Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Рекомбинантные белки как инструмент для изучения внутриклеточной сигнализации на примере белка RACK1 9
1.1. Введение. 9
1.2. Белок RACK1 - участник фосфоинозитидного пути передачи сигнала . 10
1.3. Экспрессия чужеродных белков ъЕ.соИ. 17
1.3.1. Генетические элементы экспрессирующего вектора. 17
1.3.2. Компартментализация продуцируемого белка. 35
1.3.3. Экспрессия правильно сворачивающихся белков в Е. coli. 37
1.3.4. Химерные белки. 44
1.4. Рандомизация и генетическая селекция как инструмент молекулярной биологии . 46
Глава II. Получение бактериального суперпродуцента- рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции.Резулътаты и обсуждение . 50
2.1. Принцип и дизайн системы генетической селекции. 50
2.2. Конструирование и клонирование синтетического фрагмента COTR в плазмидном векторе pGEM 53
2.3. Клонирование кодирующей части гена резистентности к тетрациклину Tetr в плазмиду PGEM-C2. 58
2.4. Схема введения рандомизованного фрагмента. 60
2.5. Проведение генетической селекции в одноцистроннои системе. 62
2.6. Клонирование кДНК RACK1 в плазмиду pGCT2 . 64
2.7. Тестирование полученного сайта инициации трансляции для одноцистроннои системы (RBS-Tet) в двуцистронной конструкции, содержащей rack\. 66
2.8. Контрольная конструкция для экспрессии RACK1 в двуцистронной системе. 69
2.9. Введение рандомизованного фрагмента в двуцистронную конструкцию pGCT-RACK1. 71
2.10. Искусственный отбор и анализ отдельных клонов. 73
2.11. Тестирование области инициации трансляции из клона-суперпродуцента в исходном векторе pGCT2. 76
Глава III. Материалы и методы. 78
3.1. Реактивы. 78
3.2. Ферменты. 78 3.3 Материалы. 79
3.4. Препараты. 79
3.5. Олигонуклеотиды, 79
3.6. Штаммы и векторы. 81
3.7, Лабораторное оборудование. 81
3.8, Буферы и растворы. 81
3.9, Методы. 83
Выводы. 97
Список литературы. 98
- Белок RACK1 - участник фосфоинозитидного пути передачи сигнала
- Рандомизация и генетическая селекция как инструмент молекулярной биологии
- Конструирование и клонирование синтетического фрагмента COTR в плазмидном векторе pGEM
- Клонирование кДНК RACK1 в плазмиду pGCT2
Введение к работе
Совершенствование методологии рекомбинантных ДНК поразительно расширило возможности направленного биосинтеза белка. Среди различных систем экспрессии генетических детерминант важное место занимают прокариотические системы. Бактериальные суперпродуценты позволяют получать значительные количества высокоочищенных рекомбинантных белков для использования в медико-биологических и сельскохозяйственных целях.
Для экспрессии в бактериальной системе безинронный ген (кДНК) клонируют в плазмидный вектор, содержащий структурные элементы, необходимые для его транскрипции и трансляции. Наиболее эффективная и широко используемая система транскрипции (система Студиера) включает промотор из фага Т7 в сочетании с бактериальными штаммами, несущими индуцибельный ген Т7-РНК-полимеразы в своем геноме (Studier & Moffat, 1986). Эта система обеспечивает массивную транскрипцию, эффективность которой практически не зависит от структуры целевого гена. Однако, выход белка в одной и той же системе экспрессии может сильно варьировать от гена к гену. Этот факт объясняется тем, что лимитирующей в этих условиях является следующая стадии биосинтеза белка - трансляция, в особенности ее инициация. Эта стадия является наименее предсказуемой, так как ее эффективность сильно зависит от структуры целевого гена, которая в большой степени определяет вторичную структуру участка связывания рибосом.
В идеале сайт связывания рибосом нужно было бы подбирать специально для каждого целевого гена, однако рациональной основы для такого подбора не существует, так что обычно это делается методом проб и ошибок. В нашей работе, вместо рутинного перебора вариантов различных последовательностей, мы разработали комбинаторный подход при котором нужные последовательности выбираются автоматически в результате генетической селекции в специальной системе.
