Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации. 12
1.1.1. Общая характеристика аденовирусов человека. 13
1.1.2. Векторы на основе аденовирусов человека. 15
1.1.3. Особенности структурно-функциональной организации аденовируса птиц CELO. 20
1.1.4. Векторы на основе аденовируса птиц CELO. 25
1.2. Факторы роста кровеносных сосудов. 29
1.2.1. Ангиогенин. 3 0
1.2.1.1. История открытия и свойства белка ангиогенина. 30
1.2.1.2. Роль ангиогенина в неоваскуляризации. 33
1.2.1.3. Внутриклеточные функции ангиогенина 36
1.2.1.4. Другие функции белка. 38
1.2.2. VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). 40
1.2.2.1. Свойства и функции белка. 40
1.2.2.2. VEGF А. 43
1.2.2.3. Другие члены семейства VEGF. 45
1.2.2.4. Исследование способности VEGF индуцировать ангиогенез в организме животных и человека. 47
1.2.3. Другие факторы роста кровеносных сосудов. 50
2. Материалы и методы 54
2.1. Материалы. 54
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы. 54
2.1.2. Клеточные линии. 54
2.1.3. Плазмидные векторы. 54
2.1.4. Ферменты и другие реактивы. 55
2.1.5. Животные. 55
2.2. Методы . 55
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК. 55
2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК. 56
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами. 57
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле. 57
2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля. 57
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК. 58
2.2.7. Трансформация клеток E.coli. 58
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. 58
2.2.9. Полимеразная цепная реакция. 59
2.2.10. Синтез дезоксиолигонуклеотидов. 60
2.2.11. Трансфекция клеток линии 293 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов. 60
2.2.12. Накопление вирусов. 61
2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов. 61
2.2.14. Титрование вирусов. 62
2.2.15. Выделение вирионной ДНК. 62
2.2.16. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом. 63
2.2.17. Трансфекция хорио-аллантоисной мембраны. 64
2.2.18. Определение активности секретируемой щелочной фосфатазы. 64
2.2.19. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS). 65
2.2.20. Иммуноблоттинг (Western blot immunoassay). 65
2.2.21. Хирургические манипуляции с лабораторными животными. 66
2.2.22. Введение рекомбинантных вирусов в мышечные клетки. 66
2.2.23. Гистологический анализ. 67
2.2.24. Определение логфазы для микроорганизмов. 68
2.2.25. Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов. 68
3. Результаты исследований 70
3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса птиц CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа. 70
3.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих гены ANG и VEGF. 70
3.1.2. Анализ экспрессии генов ANG и VEGF, содержащихся в плазмидных векторах. 71
3.1.3. Получение аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток. 76
3.1.4. Детекция экспрессии генов ANG и VEGF в культуре клеток, зараженных рекомбинантными аденовирусами CELO-ANG и CELO- VEGF. 84
3.2. Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. 86
3.2.1. Введение репортерных генов GFP и SEAP в клетки мышцы крысы при помощи рекомбинантных аденовирусов. 86
3.2.2. Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов 88
3.3. Исследование антимикробной активности ангиогенина. 93
Выводы 114
- Факторы роста кровеносных сосудов.
- Методы
- Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов.
- Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время для доставки различных терапевтических генов в органы и ткани млекопитающих широко применяются векторы на основе вирусов человека и животных. Вирусные векторные системы являются перспективными, поскольку вирус эффективно проникает в клетки и не требует использования дополнительных средств улучшения эффективности трансфекции. Широко используемым инструментом для доставки генов в клетки млекопитающих являются векторы на основе аденовирусов.
Наше исследование направлено на создание генно-инженерных конструкций, индуцирующих рост кровеносных сосудов в конечностях млекопитающих в результате доставки в ткани конечностей аденовирусных векторов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. В качестве средства доставки данных генов в мышцы лабораторных животных нами были использованы вирусные векторы на основе аденовируса человека типа 5 (Ad5) и аденовируса птиц CELO. Аденовирусные векторы широко применяются для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro. Исследуется применение векторов на основе аденовирусов человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии.
