Введение к работе
Актуальность проблемы. Метилирование ДНК - эпигенетический механизм, обнаруженный в геномах как прокариот, так и эукариот. Нарушения метилирования ДНК могут приводить к геномной нестабильности и нарушенной экспрессии генов. Подобные изменения в половых клетках или на ранних этапах онтогенеза способны вызвать фатальные нарушения развития. За последние четверть века многократно показано, что в раковых клетках нарушено метилирование ДНК. При этом наблюдается гипометилирование повторяющихся элементов, что приводит к нестабильности генома. Другие участки, например, CpG-островки промоторов генов-супрессоров опухолевого роста, напротив, гиперметилируются, способствуя быстрому росту раковых клеток. Кроме того, недавно установлена роль ДНК-метилирования в развитии неврологических и ряда других заболеваний, её зависимость от факторов внешней среды. В этой связи в научной и клинической практике применяется большое число методик, направленных на определение метилирования как отдельных последовательностей ДНК или конкретных CpG-динуклеотидов, так и всего генома с нуклеотидным разрешением (метилома).
В основе многих методов определения метилирования лежит обработка ДНК бисульфитом натрия, в результате которой неметилированный цитозин превращается в урацил, а 5-метилцитозин остается неизменным. Бисульфитная обработка предоставляет возможность определить степень метилирования отдельных CpG-динуклеотидов, однако, эти методы остаются трудоемкими и дорогими. После бисульфитной конвертации последовательности ДНК, по-сути, состоят из трех типов оснований, что усложняет обработку результатов. Методы другой группы, основанные на применении метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции, также имеют серьезное ограничение, т.к. зависят от наличия специфических сайтов рестрикции в анализируемой ДНК. Поэтому разработка новых информативных и достоверных методов определения метилирования ДНК остается актуальной задачей.
Сегодня все более широкое применение находят методы обогащения ДНК метилированными фракциями, что достигается путем взаимодействия с ДНК специфических белков, обладающих сродством к метилированным последовательностям. При некоторых недостатках, такой подход, тем не менее, позволяет значительно сократить объем и стоимость исследования, облегчить обработку результатов. Для связывания метилированной ДНК обычно используют антитела к 5-метилцитозину или MBD домен (methyl-CpG-binding domain) метил-ДНК связывающего белка MBD2, принадлежащего к семейству MBD - белков. Однако, известно еще одно семейство метил-ДНК-связывающих белков, включающее Каизо и Каизо-подобные белки. Поскольку эффективность связывания метилированных последовательностей белками MBD2 и Каизо различна - MBD2 обладает сродством к одиночным метилированным CpG, а Каизо - преимущественно к CpGpCpG-тетрануклеотидам - представляет интерес сравнить их с точки зрения использования для определения уровня и участков метилирования ДНК.
Белок Каизо принадлежит к семейству Каизо, которое выделяется по трем характеристикам: 1) способности связывать метилированную ДНК; 2) наличию BTB/POZ домена и 3) наличию нескольких доменов «цинковые пальцы». Три домена «цинковые пальцы» Каизо определяют его уникальные ДНК-связывающие свойства: во-первых, Каизо является метил-ДНК-связывающим белком, а, во-вторых, при определенных условиях в системе in vitro может связывать неметилированную специфическую последовательность CTGCNA. Однако, вопрос о том, какая из этих двух активностей преобладает in vivo, остается спорным. При этом внесение ясности в эту проблему интересно как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения, т.к. определит возможность применения Каизо для определения метилирования ДНК.
Цель и задачи исследования:
Цель данной работы состоит в получении и характеристике аффинного сорбента на основе домена «цинковые пальцы» белка Каизо и применении его для определения метилирования ДНК.
В связи с указанной целью были поставлены следующие задачи:
-
Создать сорбент на основе доменов «цинковые пальцы» белка Каизо и описать его свойства в сравнении с метил-ДНК связывающим сорбентом на основе белка MBD2.
-
Применить сорбенты Каизо и MBD2 для сравнительного поиска метилированных участков эукариотического генома (на примере клеточной линии НЕК 293).
-
Определить, какая из двух активностей Каизо - метил-ДНК связывающая или CTGCNA-связывающая - является доминирующей.
-
Применить сорбент Каизо для поиска метилированных участков прокариотического генома (на примере бактерии Helicobacter pylori). Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые создан
аффинный сорбент на основе доменов цинковые пальцы метил-ДНК-связывающего белка Каизо. Сорбент Каизо обладает аффинностью к метилированной ДНК; это свойство может быть использовано для анализа метилирования ДНК. Для сорбента Каизо характерна высокая специфичность в отношении метилированных CG-богатых последовательностей генома -метилированных CpG-островков и промоторов генов. Это свойство отличает сорбент Каизо от сорбента MBD2, который обладает более широкой специфичностью, связывая последовательности с разным CG-составом и уровнем метилирования.
В работе показано, что in vitro Каизо обладает более высокой аффинностью к метилированной ДНК, чем к неметилированной последовательности CTGCNA. Этот вывод, помимо фундаментального, имеет важное практическое значение, которое заключается в том, что сорбент Каизо позволяет получать фракции ДНК, обогащенные именно метилированными последовательностями.
Сорбент Каизо может быть использован как для анализа метилирования отдельных последовательностей ДНК, так и целых геномов, в т.ч. при раковой трансформации. При этом, благодаря повышенной аффинности к CG-богатым последовательностям, сорбент Каизо представляется более предпочтительным,
чем сорбент MBD2, для анализа метилирования раковых клеток, т.к. позволяет с высокой специфичностью обнаруживать гиперметилированные CpG-островки.
Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» от 1 декабря 2010 г. Результаты настоящей работы доложены автором диссертации на 13 Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пушино, 2009 г.), 14 Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2010 г.), Международной конференции «Epigenetics Europe» (Дублин, 2010 г.), III Всероссийской школе-семинаре молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на отечественных и международных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка публикаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на/^у страницах машинописного текста и содержат ) таблиц и р[У рисунков. Список литературы включает/п I) источников.