Этот подход позволяет подобрать эффективный сайт инициации трансляции для любого чужеродного гена в одном эксперименте. Эта система была нами использована для создания суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С - RACK1.
Белок RACK1 - участник фосфоинозитидного пути передачи сигнала
Одним из основных путей передачи сигнала во всех клетках животных и растений фосфоинозитидный каскад. Информацию от первого звена этого каскада - рецептора -получают и передают через мембрану в цитоплазму так называемые G-белки, активирующиеся при связывнии лиганда с внеклеточной. частью рецептора. G-белки активируют белок-эффектор - фосфолипазу С (ФЛС) на внутренней стороне мембраны, которая в свою очередь расщепляет мембранный фосфолипид фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (РГРг) на два соединения, служащие внутриклеточными мессенджерами: водорастворимый инозитол-1,4,5-трифосфат (1Рз) и липидорастворимый диацилглицерин (DAG) (Berridge, 1993). Эти вторичные посредники вызывают изменение структуры клеточных белков, запуская разнообразные внутриклеточные сигнальные каскады. Гидрофильный 1Рз диффундирует в цитоплазму и вызывает освобождение кальция из внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум, митохондрии), тем самым повышая его цитоплазматическую концентрацию. Часто цитоплазматическая концентрация кальция также повышается за счет открывания Са2+ ионных каналов при действии того же лиганда на другие типы рецепторов. Такое сочетание появления в клетке DAG и повышенной концентрации Са2+ приводит к активации одного из центральных внутриклеточных регуляторов - протеинкиназы С (ПКС).
Для ее активации также требуется кислый фосфолипид фосфатидилсерин (ФС), который всегда присутствует в клеточных мембранах. Катализируя присоединение фосфата к остаткам серина или треонина к своим субстратным белкам, ПКС запускает каскад внутриклеточных реакций, формируя ответ клетки на внешнее воздействие (Berrige, 1984, 1987, 1993, Nishizuka, 1984, 1988, 1995, Крутецкая, Лебедев, 1992а) (рис. 1.1). идентифицировано 11 изоформ ПКСТ которые подразделяют на три группы: классические, новые и атипичные. Классические ПКС включают а, (ЗІ, pil, и у изоформы. В макрофагах крысы идентифицированы Р и 5 изоформы ПКС, относящиеся к классическим и новым ПКС, соответственно (Dieter & Fitzke, 1993). ПКС представляет собой полипептидную цепь (670-690 а.о., мол. масса 77 кДа), состоящую из двух функционально различных доменов - регуляторного и каталитического. Регуляторный домен в отсутствии активаторов ингибирует каталитическую активность фермента, блокируя каталитический центр своим фрагментом, называемым псевдосубстратом. Протеолитическое расщепление ПКС ш vitro кальпаином приводит к конститутивной активности каталитического домена. Каталитический домен ПКС высокогомологичен соответствующим доменам других серин-треониновых протеинкиназ. Регуляторные домены классичкских изоформ (ПКС a, pi, рН, ну) содержат общие структурные мотивы С1 и С2 (Ohno & Nishizuka, 2002). Домены СІ содержат по две цинк-связывающие последовательности, обогащенные цистеинами, которые образуют сайт связывания DAG и форболового эфира.
Домены С2 обеснечивают кальций-зависимое связывание ФС (Johnson et al., 2000). Новые изоформы ПКС (5, , л, и 6) также содержат С1 и С2 домены, однако С2 домен имеет несколько иную структуру, чем в классических изоформах, и активация новых изоформ не зависит от Са +. Атипические изоформы ПКС ({, и у/і) содержат видоизмененный С1 домен и воообще не содержит С2 мотива, в результате чего эти изоформы не связывают ни DAG, ни ФС, ни Са2+. В нормальных условиях ПКС находится в основном в цитозоле в неактивной форме. При стимуляции происходит транслокация фермента на мембрану, где образуется комплекс ПКС-DAG-Ca -ФС. ПКС может транслоцироваться как на плазматическую мембрану, так и на внутриклеточные - ядерную или митохондриальную, а так же на цитоскелет. При том что различные изоформы ПКС связываются с одними и теми же липидными компонентами, существует определенная специфичность в транслокации различных изоформ. То же самое касается субстратной специфичности различных изоформ - in vitro различные изоформы фосфорилируют одни и те же субстраты практически с одинаковой эффективностью, в то время, как в клетке есть вараженная специфичность изоформ к индивидуальным субстратам. В основе субстратной специфичности, по-видимому, лежит колокализация изоформ со своими белками-субстратами при транслокации, а она в свою очередь обеспечивается специальными белками, переносчиками активированной ПКС - так называемыми рецепторами активированной С-киназы (RACK; Schechtman & Mochly-Rosen, 2001; Mochly-Rosen et al., 1991; Mochly-Rosen, 1995; см рис. 1.2). Как видно из названия, эти белки связываются лишь с активной конформацией ПКС. Важно отметить, что белки RACK не являются мембранными белками и осуществляют свою локализующую функцию за счет белок-белковых взаимодействий с другими белками.