В качестве целевых генов для доставки в мышцы лабораторных животных мы использовали гены факторов роста кровеносных сосудов, поскольку возможность регуляции роста кровеносных сосудов это одна из задач, стоящих перед медицинской наукой и практикой. Атеросклероз с постепенным сужением полости артерий и последующем уменьшением кровяного тока до сих пор остается одной из самых серьезных проблем в мире. Не смотря на то, что почти каждый орган в человеческом организме может быть поврежден, в большей мере заболеваемости подвержены: сердце (поражение венечной артерии), мозг (поражение церебральных сосудов) и нижние конечности (поражение периферических сосудов) [Rasmussen H.S. et al., 2002].
Известно, что в организме человека имеются естественные регуляторы роста кровеносных сосудов, способствующие образованию коллатералей, обходящих места закупорки артерий. Однако белки факторов роста кровеносных сосудов, при введении в организм, имеют короткий период полураспада [Takeshita S. et al. , 1994] , а для индукции роста сосудов нужно поддерживать необходимый уровень белка - ангиогена продолжительное время. Поэтому, для лечения ишемических заболеваний перспективными являются генно-терапевтические методы. Генная терапия предоставляет возможность для повышения в организме уровня белков - факторов роста кровеносных сосудов и поддержания его длительный период времени.
Существует множество факторов роста кровеносных сосудов, доставка которых в организм при помощи методов генной терапии, могла бы привести к лечебной неоваскуляризации. У большинства ангиогенных факторов уже исследуется механизм действия и эффективность индукции роста новых кровеносных сосудов. В нашем исследовании мы использовали ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF12i) и ген ангиогенина (ANG) .
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов, и исследование возможности индукции неоваскуляризации в результате внутримышечного введения вирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG лабораторным животным.
В связи с этим, в процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1. Создание векторов на основе аденовируса птиц CELO, несущих гены ANG и VEGF, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH.
2. Создание вектора на основе аденовируса человека 5, несущего ген ANG, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток 293.
3. Изучение действия VEGF и ANG, экспрессируемых с генов в составе рекомбинантных аденовирусов, на ангиогенез в мышечной ткани конечностей лабораторных животных.
4. Разработка системы проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.
5. Исследование антимикробной активности ангиогенина.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Созданы рекомбинантные вирусы на основе аденовируса человека типа 5 и на основе аденовируса птиц CELO, несущие гены факторов роста кровеносных сосудов (VEGFm и ANG) .
2. Показано, что созданные нами рекомбинантные аденовирусы индуцируют прирост кровеносных сосудов в мышечной ткани конечностей лабораторных животных.
3. Отработана система проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.
4. Показано, что ANG не проявляет специфической антимикробной активности.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG, несущие гены факторов роста кровеносных сосудов.
Была продемонстрирована экспрессия генов ANG и VEGF в составе рекомбинантных аденовирусов.
Для проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, нами была разработана тест-система на основе трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов рекомбинантными плазмидами.
Была продемонстрирована возможность индукции неоваскуляризации в мышцах крыс после введения им рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.
Нами проведено исследование антимикробной активности ангиогенина, в ходе которого показано, что ANG не обладает антимикробной активностью.
Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Нами показано, что аденовирусные векторы, в том числе и векторы на основе Ad птиц CELO, осуществляют эффективный перенос терапевтических генов в мышечные клетки и могут быть использованы в генной терапии ишемических заболеваний. Можно ожидать, что векторная конструкция на основе ДНК аденовируса птиц CELO после соответствующей модификации (инактивирования области GAM-1) окажется эффективной для использования в медицине, в частности в терапии ишимизированных конечностей у человека.
Факторы роста кровеносных сосудов.
