Содержание к диссертации
Введение
1. ДНК- и РНК-полимсразы: структурно-функциональное разнообразие и елипын каталитический механизм (литературный обзор). 9
1.1. Пространственная структура односубъсдиничных нуклсотид-полимсраз. 11
1.2. Структура активного центра и связывание субстратов. 20
1.2.1. Структурные мотивы. 20
1.2.2. Связывание матрицы/праймера. 23
1.2.3. Связывание нуклеозидтрифосфатов. 31
1.3. Катализ полимеразной реакции. 41
1.3.1. Ионы металла в активном центре полимеразы. 44
1.3.2. Конформациоппыс изменения полимсраз при связывании субстратов. 47
1.3.3. Процсссивность полимсраз. 52
2 Материалы и методы. 56
1.1.. Материалы. 56
1.1.1. Ферменты. 56
2 Реактивы. 56
2.1.2.Нуклеозиды, нуклеотиды и их производные. 57
2. 1.4. Среды для культивирования клеток E.coli. 57
2.1.5. Плазмиды, использованные в работе. 57
2.2. Методы. 59
2.2.1. Выделение и очистка Т7 РНКП и еЄ мутантной формы (Тугб39Рпе, Scr641A!a Т7 РИКП). 59
2.2.2. Выделение обратной транскритазы ВИЧ-І и се мутантных форм. 60
2.2.3. Электрофорез белков. 61
2.2.4. Препаративное выделение плазмидной ДНК. 61
2.2.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 62
2.2.6. Транскрипция in vitro. Получение смешанных полинуклсотидов. 62
2.2.7. Электрофорез образцов нуклеиновых кислот в ПАЛҐ. 63
2.2.8. Электрофорез образцов в агарозном геле. Элюция из геля. 64
2.2.9. Определение эффективности иолимеразной реакции. 65
2.2.І0. РНК/РНК-полимеразная реакция, катализируемая формы Tyr639Phc, Ser641AlaT7 РНКП. 65
2.2.11. Реакция обратной транскрипции. 66
2.2.12. Получение [32Р]-меченых ДНК и олигонуклеотидов. 66
2.2.13. Ссквенирование РНК и СПН. 66
2.2.14. Получение активированной ДНК. 67
2.2.15. Определение констант ингибирования аналогами пирофосфата и нуклеотидов. 67
2.2.16. Включение модифицированных rNTP в РНК-продукт реакции Т7 РНКП. 68
2.З. Построение пространственных моделей. 68
2.3.1. Моделирование связывания модифицированных праймеров в активном центре ОТ. 68
2.3.2. Моделирование связывания аналогов в активном центре Т7 РНКП. 69
3. Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК- иолнмеразой бактериофага Т7 и обратной транскиптазой ВИЧ-1. (обсуждение результатов) 70
3.1. Синтез смешанных рибо/дезоксирибополинуклеотидов мутаитной формой Т7 РНКП. 71
3.2. Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1. 83
3.З. Исследование взаимодействия ОТ ВИЧ-1 с модифицированными прайм срами, содержащими 2'-0-(Р-В-рибофуранозил)аденозин. 92
3.4. Взаимодействие ОТ ВИЧ-1 и Т7 РНКП с фосфонатными аналогами NTP и неорганического пирофосфата. 101
4. Выводы. 116
- Структура активного центра и связывание субстратов.
- Катализ полимеразной реакции.
- Построение пространственных моделей.
- Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1.
Введение к работе
Нуклеотид-полимеразы (ДНК- и РНК-пол им еразы разных типов) представляют собой большой класс ферментов, ответственных за синтез ДНК и РНК в клетке и катализирующих единую химическую реакцию - синтез 3 -5 -фосфодиэфирной связи между рибо- или дезоксирибонуклеотидами. Большая часть этих ферментов представляют собой сложные мультисубъединичные комплексы, исследование которых во многих случаях затруднительно. В то же время существует значительное число нуклеотид-полимераз, сохраняющих весь спектр функций, но гораздо более простых по строению (в частности, односубъединичпых). Последнее обстоятельство делает такие полимеразы наиболее удобными моделями для изучения фундаментальных механизмов биосинтеза нуклеиновых кислот и позволяет получить максимум достоверной информации об их структуре и особенностях катализируемых ими реакций.
Особое место в исследованиях нуклеотид-полимераз занимает анализ их субстратной специфичности. Выяснение вопросов о том, какие факторы влияют иа выбор нуклеотид-полимеразой РНК или ДНК матрицы, рибо- или дезоксирибонуклеозидтрифосфата (rNTP или dNTP) представляются основополагающими в нашем понимании их функционирования.
