родов, например, Angelica Ъ., SeseliL., Ferula Ъ.. Однако, те же исследования выявили широкое распространение параллелизма химических признаков. Построение общей системы семейства, отражающей современный уровень его¹ исследования, остается поэтому задачей будущего и вряд ли будет возможно без учета результатов сравнительного изучения ДНК.

Эволюция геномов растений

Итак, геном растений организован из разных групп последовательностей ДНК, которые изменяются с различной скоростью в процессе эволюции. Некоторая часть ДНК, мутации в которой элиминируются отбором, остается высоко консервативной. Сюда, пови-димому, входят структурные гены и их регуляторные зоны. Остальная часть ПП и УП может существенно изменяться в ходе эволюции. Геном растений отличается от геномов других эукариот тем, что содержание ДНК на ядро у разных видов варьирует более чем в 100 раз, и практически не существует корреляции между содержанием ДНК и положением таксонов в системе. Например, данные, суммированные Беннетом и др. /Bennett, Smith, 1976 /, указывают на 26-кратное различие в содержании ДНК в пределах одного семейства Leguminosae Большие различия, которые наблюдаются в содержании ДНК на ядро, в картине чередования нуклеотидных последовательностей, в содержании ПП и УП, возможно, объясняются тем, что значительная часть последовательностей может быстро эволюционировать независимо от других частей генома. В настоящее время известно три механизма, объясняющих возникновение этой части ДНК. Первый из них предложили Бриттен и Кон /Britten, Konhe, 1968 /. Согласно их гипотезе, ПП возникают в результате "скачко-образных" репликаций". В какой-то момент происходит амплификация отдельных последовательностей, в результате образуются тандемно расположенные идентичные последовательности. Эти группы последовательностей ДНК затем дивергируют и распространяются по геному. Второй путь связан с перераспределением генетического материала кариотипа при неравном кроссинговере, транслокациях и делециях некоторых участков хромосом /Pincham, Sastry, 1974 Третий путь - это гибридизация и полиплоидизация, процессы, играющие важную роль особенно в эволюции покрытосеменных растений / Ehrendorfer, 1976 /. В эволюции геномов большую роль играют и противоположные процессы: амплификации сопровождаются делениями, за полиплоиди-зацией часто следует диплоидизация генома путем хромосомных перестроек / Ehrendorfer, 1976, Smith, Flavell, 1974 /. Одна из циклических моделей эволюции ДНК /jjaavell, 1980 /, основанная на экспериментальных данных, касающихся структуры и организации быстро эволюционирующих нуклеотидных последователностей генома растений, приведена на рис. 2 / Elaveii, ,1980 /. Согласно этой модели, существенная часть / 50% / всего генома состоит из коротких ПП, чередующихся с УЇЇ / ПП-УП-ПП-УП / или их перемежающихся между сабой различных Ш / ПП-Шг-ШР /, которые образовались за счет перемещений и перегруппировок коротких ПП или путем дивергенции из групп ПП.

Если амплифицирует-ся сегмент ДНК длиною в несколько сотен н.п. в одном из таких участков, то с большой вероятностью в этот процесс могут вовлекаться примыкающие друг к другу последовательности. Возникшее таким образом новое семейство будет составлено из тандемно расположенных сложных повторяющихся единиц. / ПП-ПП -ПП-ПП /. Если амшифицируется короткий участок внутри УП или внутри уже существующей повторяющейся единицы, то образуется группа тандемно организованных простых повторов/ПП-ПП-ПП /. После амплификации, члены семейств ПП начинают дивергировать, а также подвергаются транслокациям и перестановкам, в результате чего происходит распространение возникшего чередования последовательностей по геному. Существование разных типов чередования нуклеотидных последовательностей подтверждается многими экспериментальными данными. Изучение картины распределения ПП и УП у двух близких видов / горох, золотистая фасоль /, сильно различающихся содержанием ДНК, указывает на то, что, возможно, не существует прямой зависимости между типом чередования последовательностей и сложностью организма /Thompson et al., 1980 /, Несомненно также, что упорядоченное расположение ПП и УП в хромосомах должно иметь определенный функциональный смысл. Флавелл / Elavell, 1980 / предложил гипотезу, согласно которой определенный тип чередования коротких последовательностей некодирующей ДНК., обеспечивает структурную уникальность каждого сегмента хромосомы. Каждая хромосома и многие короткие участки хромосом должны обладать такой уникальной структурой, которая сможет обеспечить в нормальных диплоидных клетках безошибочное узнавание сегментами гомологичных хромосом только друг друга при мейозе. Хотя эту гипотезу трудно проверить экспкрименталыю, ценность её состоит в том, что она объясняет чередование нуклеотидных последовательностей в геноме эукариот с точки зрения универсальной функции, которая определяется типом чередования, а не специфическими функциями последовательностей. Тип чередования УП и ПП может быстро меняться в процессе эволюции, не нарушая структурную уникальность отдельных сегментов ДНК. Важной составной частью эволюции ДНК. являются амплификации некоторых последовательностей ДНК. Тот факт, что амплификации могут происходить периодически в щ&ессе эволюции геномов растений, был прямо показан Флавеллом и др. / Flavell et ai., 1980 /. Амплификации, приводящие к образованию значительных количеств ПП в ДНК, не являются единственным фактором, определяющим большие различия в содержании ДНК у растении. Уменьшение количества ДНК в геноме может сопровождаться специализацией видов / Hinegardner, 1976 /. Фактором, определяющим уменьшение количества ДНК.в геноме, являются делеции групп последовательностей.