Васкулогенез - это процесс формирования сосудистой системы из стволовых клеток в эмбриональный период. Ангиогенез - это процесс развития новых кровеносных сосудов из предсуществующих. Он играет важную роль в эмбриональном развитии, в нормальном росте органов и тканей, в заживлении ран, в женском репродуктивном цикле (овуляция, менструация и развитие плаценты), а также во многих заболеваниях. В организме человека имеется множество факторов роста кровеносных сосудов, таких как ангиогенин, VEGF (vascular endothelial growth factor -фактор роста эндотелия сосудов), FGF-2 (fibroblast growth factor-2 - фактор роста фибробластов-2), ростовой фактор гепатоцитов, инсулиноподобный ростовой фактор, PIGF (placental growth factor - плацентарный ростовой фактор), ангиопоэтин, освобождаемый тромбоцитами ростовой фактор, Hif-la (hipocsja inducible factor-la - фактор, индуцирующий гипоксию), определенные интерлекины [Henry T.D. 1999]. В настоящее время исследуются ангиогенные возможности данных ростовых факторов. 1.2.1. Ангиогенин. 1.2.1.1. История открытия и свойства белка ангиогенина. Ангиогенин (ANG) является одним из факторов роста кровеносных сосудов. Его применение в качестве индуктора ангиогенеза может стать перспективным для лечения ишемических заболеваний. ANG -это секретируемый белок, впервые выделенный В 1985 году Бертом Велли и его коллегами из клеток НТ-29 человеческой колончатой аденокарциномы. Свое название ангиогенин получил за способность индуцировать рост новых кровеносных сосудов в хорио-аллантоисной мембране куриных эмбрионов. Статистическая оценка показала, что белок проявляет биологическую активность в количестве 35 fmol на яйцо. Более того, всего лишь 3,5 pmol ангиогенина требовалось для индукции интенсивного роста кровеносных сосудов в роговице кролика [Fett J.W. et аі., 1985] . В 1987 году группа Велли публикует данные о том, что ANG обнаружен в сыворотке крови в количестве 60-150мкг/л, что во много раз превышает его содержание в супернатанте культуры клеток НТ-29 (0,5 мкг/л) [Shapiro R. et al., 1987]. В другой работе приводятся доказательства отсутствия связи между способностью клеток продуцировать ангиогенин и их злокачественностью [Shapiro R. et al., 1987].
Оказалось, что данный белок секретируют клетки различных типов, например, эндотелиальные клетки (ЭК) сосудов, гладкомышечные клетки (ГМК), фибробласты [Moenner М. et al. , 1994], эпителиальные клетки ободочной кишки, периферические лимфоциты крови, клетки опухолей [Shapiro R. et al., 1987] . Последующие изучения обнаружили гомологию между ANG и панкреатической рибонуклеазои. Это позволило отнести ангиогенин к рисбазам (семейству рибонуклеаз со специфической биологической активностью) [D Alessio G. et al., 1991]. Рисбазы-это ферменты, проявляющие низкую активность по отношению к РНК, но не способные при отсутствии РНК-азного действия выполнять специфические функции. В отличие от остальных членов семейства рисбаз, ANG не обладает специфической активностью по отношению к каким-либо типам клеток [St. Clair D.K. et al., 1988; D Alessio G. 1993]. Белок человеческого ангиогенина представлен единственной цепочкой из 123 аминокислот с молекулярной массой примерно 14 кДа [Fett J.W. et al. , 1985; Strydom D.J. et al. , 1985]. Ha N-конце цепи отсутствуют сайты для гликозилирования, а на С-конце для карбогидрирования. Имеют место три дисульфидные связи между аминокислотными (а/к) остатками: 26 и 81, 39 и 92, 57 и 102 [Bond M.D. et al., 1993]. Примерно 28% последовательности идентично другим членам семейства рисбаз [D Alessio G. 1993]. По видимому, рибонуклеазная активность возможна благодаря участку между 39-57 а/к остатками [Seno М. et al., 1995]. Низкое каталитическое действие по отношению к РНК может быть обусловлено отсутствием