Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1. Иммобилизация и транспорт компонентов
аппарата трансляции в цитоплазме 7
Иммобилизация компонентов аппарата трансляции в цитоплазме 7
Специфическая локализация мРНК в специализированных клетках 9
Специфическая локализация мРНК в неспециализированных
клетках 10
Активный транспорт белковых компонентов аппарата трансляции 11
Стрессовые гранулы 11
Инициация трансляции 15
Кэп-независимая инициация трансляции 21
Регуляция инициации трансляции 21
4. Фактор инициации трансляции 3 (eIF3) 23
Мотивы, содержащиеся в субъединицах eIF3 25
Фактор инициации eIF3 почкующихся дрожжей S. cerevisia 26
Фактор инициации eIF3 делящихся дрожжей S. ротЬе 31
Фактор инициации eIF3 человека 33
5. Большая субъединица фактора инициации 3 eIF3a 38
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
1. Работа с ДНК 42
Бактериальные штаммы и среды 42
Полимеразная цепная реакция 42
Рестрикция и лигирование 42
Приготовление компетентных клеток и трансформация клеток
Е. coli плазмидной ДНК 43
Выделение плазмидной ДНК 43
Электрофорез ДНК и элюция из геля 44
2. Работа с белками 44
Синтез белков в Е. coli 44
Очистка рекомбинантных белков, трансляционно слитых с
глютатион-Б-трансферазой (GST) 44
Очистка рекомбинантных белков, трансляционно слитых с 6 His 45
Получение поликлональных антител 46
Очистка поликлональных антител 47
Другие использованные в работе антитела 48
Электрофорез белков и иммуноблотинг 48
Выделение тубулина из мозга крупного рогатого скота 49
Получение МТ из раствора тубулина 50
3. Работа с культивируемыми клетками млекопитающих 51
Клеточные культуры 51
Трансфекция культивируемых клеток 52
Фиксация культивируемых клеток 52
Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 53
Прямое флуоресцентное окрашивание культивируемых клеток 53
Количественные наблюдения клеток с стрессовыми гранулами и
статистическая обработка результатов 53
Преципитация белков из лизата клеток рекомбинантными
фрагментами р170, иммобилизованными на GST-агарозе 54
4. Буферные растворы 54
РЕЗУЛЬТАТЫ 57
1. Изучение формирования стрессовых гранул 57
Качественные исследования стрессовых гранул 57
Выявление стрессовых гранул с использованием антител к р170 и
РАВР 57
Выявление РНК-связывающего белка р50 в составе стресс-гранул 60
Изучение солокализации стрессовых гранул с актиновыми
филаментами и микротрубочками 60
Подавление образования стрессовых гранул в клетках
с разрушенными микротрубочками 63
Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток с подавленным
образованием стрессовых гранул на РАВР 66
Разрушение микротрубочек не влияет на фосфорилирование
eIF2a при последующей индукции стрессовых гранул 67
Образование стрессовых гранул при восстановлении
Микротрубочек в присутствии арсената натрия 67
Предобработка клеток винбластином 69
Предобработка клеток таксолом 70
Предобработка клеток латранкулином В 70
Количественные исследования стрессовых гранул 72
30 минут инкубации с арсенатом 72
Сравнение доли клеток со стрессовыми гранулами при различных условиях предобработки клеток
(30 мин. инкубации с арсенатом) 73
Сравнение количества стресс-гранул в клетках при различных условиях предобработки клеток
(30 мин. инкубации с арсенатом) 75
Сравнение относительного количества мелких стресс-гранул при различных условиях предобработки клеток (30 мин. инкубации
с арсенатом) 76
Сравнение количества крупных стресс-гранул при различных
условиях предобработки клеток (30 мин. инкубации с арсенатом) 76
120-минутная инкубация с арсенатом 77
Сравнение доли клеток с стресс-гранулами при различных
условиях предобработки (120 мин. инкубации с арсенатом) 77
Сравнение относительного количества стресс-гранул в клетках при различных условиях предобработки (120 минут инкубации
с арсенатом) 78
Сравнение относительного количества мелких стресс-гранул при различных условиях предобработки клеток (120 мин. инкубации
с арсенатом) 79
Сравнение количества крупных стресс-гранул при различных
условиях предобработки клеток (120 мин. инкубации с арсенатом) 80
2. Изучение взаимодействия большой субъединицы eIF3 р170
с микротрубочками 82
Анализ первичной и предсказанной вторичной структуры белка pi 70....82 Клонирование полноразмерного р167 и его отдельных фрагментов
(N-концевого, центрального, С-концевого и короткого С-концевого
без аминокислотных повторов) 84
Характеристика антител к фрагменту pi70Сс 86
Установление идентичности белка, выявляемого антителами А170-Сс,
и большой субъединицы фактора eIF3 р170 87
Выявление р170 в препарате микротрубочек на различных
стадиях очистки микротрубочек 88
Иммунофлуоресцентное выявлние локализации белка р170
в клетках CV-1 89