Рандомизация и генетическая селекция как инструмент молекулярной биологии
В настоящее время все большее распространение в молекулярной биологии получает комбинаторный подход к оптимизации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Этот подход, включающий в себя рандомизацию фрагмента последовательности с последующим поэтапным отбором оптимального варианта, является прогрессивной формой метода проб и ошибок, так как обладает гораздо большей; пропускной способностью и требует для своего осуществления даже меньше исходной информации, чем каноническая стратегия.
В наиболее ранних комбинаторных методах - фаговом дисплее (Georgiou et al., 1997) и SELEXe (Joyce, 1996) - сам процесс отбора осуществлялся in vitro. В основе этих методов лежит связывание фаговых частиц или молекул ДНК/РНК с антигеном, иммобилизованном на носителе, и их отделение от молекул, не имеющих сродства кантигену. Процесс отбора осуществлялся в- несколько стадий, с. промежуточной амплификацией отобранных молекул, причем каждая последующая стадия проводится в более жестких условиях, чем предыдущая., обеспечивая обогащение популяции: молекулами с высокой аффинностью. Были описаны и более сложные системы отбора, где от искомой молекулы требуется не только связывание с субстратом, но и выполнение: каталитичекой функции (Joyce, 1996).
В то же время, число работ, в которых отбор нужных молекул происходит in vivo, весьма ограничено. Одной из излюбленных моделей для молекулярной эволюции являются РНК-фаги, благодаря высокой частоте и умеренной точности их репликации. В считанные минуты они могут изменять свой геном, повышая устойчивость к таким внешним факторам, как присутствие в среде бромистого этидия или РНКазыШ (Klovins et al., 1997а). Были даже разработаны специальные аппараты, называемые эволюционными машинами, которые позволяют строго контролировать условия и следить за процессом эволюции (Husimi, 1989). Описан также ряд работ по молекулярной эволюции фагов, где ставилась обратная задача: в фаговый геном вводились направленные мутации, а затем наблюдались компенсаторные перестройки в геноме при пролиферации фага в нормальных условиях. Эти эксперименты позволили выявить важные функциональные элементы вторичной и высших структур фаговой РНК (Olsthoom et al., 1994, Arora et al., 1996). Такого рода работы на фаге MS2 были посвящены и изучению области инициации трансляции (Olsthoom et al, 1995, Klovins et al., 19976, Olsthoorn & van Duin, 1996). Однако, результаты этих экспериментов трудно обобщать, так как жизнеспособность фага обусловлена далеко не только инициацией трансляции данного гена, но и другими процессами.— репликацией, обратной транскрипцией, упаковкой и т.д., которые могут быть затронуты внесенными изменениями. К тому же эта система стремится не к максимальной экспрессии данного гена, а лишь к компенсации внесенных мутаций.
Структурно-функциональное- изучение. нуклеотидной- или. белковой последовательности методом направленной эволюции in vivo осложняется тем, что эта последовательность должна обеспечивать жизненно важную, или по крайней мере фенотипичекую функцию в микроорганизме, в которм ведется отбор, или же ее функция должна быть трансформирована в жизненно важную или фенотипическую. Это далеко не всегда возможно, поэтому подавляющее большинство комбинаторных работ на бактериях:. включает в себя частичную или полную рандомизацию гена или его фрагмента и анализ всех полученных клонов на активность кодируемого белка.