основных аминокислот в положениях 65 и 117, а также отсутствием четвертой дисульфиднои связи между остатками 58 и 70 [Bond M.D. et al., 1993]. Делеция аминокислотных остатков 121-123 10-ти кратно уменьшает активность ANG к субстрату [Leonidas D.D. et al. , 2002]. Существует гипотеза о конформационных изменениях, произошедших в эволюционном развитии ангиогенина, за счет которых РНК-азная активность молекулы уменьшилась, но увеличилась способность к связыванию с клеточными поверхностными рецепторами[Russo N. et al., 1994; Acharya K.R. et al., 1994] . С клеточной поверхностью ангиогенин связывается посредством актина. Актиноподобный белок 4 2 кДа способен также связывать гепарин. Кроме того ANG может вызывать полимеризацию актина. Анти-актиновые антитела ингибируют индуцированную ангиогенином неоваскуляризацию в хорио-аллантоисной мембране куриных эмбрионов [Ни G-F. et al., 1993]. Также ANG способен связываться с 170 кДа клеточным рецептором [Хи Z. et al., 2002; Ни G-F. et al., 1997]. По имеющимся данным ангиогенины быка, кролика, свиньи и мыши идентичны по аминокислотной последовательности человеческому белку на 65%, 73%, 66% и 75% соответственно [Bond M.D. et al., 1993]. Рекомбинантный белок ANG человека экспрессируется и в прокариотической и в эукариотической системах, в каждой из которых он проявляет как ангиогенную, так и рибонуклеазную активность [Kurachi К. et al., 1988; Shapiro R. et al., 1988]. Перекрестно-реактивными для человеческого ANG являются бычья, мышиная и крысиная модели [Heath W.F. et al. , 1989], но имеются данные о том, что ангиогенин человека не может связываться с фибробластами грызунов [Baddet J. et al., 1989] и бычьими эндотелиальными клетками [Ни G-F. et al. , 1991], a ANG быка не активен в человеческой зндотелиальной модели [Jimi S-I. et al., 1995]. 1.2 .1.2. Роль ангиогенина в неоваскуляризации.
Роль ангиогенина в неоваскуляризации не вызывает сомнения. Однако до сих пор полностью не выяснено как белок вызывает ангиогенез. Процесс формирования кровеносных сосудов включает в себя несколько независимых, но взаимосвязанных событий на клеточном и биохимическом уровнях: 1) активация эндотелиальных клеток под действием ангиогенного стимула; 2) вторжение активированных ЭК в окружающие ткани и миграция их в направлении ангиогенного стимула; 3) пролиферация и дифференциация ЭК для формирования капилляров [Folkman J. et al., 1992; Moscatelli D. et al., 1988]. Ангиогенин индуцирует протекание большинства индивидуальных событий в процессе неоваскуляризации. Для миграции ЭК необходимо нарушить целостность естественного барьера, содержащего 4 компонента: коллаген, ламинин, фибронектин, гепаринсульфатпротеогликан. ANG связывается с актином на поверхности клеток, что способствует активации эндотелиально-клеточных протеаз, действующих на один или более компонентов базальнои мембраны [Ни G-F. et al. , 1993]. Актин-ангиогениновый комплекс ускоряет образование плазмина посредством тканевого плазминогенного активатора. После этого плазмин может непосредственно вызывать деградацию ламининового и фибронектинового компонентов базальнои мембраны. Кроме того, плазмин может превращать латентный TGF-J31 (transforming growth factor- l) в активный TGF-(31, способный активировать коллагеназу, что вызывает деградацию базальнои мембраны [Lyons R.M. et al., 1990; Ни G-F. et al. , 1994] . Таким образом, миграция ЭК находится под контролем ангиогенина. В различных исследованиях установлено, что ANG связывается с эндотелиальными клетками [Baddet J. et al., 1989], способствует их вторжению в окружающие ткани [Ни G-F. et al., 1994], опосредует клеточное сцепление [Soncin F. 1992] и индуцирует формирование трубчатых структур из культурируемых ЭК [Jimi S-I. et al., 1995; Chamoux M. et al., 1991].