Целью настоящей работы являлся поиск критериев, влияющих на выбор субстратов, для представителей двух различных семейств нуклеотид-полимераз: ДНК-зависимой РНК-нолимеразы бактериофага Т7 (17 РНКП) и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека 1 (ОТ ВИЧ-1). Оба этих фермента представляют собой относительно простые по структуре полимеразы, катализирующие реакции транскрипции и обратной транскрипции, соответственно. Особый интерес представляло исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ ВИЧ-1 в отношении неканонических субстратов, поскольку их использование потенциально может существенно расширить спектр применения этих фермсіггов в различных областях физико-химической биологии.
В работе был проведен поиск условий препаративного синтеза смешанных полинуклеотидов определенного состава мутантной формой Т7 РНКП, а также использование последних в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1. Исследовано влияние введения объемного заместителя [2 -0-(ї-рибофураиозил)адснозина] в различные положения цепи нраймера на протекание реакции обратной транскрипции, катализируемой ОТ ВИЧ-1. Отдельной частью работы являлось исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ в отношении нуклеозидтрифосфатов, содержащих модификации трифосфатиой части молекулы.
Структура активного центра и связывание субстратов.
Сравнение аминокислотных последовательностей различных полимераз позволило выявить пять консервативных мотивов А-Е [6, 49] (рис. 1.2). Мотивы А и С консервативны как в ДНК-, так и в РНК-зависимых иолимеразах, что, вероятно, обусловлено использованием этими ферментами в качестве субстратов нуклеиновых кислот [6, 42]. Во всех рассматриваемых нами структурах ферментов мотивы Л и С образуют три Р-листа и короткий участок а-спирали в центральной части субдомеиа ладонь [50]. Инвариантные остатки двух Asp, о которых говорилось выше, локализованы именно в этих мотивах [31, 50]. Вероятно, мотивы А и С вовлечены в катализ нуклеотидилыюго переноса. Мотив В, характерный только для ДНК-зависимых полимераз, (Д-ДНКП и Д-РНКП) локализован в "а-спирали О" субдомеиа пальцы ФК. В его состав входят три аминокислотных остатка, инвариантных для ДНК-зависимых полнмераз: Lys758, Туг766 и Gly767 в ФК, которым соответствуют Lys63I, Туг639 и GIy640 в Т7 РНКП. На основаїшн данных рентгеноструктурпого анализа комплекса Т7 ДНКП с матрицей/праймером и нуклеозид 5 -трифосфатом, было показано, что связывание ДНК и корректного dNTP приводит к значительному повороту субдомена пальцы но направлению к активному центру. Именно эти конформационные изменения приводят к непосредственному взаимодействию консервативных остатков петли О с входящим нуклеотидом [15]. Мотив В, вероятно, принимает участие в связывании и дискриминации rNTP/dNTP (подробнее для Т7 РНКП это будет обсуждено ниже).
В молекуле ОТ область, эквивалентная О-петле мотива В, состоит из двух шгтипараллсльных р-складок, соответственно РЗ и р4. Аминокислотные замены в этом домене приводят к появлению устойчивости изолятов ВИЧ, несущих мутантный фермент, к нуклеозидным ингибиторам [51]. Кроме того, антитела, узнающие зпитоп, локализованный в мотиве В, действуют как конкурентные ингибиторы по отношению к нуклеотидам в процессе полимеризациии [52]. По всей видимости, участок Р3/р4, так же как и мотив В, взаимодействует с нуклеотидом перед каталитической стадией. Кроме этих трех мотивов, РНК-зависимые полимеразы содержат дополнительный мотив D, не обнаруженный в ДНК-пол им еразах. Мотив D расположен в субдомене ладонь и образован небольшой петлей из остатков Thr215-Lys223 в молекуле ОТ [50]. Здесь локализованы несколько мутаций устойчивости к пенуклеозиднам ингибиторам. Первоначально предполагалось, что поскольку эта область уникальна для РНК-зависимых полимераз, аминокислотные остатки, принадлежащие этому мотиву, обеспечивают специфичность фермента по отношению к РНК-матрице [34, 50]. Однако позднее было показано, что замена консервативного остатка Lys220 на глутамин приводит к 10-кратному увеличению дискриминации мутанта по отношению к азидотимидиитрифосфату (AZTTP), одному из широко используемых ингибиторов ОТ, по сравнению с ферментом дикого типа [53], что свидетельствует скорее о взаимодействии этого участка с NTP. В этой же работе было показано, что для химерной молекулы ОТ, в которой мотив D был заменен на соответствующий сегмент Т7 ДНКП, степень такой дискриминации увеличивается до 200. Эти данные не удивительны, поскольку известно, что AZTTP является плохим субстратом для Д-ДНКП, не содержащих мотива D, а степень их сродства к нему в 100 раз меньше по сравнению с dTTP [54]. Таким образом, можно утверждать, что мотив D взаимодействует с входящим пуклеотидом и определяет чувствительность ОТ к AZTTP. Полимеразы являются чрезвычайно коиформациошю подвижными белками. При связывании ферментов с матрицей, субстратами и субстратоподобными молекулами и ингибиторами; при транслокации, инициации и терминации синтеза; а также при связывании с регуляторными и вспомогательными субъединицами, белками и кофакторами и изменении химического окружения происходят существенные изменения взаиморасположения отдельных элементов вторичной структуры, ведущие к изменениям функций и характеристик молекул в целом. Поэтому большую ценность представляют данные рентгеиоструктурного анализа комплексов ферментов с двуспнралышй ДНК и субстратом в активном центре. 1.2.2. Связывание матрины/праймера.
