Введение к работе
Актуальность проблемы. Литические ферменты представляют собой чрезвычайно разнообразную группу белков, которые осуществляют гидролиз различных структурных компонентов клеточных стенок микроорганизмов, что приводит к их лизису. Бактериолитические ферменты разрушают пептидогликан, главный структурный компонент бактериальной клеточной стенки. В зависимости от того, какой участок пептидогликана они гидролизуют, бактериолитические ферменты разделяются на четыре группы. Глюкозаминидазы и мурамидазы расщепляют различные участки глюкановых цепей пептидогликана, амидазы гидролизуют амидную связь между мурамовой кислотой и пептидной субъединицей, и пептидазы (эндопептидазы) расщепляют пептидные связи в пептидных субъединицах или межпептидных мостиках.
Все живущие в настоящее время организмы – от высших животных и человека до бактерий и вирусов – способны синтезировать бактериолитические ферменты. Лизоцимы слизистых оболочек животных обеспечивают им защиту от проникновения патогенных микроорганизмов. Секретируемые в окружающую среду бактериолитические ферменты микроорганизмов обеспечивают их питанием, источниками энергией, строительным материалом за счет других организмов и собственных отмерших клеток. Бактериолитические ферменты выполняют также регуляторные функции: участвуют в сложных процессах развития микробных клеток и вирусов, в частности, в спорообразовании и фаговой инфекции, соответственно.
Бактериолитические ферменты используются для проведения экспериментов в молекулярной и клеточной биологии: при изучении строения и функционирования бактериальных клеточных стенок, в реакциях протеолиза для изучения структуры белков. Препараты на основе бактериолитических ферментов применяются для борьбы с антибиотико-устойчивыми патогенными микроорганизмами: ахромопептидаза из Achromobacter lyticus, лизостафин из Staphylococcus simulans, лизобакт, ларипронт и яичный лизоцим.
Бактерии рода Lysobacter представляют интерес для прикладной и фундаментальной науки и интенсивно изучаются уже с 1970-х гг, поскольку синтезируют различные литические ферменты. Антимикробный препарат лизоамидаза, получаемый на основе культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1, активен против бактерий родов Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus, Corynebacterium, Streptomyces и др., дрожжей, например, родов Saccharomyces и Candida. Показано, что антимикробное действие препарата обеспечивают пять бактериолитических ферментов и дрожжелитическая металлопротеаза. Бактериолитические ферменты лизоамидазы представлены тремя эндопептидазами L1, L4 и L5, а также N-ацетилмурамоил-L-аланин амидазой L2 и мурамидазой L3. В настоящее время все они выделены из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 и в различной степени охарактеризованы.
По данным ингибиторного анализа эндопептидазы L1, L4 и L5 отнесены к семейству сериновых протеаз. По отношению к бактериальным пептидогликанам эндопептидаза L1 (~22 кДа) проявляет амидазную и эндопептидазную активности (гидролизует амидную связь между мурамовой кислотой и аланином, пептидные связи между диаминопимелиновой кислотой и аланином, а также между глицинами межпептидного мостика). Наиболее выражена у L1 именно эндопептидазная активность.
Эндопептидаза L5 (~26 кДа) содержится в культуральной среде в существенно меньших количествах, чем L1, и ее ферментативные свойства мало изучены. В отличие от L1, эндопептидаза L5 обладает только эндопептидазной активностью.
Эндопептидазы L1 и L5 являются термостабильными ферментами с оптимумом реакции 70 и 80 С, соответственно. Они проявляют различный спектр антимикробной активности. Так, например, клетки Bacillus subtilis и Micrococcus luteus разрушают оба фермента. В тоже время, только эндопептидаза L1 способна разрушать живые клетки Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, а эндопептидаза L5, в отличие от L1, способна разрушать живые клетки Kocuria rosea, Corynebacterium flavum, Alcaligenes faecalis.
К началу данной работы информация о структуре генов литических ферментов Lysobacter sp. XL1 отсутствовала. Поэтому, актуальным для дальнейших научных исследований и прикладных разработок являлось их идентификация и характеристика.
Цель исследования. Цель данной работы заключалась в клонировании и определении нуклеотидной последовательности генов бактериолитических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp.XL1 и создании штаммов-продуцентов этих ферментов на основе бактерий рода Pseudomonas.
Задачи исследования:
-
Клонировать гены бактериолитических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp.XL1 и определить их нуклеотидную последовательность;
-
Проанализировать экспрессию генов эндопептидаз L1 и L5 на уровне транскрипции в Lysobacter sp. XL1;
-
Сконструировать систему экспрессии генов эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1 в бактериях рода Pseudomonas и проанализировать её эффективность.
Научная новизна работы. В данной работе определена нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомы ДНК Lysobacter sp. XL1 размером 9017 п.н., в котором локализованы гены эндопептидаз L1 и L5 (alpA и alpB, соответственно).
На основании анализа выведенных аминокислотных последовательностей определены структурные особенности эндопептидаз L1 и L5. В частности показано, что они синтезируются в виде препробелков: на N-конце расположен сигнальный пептид, за ним следует про-часть и затем зрелый фермент. Установлено, что эндопептидазы L1 и L5 являются близкими по размеру гомологичными белками, последовательности их препробелков идентичны на 62%. По результатам проведенного филогенетического анализа эндопептидазы L1 и L5 были отнесены к подсемейству S1Е семейства S1 клана PA сериновых пептидаз.
В данной работе впервые проведен анализ экспрессии генов эндопептидаз L1 и L5. Установлено, что данные гены транскрибируются индивидуально, каждый с собственного промотора, а транскрипты обнаруживаются на поздней экспоненциальной стадии роста. Определены размеры 5- нетранслируемых областей мРНК alpA и alpB. На основании анализа нуклеотидной последовательности предсказаны промоторные области генов alpA и alpB, а также наличие Rho-независимых терминаторов транскрипции.
Впервые сконструирована система экспрессии секретируемых бактериолитических эндопептидаз на основе P. fluorescens. Полученные рекомбинантные штаммы-продуценты эффективно секретируют активные эндопептидазы L1 и L5 в культуральную жидкость.
Научно-практическое значение работы. Полученные в данной работе результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Рекомбинантные эндопептидазы могут быть использованы в молекулярной и клеточной биологии для разрушения клеток различных микроорганизмов и определения структурных компонентов их клеточных стенок. Кроме этого, в медицине и фармакологии эндопептидазы, как по отдельности, так и в комбинации друг с другом, или другими литическими ферментами, могут быть использованы для создания антимикробных препаратов.
Результаты данного исследования открывают возможности дальнейшего изучения механизмов регуляции экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Lysobacter sp. XL1.
Сконструированная на основе бактерий рода Pseudomonas система экспрессии может быть использована для наработки в псевдомонадах рекомбинантных белков, продукция которых в других продуцентах затруднена вследствие их токсичности, нерастворимости и низкого уровня экспрессии.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Москва, декабрь 2005), на 10-, 11- и 12-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2006, 2007, 2008), на международной конференции «Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (Madison, 2007), на IV-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, июнь 2009), на международном конгрессе и выставке по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010», на Всероссийский симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).
Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре лабораторий молекулярной микробиологии, биологии плазмид и биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ФГБУН Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе две статьи и два патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список цитируемой литературы. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста и содержит ___ рисунков и ___ таблиц. Список цитируемой литературы содержит ____ источников, в том числе ___ на русском языке.