Методы
Выделение и очистка плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли из штамма E.coli DH5a щелочным методом [Маниатис Т. и др. 1982]. 0.5 л среды LB (1% бакто-триптона, 0.5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl заражали штаммом, несущим плазмиду и растили до оптической плотности OD550 = 0.7-0.8, затем добавляли антибиотик хлорамфеникол (Serva, Германия) до конечной концентрации 170 мг/мл и инкубировали 14-18 часов при 37С и интенсивном покачивании. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, ресуспендировали в 10 мл буфера (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl рН 8, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима) и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Добавляли 20 мл раствора, содержащего 0.2 М NaOH, 1% ДСН. Раствор инкубировали 10 минут на льду. Добавляли 15 мл 5М ацетата калия, инкубировали 10 минут на льду, центрифугировали 2 0 минут 20 тыс.об/мин. К супернатанту добавляли 0.6 объема изопропанола и после 15 минут инкубации при комнатной температуре осаждали ДНК центрифугированием 30 минут 12 тыс. об/мин. Осадок промывали 7Оным этанолом и растворяли в буфере ТЕ. Плазмидную ДНК очищали изопикническим центрифугированием в градиенте плотности CsCl в присутствии бромистого этидия в вертикальном роторе Vti-80 центрифуги L7-55 (Beckman, США). 2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли из клеток E.coli штамма DH5a по методу Holmes [Ни Н. et al., 1999]. зндодезоксирибонуклеазами использовали буферные смеси с низкой, средней и высокой ионной силой, согласно рекомендациям фирм-производителей. Время инкубации составляло от 1 до 4 часов при 37 С. 2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле. Разделение фрагментов ДНК проводили согласно Маниатису и др. [Маниатис Т. и др. 1982] методом электрофореза в горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы от 1% до 3%. Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере (0.04М трис-ацетат рН 8.1, 0.002М ЭДТА) с содержанием 0.5 мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 30-60 мин. Гели с разделенными фрагментами фотографировали в УФ-свете на пленку "Микрат-300" с использованием оранжевого светофильтра. 2.2.5.
Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля. Препаративное разделение фрагментов ДНК проводилось в 0.8%-ном агарозном геле. Фрагменты выделяли из геля методом электроэлюции [Маниатис Т. и др. 1982]. Полученный раствор ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформ и хлороформом, после чего преципитировали этанолом. Эффективность элюции контролировали методом электрофореза в агарозном геле. 2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК. Для лигирования фрагментов ДНК использовали ДНК-лигазу фага Т4 производства "Fermentas MBI" (Литва). Реакция лигирования проводилась в буфере, содержащем трихлорид гексааминокобальта. Состав буфера: 250 мМ трис-HCl рН 7.2, 25 мМ КС1, 5 мМ МдС12, 10 мМ ДТТ, 1 мМ трихлорида гексааминокобальта. Реакция лигирования заканчивалась после инкубации в течение 4 5 минут при комнатной температуре. Соотношение и концентрацию вектора и клонируемого фрагмента определяли по таблице оптимизации лигирования [Legerski R. et al., 1985]. 2.2.7. Трансформация клеток E.coli. Для трансформации клеток лабораторных штаммов E.coli DH5a использовали метод Hanahan [Hanahan D. 1983]. Эффективность трансформации составляла 107 5x1О8 трансформантов на 1 мкг суперскрученной ДНК плазмиды pUC19. 2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Первичную структуру ДНК определяли по методу Sanger [Sanger F. et al., 1977]. 2.2.9. Полимеразная цепная реакция. Полимеразную цепную реакцию проводили в автоматическом режиме на приборе Терцик (Россия). 100 мкл реакционной смеси содержали: 10 мкл 10х буфера, 16 мкл смеси дНТФ (конечная концентрация 200 мМ), 100 пмоль каждого праймера, 1 мкл раствора БСА (1,7 мг/мл), 2,5 Ед фермента и стерильную деионизованную воду до 100 мкл. На реакционную смесь наслаивали 50 мкл вазелинового масла, насыщенного водой. Для амплификации использовали Taq-полимеразу производства фирмы "Fermentas" MBI (Литва). Состав 10х буфера: 1 мл 0.67 М трис-HCl рН 8.8, содержащего 2 0 мМ МдС12 и 0.15 М (NH4)2S04. Параметры амплификации : периодическая денатурация - 93 С - 1 мин. отжиг праймеров с матрицей - 37 С - 1 мин; синтез комплементарных цепей - 72 С - 1 мин; Всего проводили 25-35 циклов реакции. Использовались праймеры: pSAAl 5 - GAC CCA GAC CCA GCA CGA AG- 3 pVEGFl 5 - GAG GTA GAG CAG CAA GGC AAG G - 3 pAdRdlEl 5 - TAA GAC CCC CAC CTT AT - 3 pwtEIR 5 - ATG TCG GGC GTC TCA GG - 3 pKD2 5 5 - CGC GGG AAA ACT GAA TAA GAG GA - 3 p4 5 - СТА ACG CAG TCA TAA CCG - 3 - 3 Синтез праймеров проведен ЗАО «СИНТОЛ».