Наиболее существенные изменения во взаиморасположении доменов и субдоменов происходят при связывании полимераз с двуцепочечной ДНК. Хотя структура апофермента ФК свидетельствует о наличии только одной щели связывания, в структуре его комплекса с ДНК-дуплексом видна еще одна, расположенная практически под прямым углом к первой [12]. В этом кристалле дуплекс длиной 11 пар оснований связывался во второй щели, при этом одно цепочечный участок из 4 иуклеотидов на 3 -конце праймера удерживался в экзонуклеазном активном центре. Формированию этой второй щели способствует значительное движение большого пальца к молекуле ДНК, с которой он взаимодействует, и, одновременно, стабилизация субдомена в верхней области, который совершенно беспорядочен в апоструктурс. Интенсивные взаимодействия наблюдаются поперек малой борозки между сахаро- фосфатным остовом ДНК и аминокислотными остатками субдомена большой палец, высоко консервативными в семействе Pol 1.
Эти остатки включают Arg631 и Lys635, Asn675 и Asn678 и консервативный мотив верхней области большого пальца. Установлено, что конец ДНК-праямера в комплексе расположен в полимеразном активном центре, и, таким образом, цепь ДНК изгибается, контактируя с субдоменом пальцы. Следовательно, помимо той роли, которую этот субдомен играет в связывании нуклеозидтрифосфатов, он принимает также участие в связывании матрицы [13]. Предложенная модель связывания ДНК в полимеразном активном центре подтверждается рядом биохимических исследований [31, 32, 55-56]. Связывание фотоафинной метки на конце праймера с Туг766 согласуется с таким положением полимеразпого активного центра [57]. Замена этого остатка на аланин или серии уменьшает скорость синтеза ДНК [58] и увеличивает вероятность встраивания неправильного нуклеотида в цепь [59, 60]. Однако замена тирозина на феиилалашш слабо влияет на синтез ДНК [59], Вероятно, для нормального функционирования полимеразы в этом положении должен быть объемный ароматический заместитель. Эксперименты по химическому футпрннтингу, флуоресценции [61] и фотокросслинкингу [57] показывают, что ФК покрывает 5-8 пар оснований ДНК-дуплекса при условии, что конец праймера находится в полимеразном центре. Недавно была разрешена структура комплекса другого представителя семейства Pol 1 - ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus с ДНК и ddCTP с разрешением 1.8 Л [20]. Bacillus ДНКП сокристаллизована с ДНК-дуплексом длиной 9 пар оснований с нависающим 5 -концом матрицы, а так же продуктами нескольких раундов включения пуклсотидов. Доказано, что в кристаллической форме фермент остается каталитически компетентным и способен осуществлять дискриминацию между правильным и неправильным нуклеотидами. Как и в случае Т7 ДНКП [15], ДНК-дуплекс удерживается в нужном для катализа положении посредством прямых и опосредованных водой взаимодействий субдомснов ладонь, пальцы и большой палец с сахаро-фосфатным остовом дуплекса. Субдомен пальцы контактирует с цепями матрицы и праймера, смежными с активным цсігтром. З -конец праймера заякоривается пальцами и ладонью, а его 5 -конец удерживается большим пальцем [20].
Показано, что во ФК делеция 24 остатков из области двух антииараллельиых р-складок субдомена большой палец, вероятно, принимающих участие в связывании дуплекса, приводит к понижению сродства связывания ДНК ферментом и повышает частоту мутаций сдвига рамки считывания [62]. Независимые от пуклеотидной последовательности взаимодействия фермента с матрицей осуществляются в малой бороздке между 4-мя парами оснований З -конца праймера, которые образуют водородные связи между N3 позициями пуриновых и О2 позициями пиримидиновых оснований и высоко консервативными остатками напрямую или посредством ориентированных молекул воды. Большая бороздка, узнавание которой характерно для ДНК-связывающих белков, узнающих определенную нуклеотидную последовательность, не контактирует с ферментом и доступна растворителю. Интенсивные взаимодействия с малой бороздкой становятся возможными благодаря значительному изменению формы ДНК-дуплекса. Вне области узнавания малой бороздки ДНК находится в В-формс. Конформационные изменения наблюдаются на границе этой области, что сопровождается монотонным изменением параметров малой бороздки: она расширяется с 7.0 до 10.2 Л в активном центре, а ее глубина уменьшается до Ы А, позволяя аминокислотным остаткам легко достигать оснований. Расположение 3 -конца прайм ера максимально способствует протеканию катализа. З -ОН группа образует водородные связи с Asp 830 (882 в ФК).