Анализ экспериментальных данных по организации последовательностей ДНК видов рода Atriplex / Вelford, Thompson, 1981a »1981 b / указывает на то, что делеции могут затрагивать различные группы последовательностей ДНК в геномах высших растений в процессе видообразования. Многие различия, которые накапливаются в хромосомах в процессе видообразования, могут объясняться амплифакацией различных последовательностей и / или делецией сегментов ДНК, тогда как структурные гены будут оставаться относительно стабильными / Rimpau et al., 1978, Himpau et al., 1980 /.Гипотеза эволюции геномов, предложенная Томпсоном и Мюрреем / Thompson, Murray, 1981 /, основана на предположении, что частота и величина амплификации и делеций является главной переменной величиной в различных эволюционных ветвях, а дивергенция последовательностей за счет мутаций происходит с относительно постоянной скоростью. Размер генома в таком случае будет определяться равновесием между скоростью амплификации и делеций в эволюционной истории генома. Чем больше геном, .І, тем больше в нём относительная доля быстро эволюционирующей за счет амплификации, делеций и транслокаций "избыточной" ДНК. Различия в скорости амплификации и делеций / "скорость оборота" - turnover / у отдельных организмов будут обуславливать различия в организации нуклеотидных последовательностей ДНК. Согласно этой гипотезе скорость "оборота" в геномах растений выше, чем у животных и амплификации имеют тенденцию происходить чаще, увеличивая количество ПЇЇ на единицу "исходной" ДНК. Эта достаточно спекулятивная гипотеза помогает представить почему у растений, как группы, геномы имеют тенденцию быть больше и более вариабельными по размеру, чем геномы животных. Третьим путем увеличения количества ДНК на клетку является полиплоидия. Полиплоидными называют клетки, особи, популяции, содержащие три или более набора хромосом / геномов /. Полиплоидии принадлежит важная роль в эволюции, о чем свидетельствует её широкое распространение в природе, особенно среди покрытосеменных растений. Она встречается и у других растений: у зеленых и бурых водорослей / Sarma, Ranjee, 1971 /, папоротников / Cole, Г967 /.По подсчетам Стеббинса /stebbins, 1971 / до 35$ покры— тосеменных растений представлены естественными полиплоидами, а во многих быстро эволюционирующих порядках их доля еще выше и достигает 80% / Зосимович, 1974 /.