Синтез производили амидофосфидным способом на автоматическом синтезаторе ASM-102U (Россия). 2.2.11. Трансфекция клеток линии 2 93 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов. Трансфекцию проводили методом кальциево-фосфатной преципитации по Graham [Graham F.L. et al., 1973]. Клетки линии 293 или LMH рассеивали за 24 часа до трансфекции. Кальциево-фосфатный преципитат получали смешивая lxHEBS буфер (5 г/л HEPES, 8 г/л NaCl, 0.37 г/л КС1, 0.125 г/л Na2HP04.2H20, 1 г/л глюкозы рН 7.1) с 10 мкг/мл препарата ДНК-носителя (ДНК спермы лосося), затем добавляли 10 мкг/мл препаратов ДНК плазмид. К полученной смеси по каплям добавляли 2. 5М СаС12 (50 мкл/мл) , перемешивали, инкубировали смесь при комнатной температуре 30 мин и полученный преципитат вносили в культуральную среду из расчета 1 мл преципитата на 10 мл среды. После инкубации в С02- инкубаторе в течение 4.5 часов среду заменяли на покрытие с 0.5% агарозой. Бляшки рекомбинантных Ad, которые появлялись на 12-20 день после трансфекции, отбирали пастеровской пипеткой и полученный вирусный материал размножали на клетках линии 293 или LMH. Аденовирусы человека накапливали в культуре клеток линии 293 по методике Green [Green K.Y. et al., 1980] . Инфицированные клетки снимали, концентрировали низкоскоросным центрифугированием, суспендировали в буфере (0.01М трис-HCl рН 8.0, 0.01М NaCl, 5 мМ ЭДТА) и разрушали с помощью гомогенизатора "Viris4 5" (30 тыс. об/мин 3 раза по 60 сек) . Полученную суспензию обрабатывали равным объемом фреона 113, после чего фазы разделяли низкоскоростным центрифугированием; водную фазу отбирали и подвергали дополнительной обработке фреоном 113 для полной очистки вирусной суспензии от липидных компонентов клеток. Аденовирусы птиц CELO накапливали в куриных эмбрионах. SPF куриные эмбрионы заражали в возрасте 10-ти суток лизатом клеток LMH, зараженных рекомбинантными Ad, в дозе 107 БОЕ/эмбрион. Эмбрионы инкубировали 2-е суток при 37 С, затем выдерживали на 4 С еще сутки. Из эмбрионов отбирали аллантоисную жидкость, осветляли низкоскоростным центрифугированием.
Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов.