Все-таки, несколько систем, делающих возможным проведение направленной эволюции, были описаны. Одна из них, предназначенная для изучения димеризующих мотивов мембранных белков, основана на активации транскрипции репортерного гена в результате димеризации химерного белка, содержащего изучаемую димеризующую последовательность (Russ & Engelman, 1999). Правда, в этой работе проводили лишь один раунд селекции, но в принципе система пригодна для проведения искусственной эволюции. Описано также изучение аминоацилирования тРНК. На основе tRNAA2GIn была сконструирована супрессорная тРНК, которая не аминоацилировалась ни одной из нативных аминоацил-тРНК-синтетаз, но при этом была совместима с трансляционным аппаратом клеки. Соответствующая аминоацил-тРНК-синтетаза (GlnRS) была проведена, через несколько раундов перетасовки ДНК, и путем генетичекой селекции были получены ферменты, аминоацилирующие данную тРНК (Liu et al.,1997). Принцип отбора в этой системе основан на супрессорных свойствах изучаемой тРНК, восстанавливающих (при успешном аминоацилировании) синтез селективного маркера. Полученная комбинация тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз может быть использована для введения в белковую последовательность неприродных аминокислот.
Еще одна из немногих работ, описывающих напрвленный эволюционный процесс в бактериях, касается FLP-рекомбиназы. Ген рекомбиназы был рандомизирован иклонирован в E.coIi; селективным признаком при этом служила рекомбинация гена IacZ,„ приводящая к появлению голубых колоний. Несколько раундов селекции во все более жестких условиях позволили идентифицировать мутантные белки с повышенной каталитической активностью (Kumamaru et al., 1998), С помощью рандомизации и генетической селекции были также выявлены структурные элементы, обеспечивающие кодоновую специфичность прокариотических факторов терминации трансляции RF1 и RF2 (Ito et al., 2000) и была оптимизирована для биотехнологических потребностей структура саморасщепляющихся интеинов (Wood et al., 1999). Была также предпринята попытка изучения роли петлевых последовательностей в формировании четвертичной структуры белков. Путем вставки рандомизованных петель от 4 до 7 н.о. в дим ер мутазы с последующим отбором функциональных вариантов при помощи генетической комплементации, авторы получили два варианта белка -мономерный и гексамерный, сохраняющие достаточно высокую каталитическую активность (MacBeath et al., 1998). Другая группа ученых применила метод рандомизации при изучении роли а-спиральных белковых структур в формировании активных ферментов на примере хоризматмутазы (MjCM ) из класса AroQ (MjCM катализируют Claisen перестройку хоризмата на префенат). Они создали комбинаторные библиотеки, которые содержали белковый пул, в котором все вторичные последовательности, не являющиеся консервативными АК и петлевые структуры, были замещены случайными последовательностями. Селекция активных энзимов проводилась in vivo, так как хоризматмутаза играет жизненно важную роль в метаболизме E.coll
Заключение, В тех случаях, когда нет рациональной основы для улучшения свойств молекулярно-биологического объекта, и его оптимизация отдана на откуп метода проб и ошибок, на помощь может прийти генетическая селекция — высокопропускная версия вышеупомянутого метода. Проблема лишь в том, чтобы создать соответствующую генетическую систему, в которой нужный признак будет условием выживания.
