Введение к работе
Актуальность работы
Ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (С17АСА-ацилазы, ЕС 3.5.1.93) - промышленные ферменты, наряду с пенициллин ацнлазами, способные превращать цефалоспорины в ценные промежуточные соединения, используемые для производства новых антибиотиков. вПАСА-ацилаза катализирует ферментативное превращение глутарил-7-АСА (G17ACA) в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АСА), при котором происходит расщепление амидной связи с образованием глутарата и 7-АСА.
Активные ферменты являются гетеротетрамерами, состоящими из 2х и- и 2х р-субъедишщ, которые формируются из одноцепочечиого полипептидного предшественника в результате специфического процессинга белка-предшественника и характеризуются высокой активностью по отношению к G17ACA, при низкой активности по отношению к цефалоспорину С (Ishii et al., 1994).
Высокое биотехнологическое значение G17ACA-amwa3 определяет интерес к разработке эффективных и экономичных систем продукции этого фермента.
В тоже время, существующие методы получения рекомбинантных G17ACA-amuia3 нельзя признать достаточно эффективными, что связано со сложной структурой предшественника и недостаточной изученностью закономерности процессинга и сборки функционально-активного тетрамера фермента (Li et al., 1998; Lee et al., 2004). Необходимость освобождения иммобилизованных препаратов G17ACA-amuia3 от примесей неспецифических бета-лактамаз и эстераз, относительно невысокая каталитическая активность фермента, нестабильность тетрамера белка под действием мягких денатурирующих агентов, при умеренных температурах, частичная инактивация фермента под действием «сшивающих» агентов, осложняют получение эффективных иммобилизованных препаратов С17АСА-ацилаз (Friehs et al., 1993; Vetlvanayagam et al., 2005).
В этой связи весьма актуальным является проведение исследований, посвященных созданию новых штаммов-продуцентов и усовершенствованию известных методов получения препаратов С17АСА-ацнлазы, а также исследований, направленных на углубленный структурно-функциональный анализ этого фермента и создание новых аналогов С17АСА-ацилазы с улучшенными физико-химическими и ферментативными свойствами с использованием методов бионнформатикн и белковой инженерии.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлось создание систем экспрессии аналогов GI7ACA-ацилазы, обеспечивающих эффективный синтез данных ферментов в клетках E.coli и упрощающих процедуры их очистки и иммобилизации, а также разработка подходов для получения более стабильных аналогов фермента, изучение особенностей процессов формирования четвертичной структуры С17АСА-ацилазы. Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Клонирование гена 017АСА-ацилазы бактерии Brevitndimonas diminuta (BrdGIA),
конструирование вариантов гена BrdGIA, модифицированных присоединением
аффинных остатков к различным участкам кодирующей последовательности
фермента.
2. Оптимизация процессов биосинтеза созданных вариантов BrdGIA в штаммах E.coli-
продуцектах, отработка условий получения и очистки рекомбинантных аналогов
BrdGIA и изолированных субъединиц фермента.
3. Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога BrdGIA с
присоединенным N-концевым хитин-связывающим доменом на хитиновых сорбентах,
определение кинетических и физико-химических параметров очищенного фермента.
Исследование закономерностей реконструкции и сборки функционально-активной BrdGIA in vitro с использованием изолированных рекомбинантных а- и (5-субъединиц.
Изучение области контакта между субъединицами 017АСА-ацилазы, определение относительного вклада гидрофобных и электростатических взаимодействий в поддержание четвертичной структуры тетрамера 017АСА-ацилазы.
Научная новизна и практическая значимость
В настоящей работе впервые создана высокоэффективная система экспрессии гибридного белка 017АСА-ацилазы слитой с хитин-связывающим доменом (BrdGIA/ChBD), позволяющая проводить одностадийную аффинную очистку рекомбинантного функционально-активного фермента.
Показано, что полученный гибридный белок обладает улучшенными физико-химическими и энзиматическими свойствами по сравнению с другими известными аналогами рекомбинантной GnACA-ацилазы - более высокой специфической активностью,
улучшенной афинностью по отношению к субстрату, повышенной термостабильностью.
Впервые методам» биоинформатпкп выявлены значимые аминокислотные остатки, формирующие область взаимодействия между субъединицами С17АСА-ацнлазы. Показано, что в предсказанной области контакта димера а- и р-субъеднниц, доминируют взаимодействия гидрофобного типа.
В результате экспериментов по совместной и раздельной ренатурации препаратов изолированных а- и Р-субъединиц 017АСА-ацшшы показано, что формирование нативпой пространственной конформации фермента происходит, скорее всего, в процессе его синтеза, проиессинга и взаимодействия вновь синтезируемых субъединиц.
Созданные в ходе работы штаммы-продуценты, разработанные методы получения и иммобилизации гибридных аналогов 017АСА-ацилазы открывают новые возможности для углубленного структурно-функционального изучения этого важного фермента, создания экономичных и эффективных технологий получения иммобилизованных препаратов G17ACA-amwa3 для непосредственного использования в технологических процессах получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на 10-ой школе-конференции молодых ученых, «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006 г.), 9-ой международной конференции «Системная биология и биоинжерения» (Москва, 2005 г.), международной конференции «Protein folding and Drug design», (Варенна, 2006 г.), международной конференции «Workshop on Biocalorimetry and Biological Thermodynamics», (Рио де Жанейро, 2006 г.), 4-ом международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития, (Москва, 2007 г.), международной конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009 г.). По материалам диссертации было опубликовано 2 статьи в российском и зарубежном журнале, получено 2 патента РФ и одно положительное решение о выдаче патента РФ.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 7 таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 149 источников.
![6,7-дихлор-1,4-диоксаспиро[4,4]нон-6-ен-8-он в синтезе аналогов хлорвулонов](/i/i/4274/444267.png "6,7-дихлор-1,4-диоксаспиро[4,4]нон-6-ен-8-он в синтезе аналогов хлорвулонов Байбулатова Гюзель Минияровна")