Введение к работе
Актуальность темы. Существенным фактором окружающей среды,
ограничивающим географическое распространение и сроки вегетации растений, является пониженная температура. Многочисленные исследования показали, что холодостойкость - комплексный признак, проявляющийся при слаженном действии различных систем растительного организма (Guy et al., 2008). Она достигается в ходе так называемой холодовой акклимации, которая происходит при экспозиции растений при низких незамораживающих температурах. Холодовая акклимация включает активацию множественных механизмов, вносящих вклад в повышение устойчивости растения к низкотемпературному стрессу. Понижение температуры приводит к индукции экспрессии определенных генов. Многие из этих генов, наряду с холодом, индуцируются также и некоторыми другими стрессовыми воздействиями. Показано, что гены холодового ответа кодируют разнообразный набор белков, включая ферменты дыхания и метаболизма углеводов и липидов, антиоксиданты, молекулярные шапероны, антифризные белки (Thomashow, 1999; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Walter et al., 2011).
Многие регулируемые холодом и дегидратацией гены в промоторных областях содержат одну или несколько копий последовательностей, обозначенных как DRE (dehydration-responsive element)/CRT (C-repeat) цис- элементы. С этими цис-элементами, в составе которых имеется консенсусная последовательность A/CCGACNT, связываются транскрипционные факторы CBF1, CBF2 и CBF3 (CRT-binding factor), в результате чего транскрипция генов, регулируемых холодом или дегидратацией, значительно активируется. Различия в устойчивости растений к низким температурам, определяемые экспрессией регулируемых холодом генов, могут быть обусловлены разным набором генов, относящихся к CBF-регулону, которых у теплолюбивых растений обнаруживается меньше, чем у растений, способных к холодовой акклимации, или отличиями в строении промоторных областей COR (cold- responsive)-reHOB по количеству содержащихся в них CRT/DRE мотивов (Jaglo et al., 2001; Zhang et al., 2004; Zhang et al., 2011). Известны и другие механизмы регуляции экспрессии генов, в частности, обусловленные изменениями конформации хроматинового комплекса за счет обратимой конверсии транскрипционно активного эухроматина в транскрипционно неактивный гетерохроматин, различающиеся степенью метилирования цитозина в симметричных CG и CNG последовательностях, а так же в несимметричной CNN последовательности, степенью ацетилирования гистонов и плотностью упаковки хроматина, что меняет доступность хроматина для РНК-полимераз (Bird, 2002).
Известно, что метилирование ДНК находится под контролем различных биотических и абиотических факторов, влияющих на рост и развитие растений. Например, установлено, что внешние воздействия вызывают деметилирование целого ряда цитозинов как в промоторных областях, так и в кодирующих последовательностях генов (Sherman, Talbert, 2002; Madlung, Comai, 2004; Чемерис и др., 2007; Choi, Sano, 2007; Gonzalez et al., 2011). Что касается холодового стресса, показано, что длительное охлаждение корней сои приводило к увеличению доли гетерохроматина и уменьшению доли эухроматина (Stepinski, 2012). Также было обнаружено, что холодовая обработка проростков кукурузы сопровождается общим снижением степени метилирования ДНК (Steward et al., 2002). Однако изменения уровня метилирования отдельных генов в связи с развитием устойчивости к холодовому воздействию изучены недостаточно.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы - выяснение механизмов регуляции экспрессии и уровня метилирования генов транскрипционных факторов CBF у растений капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи: 1. Определить нуклеотидные последовательности промоторных областей генов CBF капусты.
-
Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов CBF капусты, рапса, арабидопсиса и др.
-
Определить уровень экспрессии генов CBF закаленных и незакаленных растений в норме и при холодовом стрессе.
-
Определить характер и степень метилирования промоторных последовательностей генов CBF растений, выращенных в нормальных температурных условиях, при пониженной температуре, а также после снятия низкотемпературного стресса.
Научная новизна. Изучена экспрессия гена транскрипционного фактора CBF капусты, являющегося ключевым элементом в запуске механизма развития устойчивости растений к холодовому стрессу, в нормальных температурных условиях, при холодовом стрессе и при закаливании. Исследована степень метилирования цитозинов в промоторном участке гена CBF капусты у проростков, прошедших и не прошедших этап закаливания. Обнаружено, что у растений, прошедших этап холодового закаливания, происходит уменьшение степени метилирования последовательности ДНК промотора. Исследовано изменение статуса метилирования промоторной области гена CBF капусты после окончания цикла закаливания и показано частичное восстановление метилирования в ранее деметилированных участках промоторной области этого гена.
Полученные нами данные углубляют представления о процессах восприятия растениями холодового сигнала окружающей среды.
Научно-практическая значимость работы. Знание молекулярных механизмов развития холодостойкости и закаливания растений, а также выяснение возможной роли процессов метилирования/деметилирования в активации регулируемых холодом генов, может послужить основой для развития новых стратегий усиления холодостойкости и увеличения продуктивности, а также расширения области возделывания сельскохозяйственных культур.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VII съезде Общества физиологов растений (Нижний Новгород, 2011), II и III школе-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона по физико- химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011; 2012), III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии и химии» (Запорожье, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из перечня ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 220 наименований, в том числе 195 работ иностранных авторов. Работа изложена на 110 страницах и содержит 14 рисунков и 3 таблицы.