Конструирование и клонирование синтетического фрагмента COTR в плазмидном векторе pGEM
Наша система искусственного отбора эффективных сайтов инициации трансляции разработана на основе плазмидного вектора экспрессии pGEMl [Promega], имеющего в своем составе Т7 промотор и ген устойчивости к ампициллину, который будет служить независимым селективным маркером. Для того чтобы сконструировать вектор для клонирования целевого гена и проведения селекции, мы клонировали в плазмиду pGEMl синтетический линкер, содержащий структурные предпосылки для сборки всей системы. Этот линкер включает сайт сопряжения трансляции целевого чужеродного гена с геном устойчивости к тетрациклину (между сайтами Kpnl - Mfel), позаимствованный из системы регуляции экспрессии белков оболочки и лизиса бактериофага MS2, а также сайты рестрикции для клонирования целевого гена, гена устойчивости к тетрациклину и введения рандомизированного фрагмента в область инициации трансляции целевого гена. Мы также ввели в состав линкера энхансер трансляции (Lehmeier & Amann, 1992; O Connor & Dahlberg, 2001) (рис. 2.2).дуплекса COTR использовали комбинацию достроек фрагментом Кленова и ПЦР (рис.2.4). Сначала отожгли олигонуклеотиды COTR1 с COTR2, a COTR3 с COTR4 и достроили полимеразой Кленова с получением фрагментов COTR 1-2 и COTR3-4. Затем провели амплификацию полученных фрагментов с избытком олигонуклеотида COTR1 и с избытком олигонуклеотида COTR4, соответственно. Таким образом были наработаны одноцепочечные фрагменты COTR1-2 и COTR3-4. После этого реакционные смеси COTR1-2 и COTR3-4 объединили, провели достройку фрагментом Кленова с получением полноразмерного сегмента COTR и провели амплификацию с праймерами COTR1 (фосфорилированным) и COTR4, концы подравняли фрагментом Кленова. Полученный сегмент после обработки рестриктазой Pstl встроили в pGEMl по сайтам Smal и Pstl (рис. Далее бьи проведен рестриктный анализ ДНК клонов при помощи эндонуклеазы рестрикции Ndel, сайт узнавания которой присутствовал в клонированной последовательности (рис. 2.6). Первичную последовательность вставки клона, отобранного по результатам рестрикционного анализа, подтвердили секвенированием на автоматическом секвенаторе (рис. 2.7). Таким образом была получена плазмида pGEM-C2.
В полученный таким образом вектор pGEM-C2 клонировали кодирующую часть гена Tet1 по сайтам Mfel - Pstl (рис. 2.8). Кодирующая часть гена Тег бьша получена с помощью ПЦР с праймерами TetUS и TetDS, имеющими в своем составе сайты узнавания рестриктазами, соответственно, Mfel и Pstl, и плазмидой pBR322 в качестве матрицы. Рестриктный анализ ДНК клонов проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции Pstl и Mfel, которые в рекомбинантных клонах выщепляли вставку размером около 1,2 тыс.п.о. Нуклеотидную последовательность вставки в отобранном клоне подтвердили сиквенированием на автоматическом сиквенаторе (рис. 2.9). Полученной плазмиде было присвоено название pGCT2.
Как мы и предполагали, эта плазмида не обладала устойчивостью к тетрациклину, так как слабый сайт связывания рибосом в составе сайта сопряжения трансляции не способен к независимой инициации трансляции гена устойчивости к тетрациклину. Таким образом, мы получили базовую конструкцию (pGCT2), содержащую все необходимые элементы для проведения клонирования целевого гена и селекции его клона-суперпродуцента.
Для введения рандомизованного фрагмента в область инициации трансляции мы разработали методику схематично изображенную на рис. 2.11. Для этого был химически синтезирован олигонуклеотид "N20", содержащий 20-звенный рандомизованный участок (при синтезе каждого звена которого в реакцию вводились все 4 предшественника), а также фрагменты сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции BstXl и Ndel во фланкирующих областях. Кроме того в 5 -фланкирующую область была введена последовательность ТТА, комплеменарная терминирующему кодону, чтобы закрыть рамку считывания, совпадающую с рамкой целевого гена, которая может быть открыта в результате рандомизации (рис. 2.10). Иначе, появление дополнительного инициирующего кодона могло бы привести к удлинению целевого полипептида с N-конца. В то же время, открывание двух других рамок считывания не представляет опасности, так как они неизбежно будут закрыты в кодирующей части гена и не приведут к сопряженной трансляции. Так что эти клоны будут нежизнеспособны.
Таким образом, был получен рандомизованный олигонуклеотид - большой набор олигонуклеотидов с произвольными последовательностями.Для встраивания этого олигонуклеотида в плазмидный вектор использовали сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BstX I в составе дуплекса COTR. Расщепление по этому сайту дает непалиндромные 3 -выступающие концы, которые не могут отжигалься сами на себя. Один из этих концов комплементарен концевому фрагменту олигонуклеотида N20 и может служить матрицей для его отжига и лигирования к вектору, а также праймером для достройки второй цепи рандомизованного фрагмента с последующим внутримолекулярным лигированием по «тупым концам» (рис. 2.11).