Экспрессия в клетках полноразмерного р170 и его фрагментов,
трансляционно слитых с GFP 92
Экспрессия полноразмерного р170 93
Экспрессия N-концевого фрагмента pl70N 93
Экспрессия центрального фрагмента р170М 95
Экспрессия С-концевого с повторами фрагмента р 170С 95
Экспрессия С-концевого без повторов фрагмента р170Сс 96
Соосаждение тубулина с N-концевой областью р170,
экспрессированной в E.coli, из лизата клеток Cos-1 97
Соосаждение тубулина с N-концевой областью р170,
экспрессированной в E.coli, из раствора тубулина 98
ОБСУЖДЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ ПО
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
Введение к работе
Процесс трансляции является наиболее сложным и наименее изученным из всех процессов реализации генетической информации в клетке. Его расшифровка - одна из ключевых задач современной молекулярной и клеточной биологии. До последнего времени изучение процесса трансляции в основном проводилось на бесклеточных системах. Однако эти системы отличаются по своим свойствам от живых клеток. В частности, скорость общего синтеза белка в интактной клетке обычно в несколько раз выше, чем в бесклеточной системе. Данный феномен, скорее всего, связан с определенной пространственной организацией компонентов аппарата трансляции в цитоплазме, которая пока не была смоделирована в бесклеточной системе.
Очевидно, что пространственная организация аппарата трансляции возможна в случае иммобилизации компонентов аппарата трансляции в цитоплазме. Иммобилизация в цитоплазме может осуществляться за счет взаимодействия с какими-либо мембранными структурами (в частности, с эндоплазматическим ретикулумом) или за счет связывания с цитоскелетными элементами. Взаимодействие с эндоплазматическим ретикулумом транслирующих рибосом хорошо изучено. Существенно менее исследованным остается вопрос об иммобилизации аппарата трансляции за счет взаимодействия с цитоскелетом. Такое взаимодействие существует, поскольку при обработке клетки детергентами не происходит существенных потерь компонентов аппарата трансляции. Конкретные взаимодействия белковых или нуклеиновых компонентов аппарата трансляции с конкретными цитоскелетными структурами исследованы крайне слабо.
Цитоскелетные элементы, расположенные в цитоплазме, относятся к трем типам: это промежуточные филаменты, выполняющие структурную функцию, микрофиламенты, необходимые для движения и микротрубочки, функцией которых является чаще всего внутриклеточный транспорт. Для актиновых филаментов были показаны статические взаимодействия с факторами
элонгации, связь с микротрубочками наблюдалась в случае активного транспорта по клеткам ряда мРНК.
Мы предположили, что перемещение по цитоплазме массивных компонентов аппарата трансляции возможно при активном транспорте по микротрубочкам или микрофиламентам. В качестве модели для изучения взаимодействия компонентов аппарата трансляции с цитоскелетом, нами было выбрано образование стрессовых гранул. При стрессорных воздействиях на клетку происходит резкое уменьшение общего белкового синтеза. На визуальном уровне, этот процесс сопровождается быстрым накоплением компонентов 48S инициаторного комплекса в нескольких десятках локусов в цитоплазме, называемых стрессовыми гранулами (Stress-granule). Предполагается, что в цитоплазме клетки конститутивно существуют определенные области, где происходит переход мРНК от стадии инициации трансляции к элонгации. При стрессорных воздействиях на клетку происходит ингибирование этого процесса, что приводит к накоплению в этих зонах компонентов 48S инициаторного комплекса (мРНК, малая рибосомальная субъединица, факторы инициации трансляции elFl, eIF4F и eIF3) и, соответственно, визуализации этих областей как стрессовых гранул (Kedersha and Anderson, 2001). Достаточно высокая скорость накопления компонентов 48S инициаторных комплексов в стрессовых гранулах позволяет предположить, что этот процесс может быть связан с цитоскелетными структурами. В частности, за счет активного транспорта могут перемещаться компоненты стрессовых гранул.
Изучению взаимосвязи между образованием стрессовых гранул и цитоскелетом посвящена первая часть нашей работы.
Вторым направлением нашей работы было исследование взаимодействия одного из компонентов стрессовых гранул - фактора eIF3 - с микротрубочками в норме. Первоначально в нашей лаборатории были получены данные, что большая субъединица этого фактора - белок р170 - находится в препарате микротрубочек, выделенных из мозгового слоя надпочечников крупного рогатого скота (Severin et al, 1999). Поэтому мы решили изучить, существует ли специфическое взаимодействие с микротрубочками этого белка и, если существует, чем оно может быть опосредовано.