Выделение и очистка препаратов ДНК

Препараты ДНК выделяли фосфатно-мочевинным методом / Britten et ai., 1974 /. Молодые листья тщательно промывали 1% додецилсульфатом и многократно дистиллированной водой, затем листья измельчали в жидком азоте в высокоскоростном гомогенизаторе типа " Blender " при 107000 об./мин. в течение 5 минут. К одному объему измельченной ткани добавляли 4 объема буферного раствора следующего состава: 10 М мочевина, 0,3 М натрий-фосфатный буфер РН 6,8, 1,25 М КаСЮд г 22.,5 тМ ЭДТА_ и добавляли 20% раствор додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1%. Лизис ткани проводили при 60 С в течение Г часа. По окончании лизиса проводили депротеинизацию ДНК смесью хлороформ - изоамиловый спирт / 24 : Г / 20 минут и центрифугировали на центрифуге К-23 при 4.000 об./мин. 20 минут. Верхний водный слой, содержащий экстрагированную ДНК, наносили на колонку с гидроксиапатитом / ГАП /. ГАП готовили по принятому в нашей лаборатории способу / Петров, 1980 /, который является сочетанием методов приготовления гранулированного ГАПа / Mazin et ai., , 1974 / и лабораторного варианта крупномасштабного способа /Atkinson et ai., 1973 /. На Г мл ГАП, уравновешенного раствором 8 М мочевины с 0,24 М натрий-фосфатным буфером РН 6,8, наносили не более 9 мл водной фазы обычно сильно окрашенной пигментами. Колонку промывали сначала раствором 8 М мочевины с 0,24 Na -фосфатным буфером РН 6 „8 ,1 М NaCiO. и I/o SDS , которым хорошо смываются примеси пигментов. Затем колонку промьшали 10 объемами 8 М мочевины с 0,24 М Na-фосфатным буфером РН 6,8 до исчезновения поглощения при 260 нм, после чего через колонку пропускали 10 объемов 0,01 М Na -фосфатного буфера РН 6,8 для удаления мочевины. ДНК элюиро-вали с колонки при 80 С 0,5 М ФБ. Из фосфатного буфера ДНК осаждали, добавляя раствор 0,4 М NaCl с 1% цетавлоном / цетил-триметиламмоний бромистый / из расчета : 4 мг цетавлона на Г мг ДНК / Сулимова и др. 1976 /. Осадок собирали центрифугированием, промьшали несколько раз водой, затем раствором 0,6 М ацетата натрия в 70% этиловом спирте и окончательно - 70% этиловым спиртом. Препараты ДНК под спиртом хранили на холоде. Выход составлял 2-3 мг ДНК на 10 гр молодых листьев. Судя по физико-химическим свойствам / S20,w = 20 S ; Е2б0 / B2QQ =2,0 ; E26Q / Е = 2,2 ; гиперхронизм 25% /, использованный метод позволяет получить высо-коочищенные препараты.

Хотя в литературе имеются указания, что при этом комплексе методов препараты ДНК могут иметь полисахарид-ные примеси? /Murray, Thompson, 1977, Мирошниченко, Дьяченко, 1981 /, наши опыты по аналитическому ультрацентрифугированию ДНК в градиенте плотности CsCi их не выявили, что свидетельствует о хорошей очистке от полисахаридов. 3± Получение коротких и длинных фрагментов ДНК и определение их длины. Короткие фрагменты ДНК длиною 300-500 нуклеотидов получали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-І / СССР / или ультразвуковом дезинтеграторе фирмы " MSE " / Англия /. Чтобы уменьшить возможность химических повреждений, раствор ДНК перед обработкой дезаэрировали в вакуум-эксикаторе, а затем насыщали азотом. Дезинтегрирование во всех случаях проводили, охлаждая раствор ДНК -в бане со льдом. Раствор ДНК. с концентрацией 560-1000 мкг/мл в 0,3 М ацетате Na или 0,IZM ФБ / N а-фосфатный буфер РН 6,8 / объемом 20 мл озвучивали трижды по 5 минут при минимальной мощности и частоте 22 килогерц на УЗДН-І. Фрагментировали ДНК на ультразвуковом дезинтеграторе "MSE " / Англия / 21 минуту /3x7/ при мощности 200-250 ватт и частоте 21 килогерц. Полученные фрагменты осаждали изопропанолом и подвергали дополнительной очистке. Для приготовления длинных фрагментов ДНК применяли гомогенизатор производства ПНР, тип 302 / Петров, 1980 /. Раствор ДНК. в 0,3 ацетате jua или в 0,12 М ФБ с концентрацией 500 мкг/мл обрабатывали при охлаждении в течение 15-30 минут при 10.000-12.000 оборотов в минуту, Таким образом получали фрагменты ДНК длиной Г500-2000 нуклеотидов. Определение длины фрагментов немеченой ДНК проводили с помощью аналитического улътрацентрифугирования в центрифуге " . Spinco" модель Е / США / со сканирующей приставкой и монохроматором. Центрифугирование проводили в щелочном растворе 0,9 М NaCl, 0,1 М NaOH, / рн Т2 /, при концентрации ДНК 10 мкг/мл. Молекулярный вес фрагментов вычисляли по формуле s20,w = »528 х М0 406 / Studier, 1965 /. Окончательную очистку немеченых длинных и коротких фрагмен-товтов ДНК проводили хроматографией на колонках с ГАПом. Через колонки с необходимым КОЛРІЧЄСТВОМ оксиапатита, расчитанным исходя из его ёмкости, щзи комнатной температуре пропускали раствор фрагментов ДНК в 0,12 М ФБ. Затем вымывали ыесвязавшиися материал 0,12 М ФБ до исчезновения поглощения. Короткие фрагменты элюиро-вали с колонки 0,4 М или 0,5 М ФБ. Длинные фрагменты смъюали 0,12 М ФБ, повышая температуру колонки до 97 С. Фрагменты ДНК осаждали цетавлоном. Осадок собирали центрифугированием, промывали водой и раствором 0,6 М ацетата натрия в 70% этаноле. Фрагменты в 70% этиловом спирте хранили на холоде. 4. Изотопное мечение фрагментов ДНК Метилирование фрагментов ДНК. Метилирование Фрагментов ДНК с помощью метилаз из E.Coli проводили по методу Нестеренко с соавт. / Нестеренко и др.,1979 /, используя в качестве донора метальной группы S-аденозил-Ь о І метил- НІ- метионин ( SAM ) .

