Введение к работе
Актуальность проблемы.
Уникальность регуляторной функции определённых элементов генома может отражаться в уникальности Фурье-спектров соответствующих нуклеотидньгх последовательностей. Ранее было показано, что периодичность в распределении нуклеотидов сама по себе, вне зависимости от конкретной последовательности нуклеотидов, может быть связана с функционированием регуляторых областей генома, так как именно периодичность в распределении нуклеотидов - важнейшая основа для формирования потенциала, определяющего взаимодействие ДНК-белок в различных областях генома. В работе Кравацкой и др., (2002 г.) показано, что на основе сходства Фурье-спектров различных негомологичных участков генома можно выявить несколько областей с аналогичной функцией, а именно областей, вовлеченных при определенных условиях в процесс инициации репликации.
В число наиболее сложных и интересных процессов, связвнных с перестраиванием генома, входят изменения, которые претерпевают в течение индивидуального развития организма гены, кодирующие иммуноглобулины. Генерация разнообразия иммуноглобулиновых генов была одной из фундаментальных проблем как иммунологии, так и молекулярной генетики на протяжении последних нескольких десятилетий. За эти десятилетия часть процессов, уникальных для перестраивания генов антител, была детально изучена, так, V(D)J-рекомбинация, при помощи которой создаётся первичный репертуар иммуноглобулинов, является одним из хрестоматийных примеров в области молекулярной генетики. Однако, ряд явлений, связанных с более тонкой «настройкой» работы генов, отвечающих за иммунитет, остаётся загадкой и в нынешнее время. К таким процессам относятся, помимо
прочих, генная конверсия и соматическое гипермутирование иммуноглобулиновых генов. Соматическое гипермутирование является, по сути, уникальным явлением, воспроизводящим в ускоренном темпе процесс эволюции и направленного отбора для популяции В-лимфоцитов отдельно взятого организма. Исследование соматического гипермутирования помимо расширения области знаний о генетике иммуноглобулинов, поможет применить механизмы используемой организмами позвоночных «молекулярной эволюции» в области биотехнологии - получение белков с улучшенными свойствами при помощи соматического гипермутирования возможно уже сегодня (Arakawa et al, 2008). Однако, гипермутирование является потенциально опасным для организма процессом - нарушение его специфичности к иммуноглобулиновым генам может приводить к канцерогенезу, что делает исследование упомянутой специфичности вопросом, важным также и для медицины.
Начало XXI века было ознаменовано открытием дезаминазы AID -фермента, контролирующего целый ряд специфических изменений генов антител. Это открытие послужило мощным толчком, вызвавшим новую волну интереса к исследованиям в данной области.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось установление природы выделенности локуса легкой цепи иммуноглобулинов на 15 хромосоме генома курицы в отношении индукции соматического гипермутирования методом анализа периодичностей распределения нуклеотидов в ДНК локуса, а также поиск и характеристика цис-действующих элементов, контролирующих соматическое гипермутирование. Были поставлены следующие задачи:
Анализировать периодичности в нуклеотидной последовательности локуса лег-
кой цепи иммуноглобулинов курицы, сравнить их с периодичностями распределения нуклеотидов в ДНК хромосомы 15 курицы на предмет обнаружения уникальных областей.
- Доказать зависимость соматического гипермутирования от цис-
действующих элементов локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы,
путём удаления и реинсерции локуса.
Оценить расстояние, на котором цис-действующие элементы сохраняют своё влияние на соматическое гипермутирование.
Показать способность цис-действующих элементов локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы активировать гипермутирование в неиммуноглобулиновых локусах, независимо от места на хромосоме.
Провести делеционный анализ локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы, более точно картируя на нём регионы, контролирующие соматическое гипермутирование.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Исходя из того, что уникальность регуляторной функции может отражаться в уникальности Фурье-спектров соответствующих нуклеотидных последовательностей, мы провели исследование локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы детальным анализом периодичностеи в его нуклеотиднои последовательности и сравнили полученную периодичность с таковой в оставшейся последовательности хромосомы 15 курицы. Биоинформатическое исследование периодичностеи распределения нуклеотидов способно дать характеристики нуклеотиднои последовательности, ответственные за специфическую направленность гипермутирования.
В ходе исследований нами была показана уникальность периодичностеи в нуклеотиднои последовательности локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы. На основе биоинформатического анализа и
экспериментов на линии куриных В-лимфоцитов DT40 охарактеризована цис-действующая последовательность ДНК, необходимая для гипермутирования в локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы и способная активировать гипермутирование, будучи встроенной в другие локусы. Эту последовательность мы назвали элементом DIVAC от англ. «активатор диверсификации». Элемент DIVAC располагается на протяжении 9,8 тыс.п.о, начиная от точки старта транскрипции гена лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы и заканчивая нижеследующим геном. DIVAC, вероятно, состоит из ряда участков, возможно, взаимодействующих между собой. Центральная последовательность элемента DIVAC, размером 4 тыс. п.о., способна активировать гипермутирование с интенсивностью более чем в 100 раз превышающую фоновый уровень. Фланкирующие регионы обладают на порядки меньшей активностью сами по себе, но способны стимулировать гипермутирование, будучи объединены с центральным участком. Элемент DIVAC способен действовать, находясь по обе стороны от репортерной конструкции и на достаточно больших расстояниях.
Учитывая, что процесс AID-опосредованного перестраивания иммуноглобулиновых генов достаточно консервативен в течение эволюции позвоночных, идентификация элемента DIVAC у курицы должна быть также значима и для млекопитающих. Поиски цис-действующих последовательностей, регулирующих гипермутирование, на примере трансгенных мышей показали, что регионы, окружающие иммуноглобулиновые энхансеры, влияют на гипермутационную активность. Характеристики и расположение этих участков напоминают таковые для центральной части элемента DIVAC курицы. Описанная в работе экспериментальная модель адекватна для изучения соматического гипермутирования. Биоинформатический анализ охарактеризованного элемента DIVAC может помочь в исследовании и нахождении
характеристик последовательностей, способных активировать аберрантное гипермутирование, таким образом, работа значима и для медицины. В области биотехнологии характеристика элемента, контролирующего соматическое гипермутирование, также имеет значимость, позволяя использовать описанный элемент для улучшения свойств белков методом «искуственной эволюции» (Arakawa et al, 2008).
Апробация работы и публикации
По мотивам диссертации опубликовано шесть печатных работ, в том числе три статьи в реферируемых журналах из списка ВАК и три в тезисах международных конференций.
Объем и структура работы.
Похожие диссертации на Молекулярные механизмы регуляции соматического гипермутирования иммуноглобулиновых генов