Клонирование кДНК RACK1 в плазмиду pGCT2
Целевым белком в нашем проекте является Рецептор Активированной Протеинкиназы С - RACK1 (рис. 2.14). Комплементарная ДНК гена RACK1 была получена с помощью ПЦР с праймерами RACK-USnde и RACK-DSkpn, имеющими в своем составе сайты узнавания рестриктазами Ndel и Kpnl, соответственно (рис. 2.15). В качестве матрицы использовали библиотеку к ДНК из мозга эмбриона человека [Clontech].Далее проводили рестриктный анализ ДНК клонов при помощи рестриктаз Ndel и Kpnl (рис. 2.17). Нуклеотидную последовательность вставки подтвердили также сиквенированием на автоматическом сиквенаторе (рис. 2.18). Полученной плазмиде было присвоено название pGCT-RACKl.
Для проверки эффективности отобранного сайта нужно было бы клонировать в полученную конструкцию целевой ген. Однако, в процессе генетической селекции в одноцистронной конструкции рестрикционный сайт Ndel был утрачен в результате делеции так, что клонирование целевго гена в полученную плазмиду стало невозможным. Поэтому мы решили синтезировать отобранную последовательность химически в виде дуплекса с выступающими «липкими» концами, содержащими сайты узнавания рестриктазами BstX I и Ndel, чтобы в дальнейшем клонировать ее в двуцистронную конструкцию с целевым геном (рис. 2.19).
Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli XL 1-blue. Нуклеотидную последовательность вставки в отобранном клоне анализировали с помощью рестриктного анализа. Плазмидную ДНК pGCT-RACKl -RBSet обрабатывали рестриктазами Xhol и BstXl, давших два ожидаемых двуцепочечных фрагмента длиной 110 п.о. и 4943 п.о.Затем вновь полученной, суперскрученной, ДНК трансформировали клетки BL21(DE3). Индукцию проводили при небольших концентрациях IPTG (0,05 мМ). После индукции клетки растили в среде LB при разных концентрациях тетрациклина: 1 мкг/мл, 3 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл. Клетки, содержащие контрольную конструкцию pGCT-RACK1 (без вставки) не росли на среде LB, содержащей тетрациклин, также как и клетки, содержащие фрагмент "RBSet" - pGCT- RACK 1-RBSet. Лизаты клеток анализировали при помощи денатурирующего ПААГ-SDS (рис. 2.21).
Белковый электрофорез лизатов клеток не выявил появления мажорной полосы в области 30 кДа, соответствующей электрофоретической подвижности белка RACK1. Все это указывает на то, что вставка "RBSet" не обеспечивает экспрессию гена RACK1, в то время как для гена Tetr она дает возможность роста клеток на среде с тетрациклином. Это еще раз продемонстрировало, что не любой стандартный сайт связывания рибосомой подходит к данному гену.Итак, наша попыка создать промежуточный пул экспрессирующих векторов до конирования целевого гена не увенчалась успехом. Пул быстро сошелся к единственнойпоследовательности. К тому же эта последовательность, будучи помещенной в другой контекст, оказалась неэффективной. Поэтому мы приступили к осуществлению второй стратегии отбора - рандомизации непосредственно перед целевым геном.
Перед встраиванием SD-дуплекса в плазмиду pGCT-RACKl по сайтам BstXl -Ndel, провели фосфорилирование олигонуклеотидов по отдельности, так как в дуплексе один из 5 -концов не является выступающим, что препятствует действию полинуклеотидкиназы фага Т4. Для проверки встраивания дуплекса "SD" проводили рестрикционный анализ ДНК клонов при помощи рестриктазы ВатШ, сайт узнавания которой присутствует в дуплексе. При гидролизе плазмиды со вставкой образовывались три ожидаемых фрагмента размером 627 п.о., 659 п.о. и 3769 п.о. Также подтверждали нуклеотидную последовательность вставки сиквенированием на автоматическом сиквенаторе (рис. 2.24).
Полученная плазмида pGCT-RACKl-SD была протестирована на экспрессию белка RACK1 в соответствующем бактериальном штамме. Эта конструкция делала клетки устойчивыми к тетрациклину в концентрации 1 мкг/мл, но не 5 мкг/мл и давала умеренную экспрессию белка RACK1 (рис. 2.25), подтверждая потенциальную возможность использования нашей системы.