Для получения меченых фрагментов смесь объемом 0,150 мл, содержащую 15 мгк фрагментов ДНК, 20 тМ калий фосфатного буфера РН 7,8, 7 тМ 2-меркаптоэтанола, 10 m М ЭДТА, 3,3 ткМ SAM , 60 мкл Есо ДАМ, 30 мкл ECQ R1 инкубировали 3 часа при 37 С и затем 15 часов при комнатной температуре. По окончании инкубации, к инкубационной смеси добавляли 2 объема 10 М мочевины с 0,3 М ФБ РН 6,8 и пропускали через колонку с 0,3 мл ГАПа, уравновешенную 8 М мочевиной с 0,24 М ФБ РН 6,8 при комнатной температуре, промьюали 5 объемами / по 0,3 мл/ буфера, содержащего 8 М мочевину с 0,24 М фосфатным буфером, затем вымывали мочевину 0,01 М ФБ и элюировали меченые фрагменты ДНК 5 порциями по 0,3 мл ФБ. Меченые таким образом фрагменты ДНК Seseli петогоsum имели удельную активность 520.000 имп./мин. на I мкг ДНК. Все просчеты радиоактивности меченой тритием ДІЖ проводили на счетчиках "Mark і", "Mark III" /Nuclear Chicago США /. Образцы осаждали цетавлоном и добавляли диоксановый сцинтиллятор ЖС-8 в соотношении 10 : I и просчитывали в гомогенной системе; эффективность счета 30%. Йодирование фрагментов ДІЖ. Йодирование фрагментов ДНК из разных видов зонтичных проводили ПО Модифицированному Методу КоММерфорда / Commerford, 1971, Orosz, Wetmur, 1974, Prensky, 1976 /. 20 мкг ДНК в 0,5 мл де-ионизированной воды денатурировали нагреванием и быстро охлаждали на ледяной бане. Реакционную смесь объемом 0,75 мл , содержащую денатурированные фрагменты ДНК, 1,5 mKu 125 т 2,5 104 М KI , 15 Ю"4М Тісі3 в 0,14 М ацетатном буфере РН 5,о, инкубировали 20 минут при 60 С. Останавливали реакцию подщелачиванием среды 0,25 мл I М ацетата амлония РН 9,0. Затем нагревали йодированную ДНК до 60 С при РН 9,0 в течение 20 минут, чтобы перевести промежуточные 5 йод-6 окси- 5,6 дигидро-производные цитозина в 5-йодцитозин. После инкубации доводили концентрацию фосфата в смеси до 0,01 М, наносили её на термостатированную /60 С / колонку с 0,3 мл ГАПа и пропускали смесь через колонку с ГАПом, уравновешенным 0,01 фосфатным буфером. Несвязавшийся I отмывали 10 объемами / по 0,3 мя / буфера, содержащего 0,01 М ФБ и элюировали ДНК 5 объемами 0,4 М ФБ дробно по 0,3 мл. Удельная активность меченых фрагментов ДНК состав-ляла 2-5 10 имп./мин. на I Мкг ДНК. Эффективность счета - 60%. Измерение радиоактивности проводили на счетчике "Gamma-Guard 150" / Франция /. Длину меченых фрагментов ДНК определяли ультрацентрифугированием в щелочном линейном градиенте концентрации сахарозы / 5-20% / при РН 12 в центрифуге "Spinco Ъ" / США /, ротор 0 г / SW -50, 16 часов при 5 С, со_скоростью 41.000 об./мин., используя в качестве маркера немеченые фрагменты ДНК известной длины.