Катализ полимеразной реакции.
Элементарный акт реакции, катализируемой нуклеотид-полимеразами, состоит в нуклеофильной атаке З -концсвой гидроксильной группы праймера а-фосфата NTP с высвобождением пирофосфата [4, 69]. Принимая во внимание, что структурные различия между рибо- и дезоксирибо-нуклеотидами невелики, резонно предположить сходный химический механизм для всех полимераз, вне зависимости от того, идет ли синтез на ДНК- или РНК- матрице и чем является конечный продукт - ДНК или РНК. Детали протекания реакции в активном центре охарактеризованы для нескольких полимераз, включая ФК [70] и ОТ ВИЧ-1 [63, 88, 89]. В каждом случае она обязательно направляется порядком связывания субстратов, при этом сначала формируется комплекс фермент-нуклеиновая кислота, необходимый для продуктивного связывания r/dNTP и образования каталитически компетентного тройного комплекса. Кинетическую схему, предлагающуюся для реакции нуклеотидилыюго переноса в элонпщионном комплексе хорошо изученных полимераз, можно представить следующим образом: E.MP„+NTPo E-JVUVNTP4 E -MPn NTP E -MPn rPP, оЕ-МРП4гРР( E-MP j+PPi, где Е-фермент в открытом состоянии, Е -фермент в закрытом состоянии, М-матрица, Р„лраймер длины п7 Р і-праймер длины гН-1, NTP-рибо или дезоксирибонуклеозид-5 -фосфат, РРі-пирофосфат. Первоначальное связывание NTP является относительно нсспецифнческой стадией. Фактически это адсорбция субстрата в активном центре, которая протекает со скоростями, близкими к скорости диффузии [90]. Такие высокие скорости могут реализоваться только при условии существования нескольких энергетически равноценных способов адсорбции субстрата в активном центре фермента, контакты же между субстратом и ферментом должны быть немногочисленны. Это дает возможность связываться в активном центре не только субстратам, но и субстратоподобным молекулам и конкурентным ингибиторам, имеющим отдаленное сходство с субстратом. Последующая стадия взаимной информационной подстройки фермента и субстрата позволяет отбирать подходящий субстрат и, вероятно, ответственна за точность работы фермента [91].
Для ФК предложена модель, согласно которой первоначальная адсорбция dNTP из раствора осуществляется путем взаимодействия у-фосфата с ионом Mgz+, координированным на остатках Asp в активном центре [92]. Эта стадия является быстрой и неспецифической и сменяется стадией конформационной подстройки, при которой возникают водородные связи между основанием матрицы и правильным dNTP, и хелатируется р-фосфатная группа dNTP. Этот процесс является скорость лимитирующим. Начальное связывание dNTP с ФК [93] и ОТ ВИЧ [94] не включает спаривание с матрицей. Однако, в случае Т7 РНКП формирование уотсон-крнковских взаимодействий происходит уже на этой стадии, что обеспечивает отбор корректного NTP [91]. Существенный вклад в фиксацию r/dNTP в активном центре также вносит гидрофобное взаимодействие [17, 94]. Нуклеотндилтрансферазная реакция осуществляется путем атаки атома Ра не поделенной электронной парой кислорода 3 -0Н группы. Реакция протекает через переходное состояние с пентакоординированным фосфатом (SN2), при этом происходит обращение конфигурации при атоме Ра [95]. Механизм с обращением конфигурации около фосфора доказан с помощью хиральных а-тио-dNTP, нуклеотидный остаток которых включается в ДНК при катализе различными ДНК-пол имеразами, в результате чего образуется новая фосфотиоатднэфирная группа с обращенной конфигурацией относительно атома фосфора [96]. Уходящей группой является пирофосфат, который по всей вероятности, покидает активный центр в виде комплекса с ионом Me2f на следующем этапе. При этом фермент перемещается на один шаг по одноцепочечному участку матрицы, и выделяется 5-8 ккал, что приводит к сдвигу равновесия в сторону полимеризации [97]. Важно отметить, что реакция нуклеотндильного переноса обратима, и нрн достаточно высоких концентрациях пирофосфата в отсутствии NTP может происходить регенерация NTP (реакция нирофосфоролиза) [98]. Образование фосфодиэфирной связи, как правило, протекает с большими скоростями, и эта стадия редко определяет скорость всего процесса в целом [72, 89], Однако если один из нескольких предшествующих нуклеотидов праймера некомплсмснтарсн, скорость включения корректного NTP уменьшается на несколько порядков, что дает дополнительную возможность для включения механизмов коррекции и делает стадию нуклеотиднльного переноса скорость-лимита рующей [91]. Высвобождение пирофосфата протекает через стадию конформанионной перестройки комплекса в открытое состояние, что, возможно, является следствием высвобождения энергии при образовании новой связи. Эта энергия может расходоваться на возбуждение более высоких колебательных уровней дуплекса, что приведет к разрыву контактов, характерных для закрытого комплекса. Доказано, что практически все полимеразы в процессе катализа претерпевают конформацнонные изменения. Так, для ФК, до и после химической стадии обнаружены медленные процессы, которые могут принимать участие в повышении точности полимеразы [93]. Необходимо отметить, что такие изменения могут задействовать либо фермент, либо субстрат (или их обоих), и не обязательно должны быть большими в структурном выражении, чтобы быть значительными кинетически [3].
