Введение к работе
Актуальность исследования
Селен- содержащий белок млекопитающих (SelV) относится к новому семейству редокс (Rdx) белков, функции которых до конца остаются неизученными. Однако, наличие консервативного CXXC/CXXU мотива (где С-цистеин, Х- любая аминокислота, U-селеноцистеин) в каталитических центрах данных белков и тиоредоксин- подобной укладки свидетельствуют об их участии в окислительно-восстановительных реакциях.
На данный момент известно, что SelV млекопитающих (34.6 kDa) является гомологом известного селен- содержащего белка SelW и несет дополнительный N- концевой пролин- богатый домен, кроме того, показано, что мРНК SelV экспрессируется исключительно в семенниках (сперматоцитах). Одним из основных эффектов селена считается его влияние на мужскую фертильность, что особенно хорошо показано на моделях животных с нарушенным синтезом и/или метаболизмом селен- содержащих белков. Эти данные дают основание предположить, что SelV может играть важную роль в сперматогенезе, поэтому выяснение механизмов функционирования данного белка является крайне актуальной проблемой.
Данная работа посвящена исследованиям внутриклеточной локализации, поиску белков- партнеров SelV, а также выявлению экспрессии его мРНК в процессе сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих. Полученные в ходе нашей работы результаты способствуют установлению роли SelV в белковых комплексах или в метаболических путях, что очень важно для накопления фундаментальных знаний.
Цель исследования
Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих (SelV).
Задачи исследования
Клонирование полученных путем сайт- направленного мутагенеза вариантов рекомбинантного SelV мыши (Mm musculus) в составе векторов, предназначенных для экспрессии в прокариотической и эукариотической системах.
Определение локализации полноразмерного SelV, а также его N- и С-концевых доменов в клетках млекопитающих линии COS-7.
Поиск белков-партнеров SelV методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом.
Исследование специфичности белок- белковых взаимодействий SelV и его партнеров методами ко- иммунопреципитации и ко- локализации в клетках млекопитающих линии COS-7.
5. Выявление экспрессии мРНК SelV, полученной на различных стадиях
сперматогенеза и онтогенеза крысы (Rattus norvegicus), с помощью ПЦР.
Научная новизна работы
Впервые определена локализация SelV в клетках млекопитающих линии
COS-7, методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим
анализом идентифицированы возможные белки-партнеры SelV,
взаимодействующие с ним путем образования межмолекулярных селенид-сульфидных связей: О- связанная N-ацетилглюкозаминтрансфераза (OGT), а также Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов). Проверена специфичность данных белок- белковых взаимодействий методам ко- иммунопреципитации потенциальных партнеров на аффинном матриксе, а также путем определения паттерна их совместной локализации в клетках млекопитающих линии COS-7. Установлено наличие экспрессии мРНК SelV на ключевых стадиях онтогенеза и сперматогенеза крысы.
Апробация результатов работы
Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), на XII Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущине 2008), на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2009), на XV Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2011) и на научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва-Пущино, 2011).
Публикация научных исследований
По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы в реферируемых журналах.
Объем и структура диссертации