Таксономия семейства Umbelliferae

Прежде чем перейти к рассмотрению наших результатов, мы сочли целесообразным кратко остановиться на положении в систематике семейства Umbelliferae , которое было объектом нашего исследования. Семейство Umbelliferae является одним из самых крупных и сложных в таксономическом отношении среди цветковых растений. В нём насчитывается до 300 родов и более 3000 видов. Подразделение Umbelliferae на надродовые таксоны было предложено в работах Друде / Drude , 1898 /, Козо-Полянского / 1916 / и Серсо-Ларри-валь / Cerceau - 1arrival, 1962 /. Наиболее распространенная в настоящее время система принадлежит О.Друде. Семейство зонтичных обычно делят на три подсемейства / 0.Drude, 1898 / и целый ряд триб, основываясь главным образом на строении плодов. Наиболее приближающееся к аралиевым и иногда выделяемое в особое семейство - подсемейство Hydrocoty-loideae подразделяется на две трибы. Тридцать родов и четыреста видов подсемейства распространены преимущественно в южном полушарии, многие в горах тропиков. Второе подсемейство - Sanicu -loideae тоже делится на две трибы. Оно включает в себя девять родов и около трехсот видов.И, наконец, третье подсемейство -Apioideae 5 собственно зонтичные или сельдерейные :_ J представлено многочисленными родами и видами, растущими почти исключительно во знетропических странах северного полушария. Б.М. Козо-Полянский /uoso-Poljansky, 1916 / критиковал эту систему и в 1915 году предложил свею оригинальную систему, лишь отчасти основанную на работах Калестани /Calestani, 1905 /. В Г962 году была опубликована система Серсо-Ларривалъ /Cerceau-Ьarrival, 1962 /, в основе которой лежит анализ признаков -пыльцы и проростков. Она дает иную группировку родов, чем в системах Друде и Козо-Полянского. Таксономическое положение изученных нами видов представлено в таблицах I, 2, 3. В системе Друде / таблица $1/ наши объекты относятся к подсемействам Saniculoideae / I вид / И Apioideae / IS видов /f в последнем подсемействе - к трибам Scandiceae, Smyrnieae, Ammineae, Peucedaneae, Pastinaceae, Laserpitieae.

В системе Козо-Полянского / таблица 2 / наши объекты при надлежат к подсемейству Ligusticoideae f к пяти "легионам": Exomestomae, Pachystereomae, Cyclocrystallinae, Endotaenieae, Gymnomestomae и к восьми трибам:Pastinaceae, Ligusticeae, Caucaleae, Saniculeae, Lecokieae, Critmeae, Peucedaneae, Careae. В системе Серсо-Ларриваль 15 видов / положение остальных не определено / распространены по четырем подсемействам: Bupleuroideae, Endressioideae, Eryngioideae, Apioideae И двенадцати трибам?ир1еигеае, Ammineae, Scandicineae, Capno-philleae, Laserpitieae, Eryngieae, Heteromorpheae, Pimpinel-leae, Cachrydeae, Heracleae, Angeliceae, Peucedaneae. Из представленных здесь таблиц Г, 2, 3 - ясно видно, что в настоящее время нет общепринятого понимания отношения таксонов / родов, триб / внутри этого семейства, особенно в подсемействе Apioideae . Существующие классификации /Drude, 1898, Koso-Poljansky, 1916,С ereeau-Ьarrival, 1962 /, построенные на чисто морфологической основе дают противоречивую трактовку этих отношений, содержат, наряду с естественными, много явно искусственных, выделенных на основе единичных признаков, групп. Попытки комплексного синтетического исследования крупных родов дают значительно более естественные группировки, однако отношения между крупными родами и, тем более, трибами пока остаются не раскрытыми. Привлечение к решению таксономических проблем