Остатки активного центра фермента способны катализировать реакцию путем ускорения той или иной ее стадии. В зависимости от своей природы, каталитические аминокислотные остатки могут напрямую способствовать протеканию химической стадии (это, в основном, кислоты и основания), ускорять химический или нехимический этап процесса, предпочтительно связывая субстрат в переходном состоянии, или могут связывать кофакторы, важные для катализа, например, ионы металлов [3J. Вероятно, не стоит думать, что для каждого аминокислотного остатка характерна только одна из перечисленных функций. Исходя из имеющихся на сегодняшний день данных рентгеноструктурного анализа, рассмотрим подробнее такие важные характеристики каталитической функции нолимераз как процессивность, конформацнонные изменения белковой глобулы, а также функцию ионов двухвалентных металлов, необходимых для катализа. 1.3.1. Ионы металла в активном центре полимеразы. Подобно большинству других ферментов, катализирующих реакции переноса фосфата, полимеразы осуществляют катализ только в присутствии двухвалентных ионов Mg2+ или Мп2+. Стейтц [69] предположил, что два иона металла в активном центре полимеразы способствуют катализу, его модель была построена на основе обобщения кристаллографических исследований связывания ионов металла в 3 -5 экзонуклеазном центре Е.соїі ДНКП I [8, 99]. В настоящее время роль этих ионов стала яснее благодаря кристаллографическим исследованиям каталитически компетентных комплексов полимераз с субстратами [15, 26, 37, 39].
Построение пространственных моделей.
В качестве исходной модели использовали трехмерную структуру комплекса ОТ с олигорибонуклеотидным дуплексом матрицы (25 н) и праймсра(21 н) и аналогом dNTP-ddTTP [27] (Brookhaven Protein Data Bank, ID IRTD). Для моделирования использовали программу WcbLabViewerPro 3.7 (Molecular Simulations Inc.). Дополнительные рибозныс остатки вводились в праймер в позиции, соответствующие модифицированным олигонуклеотидам П1-П6, Расположение и кої(формация дополнительного остатка рибозы были смоделированы в соответствии со структурой декамерного РІ ІК-дуплекса, содержащего 2 -0-8-0-рибофуранозиладенозин, определенной методом ЯМР (СУ-эидо- конформация, экспонирование в малую бороздку дуплекса, торзионный угол 02 -0"-С2 -02" - 134) [127]. В качестве оценки стерических затруднений между дополнительной рибозой и белком бели выбраны близкие межатомные контакты менее 70% сумм ковалентных радиусов. Н.3.2. Моделирование связывания аналогов в активном центре Т7 РНКП. Моделирование связывания аналогов 7-10 проводили с помощью программы WcbLabVicwcrPro 3.7 (Molecular Simulations Inc.) согласно инструкциям авторов. В качестве стартовой модели использовали структуру Т7 РНКП [37J (Brookhaven Protein Data Bank, файл 1QLN). Для построения модели связывания структура ингибитора предварительно оптимизировалась методом молекулярной механики ММ+ в программе HypcrChem 6.01 (Hypercube Inc). В качестве оценки стернчсских затруднений между ингибитором и белком были выбраны близкие межатомные контакты менее 70% сумм „, ковалентных радиусов. щ Ш. Обсуждение результатов.
Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых рнк-полимеразой бактериофага т7 и обратной транскриптазой вич-1 Все многообразие полимераз, катализирующих синтез РНК и ДНК, как было описано в литературном обзоре, принято разделять па 4 класса в зависимости от их матричной (РНК- или ДНК-зависимые полимеразы) и субстратной специфичности (РНК- или ДНК-полимераза). Такое разделение обычно относится к специфичности фермента, проявляемой in vivo. Полимеразы могут катализировать in vitro несвойственные для них процессы, хотя с пониженной эффективностью и/или в резко отличающихся от природных условиях. Например, некоторые ДНК-зависимые полимеразы способны выступать в роли ОТ, используя в качестве субстрата РНК-матрицу [128]. С другой стороны, ДНК-зависимые РНК-полимеразы способны катализировать не ДНК-, а РНК-зависимый синтез in vitro [129]. Однако в отношении нуклеотидного субстрата специфичность полимераз гораздо выше. Несмотря на большое количество работ, посвященных разрешению кристаллических каталитически компетентных комплексов нуклеотид-полимераз, структурные нюансы, обеспечивающие подобную высокую специфичность этих ферментов, не всегда понятны. В данной работе мы постарались рассмотреть некоторые аспекты специфичности нуклеотид-полимераз с использованием неканонических субстратов. В качестве объектов нами были выбраны ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага Т7 (Т7 РНКП) и обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека 1 типа (ОТ ВИЧ-1), представляющие два различных семейства нуклеотид-полимераз. ИМ Синтез сметанных рибо/дезоксирибополнкуклеотигюв мутантной ФОРМОЙ Т7 РНКП. Т7 РНКП широко используется для получения специфических транскриптов, а благодаря своим молекулярным свойствам, фермент является удобной моделью для изучения биосинтеза нуклеиновых кислот. В частности, в нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучались функциональные свойства мотива В Т7 РНКП. Было показано, что остаток Тугб39 определяет специфичность фермента но отношению к rNTP, а мутант Туг639Рле приобретает способность использовать в качестве субстратов как rNTP, так и dNTP. Введение дополнительной мутации Ser641Ala многократно усиливает это свойство [87]. Таким образом, Тугб39Рпе, Scr641Ala мутант Т7 РНКП способен включать dNTP в растущую цепь РНК вместо соответствующего rNTP. Это даст возможность ферментативно синтезировать новый промежуточный класс нуклеиновых кислот - дсзоксинуклсотидсодсржащие РНК-подобные одиоцепочечные полипуклсотиды, то есть смешанные рибо/дезоксирибонолинуклеотиды (СПН), в которых один или несколько типов rNMP заменены на соответствующий тип dNMP. В первой части работы мы попытались сформулировать общие принципы синтеза СПН определенного нуклеотидного состава и получить такие СПН в препаративных количествах. Как известно, последовательность инициаторной области влияет на эффективность транскрипции (выход полноразмерного продукта), количество и тип абортивных продуктов реакции. Для исследования основных закономерностей препаративного синтеза СПН нами в качестве матриц для транскрипции был использован набор плазмид, содержащих консенсусную последовательность Т7 промотора (от положения -17 до -1 относительно старта транскрипции), GTP в +Ї положении и различную последовательность нуклеотидов в области инициации (таб. Ш.1). СПИ были синтезированы в процессе run-ofT транскрипции.
Плазмиды линеаризовали с помощью эндонуклеаз рестрикции, выбирая последние таким образом» что конец транскрибируемого участка был Чупым" (то есть З -конец нематричной цепи полностью комплементарен 5 -концу матрицы) или образовывался выступающий З -конец. В таблице ПІЛ приведены рсстриктазы, использованные для линеаризации плазмид, и длина продуктов, получаемых в результате піп-off транскрипции с этих матриц. При электрофорезе в агарозном геле в ряде случаев наблюдали несколько полос продуктов в области, соответствующей длинам полноразмерных транскриптов. Однако электрофорез в ПААГ (в денатурирующих условиях) во всех случаях эффективной транскрипции показывал наличие единственного полноразмерного продукта с подвижностью, близкой к подвижности контрольной РНК. Пример анализа такого рода показан на рисунке III. 1. Данные ПААГ позволяют предположить, что в условиях неденатурирующего электрофореза в агарозном геле мы наблюдаем присутствие транскриптов с различной вторичной структурой, обуславливающей разницу в их подвижности. Для подтверждения данного предположения одну из полос элюировали из агарозного геля и проводили повторный электрофорез, в котором наблюдали ту же картину разделения продуктов (данные не приведены). На рис. Ш.1 представлены результаты агарозного (рис. ШЛА) и полиакриламидного (рис. ШЛБ) гсль-электрофорезов продуктов, полученных в процессе run-ofT транскрипции на матрице рР\Д9Шш1. Как видно, не все комбинации r/dNTP приводят к эффективному синтезу полноразмерного транскрипта. В частности, не было получено определяемых этими методами количеств dG-содержащего продукта. Уменьшение выхола остальных СПН наблюдали в следующем порядке РНК dT-PHK dC-PHK dTdC-РНГ dA-PHK, что соответствовало позиции первого включения нуклеотида в растущую цепь (dT +8, dC +7, dA +4). Практически такие же закономерности синтеза СПН были выявлены для большинства тестируемых плазмид. На рис. III.2 А представлены значения относительного выхода СПН с различными комбинациями r/dNTP. Включение dGMP не возможно во всех случаях, а относительный выход синтезируемых продуктов полностью соответствовал позиции первого включения dNTP. Последнее утверждение ясно иллюстрируется на рис. ІІІ.2Б. Так, для плазмид pT5Fo и pLys,3 не было получено dC-СПН (позиция первого включения С +2), тогда как для pGEM-2, где первое dTMP включение возможно только в позиции +15, эффективность синтеза dT-СПН практически равна таковой для РНК (98%). Вероятно, фермент становится нечувствительным к различиям между rNTP и dNTP, когда расстояние от старта транскрипции превышает некоторое фиксированное значение.
Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1.
Одним из результатов первой части работы явилась возможность препаративного получения набора смешенных полинуклеотидов (СПН), имеющих одинаковую последовательность и различающихся только соотношением рибо- и дезоксирибо-оснований в полимере. Такого типа полинуклеотиды удобно использовать в качестве неканонических субстратов для изучения специфичности различных ферментов нуклеинового обмена, таких как нуклеотид-нолимеразы, нуклеазы, метилазы и т.д. Как известно, ОТ ВИЧ-1, являющаяся ключевым ферментом метаболизма этого вируса, способна утилизировать как ДНК, так и РНК. В ряде работ было показано, что сродство ОТ по отношению к РНК- и ДНК- матрицам in vitro различается на один-два порядка [121]. Причины таких значительных различий до конца не выяснены. С другой стороны, на сегодняшний день интересным остается изучение феномена устойчивости ВИЧ-1 к различным ингибиторам, сопровождающегося появлением характеристических точечных мутаций в гене ОТ. Хотя по последним данным рентгеноструктурпых исследований позиции мутаций устоичивочти локализованы вокруг dNTP-связывающего центра, в ряде работ показано, что эти замены могут так же влиять и на удерживание ферментом матрицы/нраймера [26, 51 ]. Направление синтеза ДНК 4— ДНК-пранмф (20н.) . считываемая область (78 н.) 3 —и"" 51 5 ц У Полноразмерная РНК или СП (109 н.) Рис. Ш.6. Схема реакции обратной транскрипции, использованная в работе. В скобках указаны размеры полинуклеотидов. В данной части работы мы решили изучить возможность использования СПН в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1 и ряда се «AZT-устойчивых» мутантных форм и сравнить основные характеристики этого процесса с таковыми для РНК и ДНК. Из ряда мутантных форм ОТ, обеспечивающих устойчивость к азидотимидину, нами были выбраны 4 фермента, несущие одну, две, три или четыре аминокислотные замены: Lys219Gln ОТ (ОТ219); Asp67Asn, Lys219Gln ОТ (OT67,2I9); Asp67Asn, Lys70Arg, Lys219Gln ОТ ОТ67,70,219); Asp67Asn, Lys70Arg, Thr215Phe, Lys219Gln ОТ (OT67,70,215,219). В качестве субстратов мы использовали СПН, полученные на матрице pPV19: dC-PHK, dT-PHK и dTdC-PHK, а также РНК соответствующей последовательности.
Полученные СПН и РНК отжигали с одним и тем же олигонуклеотидным праймером и использовали в качестве матрицы/прайм ера в реакции обратной транскрипции, катализируемой ОТ и се «AZT-устойчивыми» мутаптными формами. На рис. III.6 приведена схема обратной транскрипции с указанием размеров матрицы, праймера и области удлинения. В реакции удлинения праймера как для СПН, так и для РНК нами показана эффективная утилизация матрицы/праймера Относительная эффективность синтеза ДНК при насыщающих концентрациях субстратов показана на рисунке II 1.7. Как видно, для всех СПН количества полученных продуктов реакции сравнимы с таковыми для РНК-зависимого синтеза. В работе нами было показано, что первичная последовательность СПН полностью идентична структуре РНК, поэтому сравнение значений кажущихся Кт позволяет сделать выводы о чувствительности ОТ к соотношению остатков рибо- и дезоксирибонуклеотидов в матрице. В таблице Ш.2 приведены величины Kj" матрицы/праймера для ОТ дикого типа и «AZT-устойчивых» мутантных форм. В соответствии с известной субстратной специфичностью, максимальное сродство ОТ проявлялось по отношению к ДНК, а минимальное - к РНК матрицам. Соответствующие значения Km" для СІШ занимали промежуточное положение. Введение rNTP даже одного типа в РНК цепь приводило к понижению величины Km" . ЭТО утверждение справедливо как для нативной ОТ, так и для всех протестированных мутантов. По всей видимости, ОТ способна различать остатки rNTP и dNTP в матричной цепи, и это вносит свой вклад в значение К 0. Для экспериментального подтверждения этого предположения мы провели дальнейший кинетический анализ. Согласно данным Реардона и др. [133], в случае ОТ Km 0 Для матрицы/праймера близка величине К& Кроме того, многие авторы предполагают, что существует тесная связь между значениями Кт и Kd , характеризующими связывание матрицы/праймера ОТ [134, 135]. Поскольку синтез ДНК, катализируемый ОТ, представляет собой мультистадийный процесс, то в соответствии с соотношением Бригтса-Хэлдана, значение КаГ 0 полной реакции синтеза будет равно суперпозиции всех промежуточных равновесных стадий, отражая многочисленные стадии связывания/диссоциации комплекса фермент-матрица/прайм ер (если реакция полностью дистрибутивна) или изомеризацию того же комплекса (в случае ее процессивности). Таким образом, синтез ДНК длиной N нуклеотидов может быть представлен следующим образом: ) N кткаж=Пда, і ы где К— «элементарная» равновесная константа для каждой стадии реакции. Каждая стадия, вне зависимости от механизма реакции (процессивный или дистрибутивный), состоит из образования продуктивного комплекса между ферментом и матрицей/праймером с последующим связыванием нуклеотида и синтеза фосфодиэфирной связи. Связывание «правильного» dNTP в основном определяется взаимодействиями между приходящим субстратом и соответствующим нуклеотидом в последовательности матрицы.
