Введение к работе
Актуальность работы. Рекомбинационный процесс является основой непостоянства генома, это источник новых комбинаций существующих единиц наследственности [Holliday, 1964, 1974]. Четырёх-нитевой перекрест или так называемая структура Холлидея образуется в результате взаимодействия двух молекул ДНК в том месте, где их последовательности отличаются высокой степенью подобия. Точка перекреста (обмена нитями между двумя молекулами) способна самопроизвольно мигрировать в пределах участка высокой гомологии между молекулами [Hsieh, Panyutin, 1995]. Однако, миграция точки перекреста на протяжённом участке невозможна без соответствующего ферментативного аппарата. В силу спиральной формы молекул, при продвижении в любую сторону точки перекреста, неизбежно будут возникать отрицательные или положительные сверхвитки на обеих взаимодействующих сторонах. Данное обстоятельство накладывает существенные ограничения как на скорость миграции перекреста, так и на конечное расстояние, которое способен пройти этот комплекс. В разрешении возникающей ситуации принимают участие перекрест-расщепляющие ферменты (junction resolving enzymes) или резолвазы [Lilley, White, 2001]. Протяжённость участка, на котором взаимодействующие молекулы способны произвести обмен цепями, зависит от ориентации относительно перекреста точки разрешения.
Способность резолваз различать спаренные и неспаренные основания в молекулах ДНК находит применение для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма, составляющего значительную долю вариабельности человеческих геномов [Lishanski, 2000; Lishanski et al., 2000; Yang et al., 2003; Pule et al., 2008]. Причем, несмотря на то, что методов выявления однонуклетидных замен предложено довольно много, ряд из них характеризуются невысокой специфичностью, тогда как считается, что разрешение образующихся четырех-нитевых структур Холлидея крайне
чувствительно к спариванию / неспариванию азотистых оснований. Одним из таких важных ферментов является эндонуклеаза бактериофага Т7, производимая единственной фирмой New Englands Biolabs, Inc. (США) и характеризующаяся высокой стоимостью. В этой связи представляет интерес клонирование гена данной эндонуклеазы, создание на его основе штамма-суперпродуцента, обеспечивающего наработку функционально активного белка.
Цель работы - создание бактериального {Escherichia соїї) штамма-суперпродуцента эндонуклеазы I бактериофага Т7 и использование рекомбинантного фермента для разрешения структур типа Холлидея и изучения однонуклеотидных замен.
Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Амплификация, клонирование и секвенирование гена бактериофага Т7, кодирующего эндонуклеазу I.
-
Создание генно-инженерных конструкций на основе экспрессирующих векторных молекул, несущих ген t7el в различных штаммах E.coli.
-
Получение штаммов-продуцентов эндонуклеазы Т7Е1 на основе культуры клеток E.coli.
-
Создание штамма-суперпродуцента эндонуклеазы Т7Е1 на основе вектора рЕТ22-ЬТ7.
-
Оптимизация условий очистки целевого белкового продукта.
-
Оценка специфической ферментативной активности очищенного белкового экстракта, включая разрешение структур типа Холлидея и детекцию однонуклеотидных замен по конечной точке и в режиме реального времени.
Научная новизна. Показано, что рекомбинантная Т7Е1 эндонуклеаза способна разрешать четырех-нитевые перекресты или структуры Холлидея, а также различать спаренные и неспаренные азотистые основания, в том числе, в режиме реального времени, что позволяет рекомендовать данный фермент для выявления однонуклеотидного полиморфизма ДНК человека.
Научно-практическая значимость работы. Создан штамм-суперпродуцент фермента Т7Е1, находящего новое применение в анализе
полиморфизма ДНК. Оптимизация отдельных стадий технологии получения и очистки рекомбинантной Т7 эндонуклеазы I из штаммов E.coli обеспечивает наработку функционально активного фермента в количестве до 50 мг/л жидкой культуры.
Конкурсная поддержка работы. Данная работа проводилась в рамках государственного контракта №02.740.11.0290 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на II школе-конференции молодых учёных «ЭкоБиотех-2011» (Уфа, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах, содержит 28 рисунков и 4 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 155 работ.
Похожие диссертации на Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 и создание штаммов-суперпродуцентов