Umbelliferae информации о низкомолекулярных соединениях оказалось наиболее продуктивным в систематике крупных полиморфных родов, например, Angelica Ъ., SeseliL., Ferula Ъ.. Однако, те же исследования выявили широкое распространение параллелизма химических признаков. Построение общей системы семейства, отражающей современный уровень его1 исследования, остается поэтому задачей будущего и вряд ли будет возможно без учета результатов сравнительного изучения ДНК. Организация нуклеотидных последовательностей ДНК является той характеристикой генома, которая требуется для строгой количественной интерпретации данных по молекулярной гибридизации, ибо определение уровня и степени межгеномной дивергенции семейств ПП без учета их чередования с УП ДНК может оказаться ошибочным / Flavell et al., 1977 /. Исходя из этих предпосылок, мы провели исследование генома Seseli nemorosum . Основным методом изучения чередования ПП и УП ДНК является кинетика реассоциации фрагментов ДНК разной длины. Кинктику реассоциации мы изучали методом фракционирования реассоциировавшей ДНК на гидроксиапатите / ГАПе /. Длина фрагментов ДНК S.nemorosum составляла 390 н.п. и 1500 н.п. Гипер-хромизм препаратов ДНК равнялся 30-34%. В качестве внутреннего стандарта в каждую пробу добавляли 4С меченую in vivo днк E.coli . Длина меченых и немеченых фрагментов ДНК. E.coli составляла 220 н.п. Длина фрагментов определялась двумя методами: аналитическим ультрацентрифугированием и гель-фильтрацией на колонках с CL - 4Б сефарозой в щелочной среде. Удельная радиоактивность С _ фрагментов E.coli составляла 5300 имп/мкг при эффективности счета 81%. Включение в пробы ДНК в. coli позволяет контролировать возможное ускорение или замедление скорости реассоциации, наблюдаемое при работе с высокими концентрациями ДНК/ Murray et al., 1978 /. Кривые кинетики реассоциации фрагментов ДНК длиною 390 и Г500 н.п. представлены на рис. 3. Разложение кривых на кинетические компоненты проводили по методу Лайрда и др. / Laird, Mc Carthy, 1969 / и с помощью машинной программы.

Оба метода дали хорошо согласующиеся результаты. Машинный анализ выявил три кинетических компонента: Быстрый, средний и медленный. Эти три кинетических компонента характерны для всех изученных до сих пор ДНК зукариот / Waloot, Goldberg, 1979 /. Рассмотрим кинетику реассоциации ДНК Seseii петогоsum для фрагментов длиною 390 нуклеотидоЕ. При этой длине фрагментов содержание уникальных и повторяющихся последовательностей примерно одинаково. Повторяющиеся последовательности представлены двумя кинетическими компонентами. При Cot 0,1 реассоциирует 3,5% генома S.nemorosum ; в этой фракции содержатся мгновенно реассоциирующие последовательности, обогащенные палиндромами, и последовательности с высокой /не менее 10 / степенью повторяемости. Для геномов растений характерно низкое содержание палиндромов, Не более 7% / Stack, Comings, 1979 /. В геноме петрушки Petroselinum satuvum единственном до сих пор исследованном геноме представителя семейства Umbelliferae имеется около 4% таких последовательностей Дірег, Herzfeld, 1978 /. В интервале значений Cot 0,5-200 реассоциируют повторы с количеством копий порядка сотен / 41% генома /. Значительная часть генома / 41% / представлена, так называемыми, умеренными повторами. Они образуют фракцию, реассоциирующую с промежуточной скоростью и составляющую у высших растений от 32% у Vigna radiata /Murray et al., ТЭ79 / Д0 75% у Secale cereale И Triticum aestivum / Eimpau et al. , 1978 /. Эти последовательности образуют семейства, содержащие различное число членов и повторенные в геноме от нескольких сот до нескольких тысяч раз. В геноме петрушки эта фракция составляет 53% / Kiper, Herzfeld, 1978 /.

Молекулярная гибридизация повторяющихся и уникальных последовательностей ДІЖ Umbelliferae