Поскольку сродство ОТ к ДНК и РНК значительно различается [121], можно предположить, что кроме контактов Уотсона-Крика между основаниями, остатки сахара (рибоза или дезоксирибоза), находящиеся в активном центре на каждой стадии, также вносят свой вклад в константу «элементарного» сродства. Это означает, что «элементарная» константа стадии, в которой приходящий dNTP взаимодействует с комплементарным рибо нуклеотидом в матричной цепи (KrJ), должна отличаться от константы в случае контактов dNТР - дезоксирибонуклеотид (Км). Таким образом, в случае СПН-матрицы длиной N нуклеотидов с числом рибонуклеотидов п, справедливо следующее равенство: где /Ггч/ и Kd-d-- «элементарные» константы реакционных стадий. Следовательно, и график зависимости Km " от п должен быть линейным, отсекая на оси ординат значение Nln/foj/ и с тангенсом угла наклона 1п(Л"гч/ /Kj ). Такого вида зависимость на основе значений К ! для СПН, полученных в нашей работе, приведена на рисунке ШЛО. Теоретические значения /С/"" » рассчитанные по уравнению 3 (таб. Ш.2, приведены в скобках), хорошо согласуются с экспериментальными данными. Таким образом, полученные данные подтверждают предположение о том, что остатки сахара цепи матрицы, находящиеся в активном центре фермента, влияют на характер ДНК-белковых взаимодействий, что находит отражение в значениях Км 0 . Ранее было показано, что З -концевой нуклеотид праймера и, в частности, соответствующий углеводный остаток влияют на сродство ОТ [136]. Так, значения Ks для AZT-терминированных комплексов поли(гА)/олиго(а Т) приблизительно в три раза меньше величин Kd для нетермшшрованных аналогов дуплексов в реакции с ОТ [136]. Данные, приведенные в данной части работы, позволяют предположить, что тип сахара остатка нуклеотида матрицы, спаренного с входящим dNTP непосредственно после 3 -конца праймера, так же влияет на сродство ОТ по отношению к матрице/праймеру. - Сравнение величин Кг и Kd-d для ОТ д.т. и ее мутантных форм показало, что эти величины близки (таб. II 1.2). Этот результат означает, что «AZT-устойчивые» мутанты, по всей видимости, лс чувствительны к тонким взаимодействиям между входящим dNTP остатком нуклеотида матрицы, к которым он спаривается. Это не удивительно, поскольку остатки замещенных аминокислот (67, 70 и 215) расположены достаточно далеко от сайта связывания dNTP и не способны непосредственно влиять на образование комплементарной пары между входящим нуклеотидом и соответствующим остатком матрицы. Только остаток 219 локализован возле dNTP связывающего сайта, но его роль, вероятно, сводится в основном к изменению сродства фермента к азидо-груине, и он также не принимает непосредственного участия в образовании комплементарной пары в активном центре фермента. Таким образом, можно полагать, что результаты, полученные в данной части работы демонстрируют преимущество использование СПИ. в качестве инструмента для изучения нуклеин-белковых взаимодействий. Использованный в работе кинетический подход, по всей видимости, применим и для других нуклеотндных полимераз. Единственное видимое ограничение использования уравнения 3 присутствует в случае, если фермент строго процессивен, и равновесная константа стадии инициации (связывания ферментом матрицы/праймера) сильно отличается {но крайней мере на один порядок) от значений констант всех последующих стадий изомеризации. В этом случае в уравнение 3 должен быть введен дополнительный член \пКг,ниіг константа инициации. Это изменение приводит к тому, что расчет значений Kr-d и Ka-d. требует предварительного определения Киищ в дополнительных экспериментах.