Вопрос о целесообразности использования геносистематического подхода в таксономии высших растений еще далеко не решен, а мнения крупнейших систематиков на этот счет нередко диаметрально противоположны / Takhtajan, 1974 /. Как уже указывалось ранее, оценка родства организмов на основе сходства или различия их генотипов является ценным дополнением к установленным ранее морфо-физиологическим характеристикам / Антонов, 1974 /. Одно из главных достоинств геносистематического подхода состоит в том, что конвергентное возникновение идентичных или хотя бы сходных нук-леотидных последовательностей достаточно большой протяженности практически исключено / Ратнер, 1975 /. Конвергенция на уровне ДНК оказьшается событием с нулевой вероятностью.Еще одно преимущество геносистематического подхода - это возможность количественно оценить степень родства или уровень дивергенции сравниваемых геномов. Для оценки уровня дивергенции генетического материала используется метод молекулярной гибридизации ДНК. Как было показано при рассмотрении литературных данных, этот метод позволяет обнаружить сходные нуклеотидные последовательности ДНК, причем как уровень гомологии / % /, так и процент накопленных нуклеотидных замещений коррелирует со степенью родства сравниваемых организмов. Целью наших исследовании было определить степень дивергенции повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК у видов разной степени родства: от популяций одного вида до видов из разных подсемейств Umbelliferae . Нас интересовало, с одной стороны, как будут согласовываться наши данные с представлениями систематиков, и, с другой стороны, какова разрешающая способность используемой нами модификации метода гибридизации в растворе, то есть таксоны какого ранга в пределах этого семейства могут быть сравнены. Для первых исследований гомологии в первичных структурах ДНК. зонтичных была выбрана серия объектов разной степени сходства: две популяции вида Seseli condensatum ( Ъ ) Keichnb., две популяции - диплоидная / 2п = 22 / и гексашюидная / 2п = 66 / близкого вида Seseli mucronatum ( Schreck ) M.Pimen. et Sdobn. , ИЗ ТОЙ ЖЄ секции Condensata M.Pimen. et Sdobn. рода Seseli, ВИД Paraligusticum discolor (bedet).) V.Tichomirov , принадлежащий к той же трибе Apieae / носящей, правда, явно сборный характер/, что и род Seseli , а также представители иных триб Umbelliferae — Peucedaneae Dumort. / Peucedanum latifolium Bieb. / И Pastinaceae K-Pol. / Heracleum lehmannianum Bunge /. Степень сходства последовательностей во фракциях ДНК видов Umbelliferae определяли, отжигая следовые количества меченых последовательностей каждой фракции ДНК S. condensatum и "уникальной" фракции s.mucronatum с избытком тотальной немеченой ДНК других видов зонтичных.

При этом получали две количественные характеристики: уровень реакции / % связывания / с гетерологичнои немеченой ДНК / относительно гомологичной /, то есть количество последовательностей достаточно гомологичных, для Образования стабильных дуплексов, и термостабильность дуплексов, образующихся в гетерологичнои системе, относительно гомологичных, выражающуюся величиной д Т пл., которая характеризует степень точности спаривания дуплексов, то есть степень межгеномной дивергенции сравниваемых последовательностей. Экспериментально установлено, что снижение Т пл. на 1 С соответствует приблизительно 1% замен нуклеотидов В ДНК / Britten et al., 1974 /. Таким образом, эти два критерия / % гомологичных последовательностей ДНК и термостабильность гибридных дуплексов /,использованные нами в работе, дополняют друг друга и позволяют получить более-полную характеристику геномов сравниваемых видов. Меченые I ДНК S.condensatum и S.mucronatum фракционировали на колонках с гидроксиапатитом /Commerford, 1971, Orosz, Wetmur, 1974 /; ДНК отжигали до Cot 50 и отделяли в однотяжевой форме уникальные последовательности. Количес-тво меченых I последовательностей ДНК- S.condensatum и S,mucronatum ,связанных в процессе гомологичной и гетерологичнои реассоциации оценивали измерением радиоактивности гибридных дуплексов, отделенных на колонках с ГАПом. Самореассо- трс; циацию определяли в присутствии бактериальной ДНК. I тотальные повторы ДНК 3. condensatum / популяция Джунгарского Ала-гтау /, включающие все кинетические компоненты этого класса последовательностей, гибридизовали с ДНК видов s.condensatum / популяция Тувы /, S.mucronatum / диплоидная популяция /, S.mucronatum / гексаплоидная популяция / до Cot 50. При этом значении Cot должны гибридизоваться в основном повторяющиеся последовательности ДНК. Результаты этого опыта, приведенные в таблице 5: и на рис. Доказывают, что с ДНК одной популяции s.condensatum гибридизуется 73% повторов ДНК другой популяции того же вида. Как следует из полученных данных, доля гомологии в ДНК S.condensatum t взятых из разных частей разорванного ареала / Тува, Джунгарский Ала-тау /, оказалась ниже, чем это было определено для видов рода Iris / Шнеер, Антонов, 1975 /, рода Achillea /Кашеваров, Антонов, 1982 / и двух сортов кукурузы / Hake, Walbot , 1980 /, но термостабильность гетеро-логичных дуплексов отличается от гомологичных.в пределах I С. Такого рода данные могут служить основой для суждений о глубине внутривидовой дивергенции геномов растений. Доля гомологии во фракции повторяющихся последовательностей ДНК видов рода Seseli / более 63% / того же порядка, что и у видов изученных ранее родов iris / более 50% / / Шнеер, Антонов, 1976 /, Triticum и Aegiiops / более 60% / / Янева, Антонов, 1976 /, Achillea / не менее 74% /, но ниже, чем в роде Zea /Hake, Waibot, 1981 /. При анализе тотальных повторов все последовательности ДНК Zea mays оказались гомологичными ДНК Zea техicana. Термостабильность гомологичных дуплексов выше, чем гетеро— логичных:: д Т пл. = 2, для дуплексов ДНК s.condensatum с S,mucronatum / диплоидная форма / и 3,5 для дуплексов с S.mucronatum / гексаплоидная форма /. Уровень межгеномной дивергенции фракции повторов ДНК у видов рода Zea / А Т пл. 2,1 , 1,9 / И у видов рода Achillea / А Т пл. 1,4- 2,6Р/, того же порядка, что и ДНК видов рода Seseli. Данные по межвидовой гибридизации этой фракции ДНК под і1— тверждают целесообразность ревизии родов Seseli и Pachypleurum.

Наши результаты согласуются с мнением тех систематиков, которые на основании анализа ряда морфологических, цитологических и химических признаков относят вид "Pachypleurum mucronatum к роду Seseli / Пименов, Сдобнина, 1973 /, поскольку ДНК S.mucronatum обнаруживает значительное сходство с ДНК S.condensatum # Обращает на себя внимание неодинаковая гомо-логичность ДНК S.condensatum с диплоидной и гексаплоидной формами S.mucronatum , количество нуклеотидных замещений в последней заметно выше /3,5% вместо 2% /. Причины этих отличий мы обсудим отдельно. Анализ гомологии во фракциях, обогащенных уникальными последовательностями / таблица 5, рис. 5, 6 /, показал, что термостабильность гомологичных дуплексов в пределах этой фракции существенно вьше, чем во фракции повторов / 67,,5 С против 59 С/, что согласуется с аналогичными данными, полученными в опытах с ДНК животных / Коппе, , 1970 /. Низкая величина самореассо- циации / 1-3% / также указывает на достаточную чистоту выделен- Т25 ной фракции. I меченые уникальные последовательности ДНК S.condensatum и S.mucronatum инкубировали с ДНК других о видов зонтичных при температуре, эквивалентной 60 С, что для этих последовательностей является достаточно жестким условием / Angerer et al., 1976, Galau et al., 1976 /. Полученные результаты свидетельствуют о том,что количество вступающих в реак- цию меченых уникальных последовательностей больше,чем при инкубации с повторами. При этом, больше всего сходных уникальных последовательностей в ДНК., выделенных из растений двух популяции одного вида S. condensatum / 90% / и меньше у ДНК-разных видов рода Seseli / 70% /. Термостабильность гетерологичных дуплексов снижается при гибридизации ДНК видов одного рода по сравнению с гибридизацией в пределах вида. Наши данные подтверждают целесообразность переноса Neogaya петогоза в род Seseli , поскольку ДНК. этого вида имеет очень сходную первичную структуру с ДНК. S.condensatum и S.mucronatum. Как и следовало ожидать, доля гомологии и термостабильность гибридных дуплексов ДНК, выделенных из растений разных родов зонтичных, оказалась ниже, чем при гибридизации ДНК видов рода Seseli .

Похожие диссертации на Молекулярная организация и эволюция ДНК зонтичных подсемейства Apioideae

Структура, эволюция и филогенетическое значение сателлитной ДНК на примере ящериц родов Darevskia и Lacerta s. str. (Sauria: Lacertidae) Чобану Дойна Григорьевна

Внецентромерные -сателлитные ДНК человека: структура, участие в сегментных дупликациях и эволюцияОпарина Нина Юрьевна

Структурная организация и эволюция рибосомной ДНК чешуйчатых рептилий подотряда SauriaВоронов Александр Сергеевич

Отолитовая мембрана : Структурно-функциональная организация, эволюция, экоморфологическая пластичность и устойчивость к экстремальным воздействиямЛычаков Дмитрий Витальевич

Структурно-молекулярная организация и эволюция В-хромосом восточноазиатской лесной мыши Apodemus Peninsulae Лаухина Ольга Владимировна

Компьютерный анализ и моделирование структурно-функциональной организации и эволюции генных сетей, контролирующих развитие крыла Drosophila melanogasterГунбин Константин Владимирович

Особенности организации и эволюции митохондриальных геномов байкальских губок : LubomirskidaeМайкова, Ольга Олеговна

Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок ssp160 у видов рода ChironomusБерезиков, Евгений Викторович

Становление организации цестод и основные направления ее преобразования в эволюцииГуляев, Владимир Дмитриевич

Динамика однолокусного мультиаллельного адаптивного ландшафта в молекулярной эволюции белок-кодирующих последовательностей ДНКНауменко Сергей Анатольевич