Для определения влияния ангиогенина на рост микроорганизмов культуры засевали в L-бульон в концентрации 105 к.о.е./мл. Через 5 часов брали пробы объемом 1 мл, центрифугировали и добавляли к ним либо ЮтМ Na-P буфер, либо буфер PBS. Данные буферы либо не содержали никаких белков, либо содержали ангиогенин человека, либо бычий сывороточный альбумин (BSA). Пробы инкубировали в течение 2-х часов при 37 С, после этого проводили высев на плотные питательные среды (5%-ный кровяной агар для S. pneumoniae и candida-arap для С. albicans) , инкубировали в течение 48 часов (С. albicans при 2бС и S. pneumoniae при 37С) и проводили подсчет колоний. Данная работа проводилась совместно с к.б.н. Чернухой М.Ю. и д.б.н. Шагиняном И.А. (ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Для создания плазмидной конструкции pS415ANG, несущей ген ангиогенина человека в составе фрагмента генома аденовируса CELO, нами была использована плазмида p415CD [Логунов Д.Ю. и др., 2002], несущая фрагмент генома CELO от 88,8 до 100 ед. карты. В сайте делеции, несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты) находится экспрессирующая кассета (зукариотический промотор ранней области цитомегаловируса - CMV, ген SEAP, сигнал полиаденилирования гормона роста КРС) . Из данной плазмиды был выделен ген SEAP (вырезание по сайтам Nhe I, EcoR V) и на его место под промотор был клонирован ген ангиогенина из плазмиды рАпдЗ, любезно предоставленной Тарантулом В.З. [Константинов Б.А., и др. 2003; Мертвецов Н.П. и др., 2001] (вырезание по сайтам Nhe I, Sma I). Для создания плазмидной конструкции pS415VEGF121, несущей ген VEGF в составе фрагмента генома аденовируса CELO нами была проведена серия клонирований. Ген VEGFi2i был выделен из плазмиды pAdCMVVEGF121, которая была любезно предоставлена R.G. Crystal (США), по сайтам Крп I, Sma I и по этим же сайтам клонирован в плазмиду pCDNA3.lZeo+. Далее из полученной плазмиды pCDNAVEGF121 ген VEGF121 был выделен по сайтам Afl II, Not I и по этим же сайтам клонирован в описанную выше плазмиду p415CD под эукариотический промотор вместо гена SEAP. Для создания плазмидной конструкции pSAdANG51, несущей ген ангиогенина человека в составе фрагмента генома аденовируса человека 5 серотипа, ген ANG из плазмиды рАпдЗ (вырезание по сайтам Nhe I, Sma I) был клонирован в плазмиду р51.
Данная плазмида содержит фрагмент генома аденовируса человека 5 серотипа от 0 до 16,1 ед. карты, в месте делеции Е1 области генома Ad5 находится экспрессирующая кассета, состоящая из промотора ранней области цитомегаловируса, гена SEAP и сигнала полиаденилирования гормона роста КРС. Ген SEAP был выделен из плазмиды р51 по сайтам Nhe I, EcoR V и под CMV промотор был клонирован ген ANG. 3.1.2. Анализ экспрессии генов ANG и VEGF, содержащихся в плазмидных векторах. Нами отработана система проверки биологической активности генов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны (ХАМ) куриных эмбрионов. Ранее в статье Мертвецова Н.П. и др. сообщалось об использовании для этих целей рекомбинантной плазмиды, несущей ген ангиогенина, но не описывалась методика нанесения плазмидной ДНК, и не приводились конкретные данные по результату опыта [Мертвецов Н.П. и др., 2001]. Для определения эффективности проникновения мы использовали плазмиду pGREEN-la. 50 мкл препарата плазмиды, содержащей 50 мкг ДНК, наносили на бумажный фильтр, который помещали на ХАМ куриных эмбрионов. В качестве контроля на бумажный фильтр, помещенный на ХАМ куриных эмбрионов наносили буфер ТЕ без плазмиды. Как следует из результатов эксперимента (рис. 9), плазмида, нанесенная на ХАМ, проникает в ее клетки и экспрессируется, о чем свидетельствует появление клеток с зеленым свечением. Аналогичное свечение наблюдалось и при введении меньшего количества (20 мкг/50 мкл) pGREEN-la. Таким образом, было показано, что предложенный нами метод введения рекомбинантной плазмиды обеспечивает доставку и экспрессию репортерного гена. ХАМ, обследованная в люминесцентном микроскопе при длине волны 4 90 нм; ФАЗА - ХАМ, обследованная в световом микроскопе. Далее мы провели испытание плазмиды pS415ANG, содержащей ген ангиогенина. 8-ми дневные SPF куриные эмбрионы делили на 3 группы. На ХАМ эмбрионов из первой группы помещали бумажные фильтры, пропитанные 50 мкл препарата плазмиды pS415ANG (концентрация ДНК 1 мкг/мкл). 2-ой группе аналогично наносили эквивалентные количества плазмиды pGREEN-la.
Для 3-ей группы использовался буфер ТЕ. Для каждого эмбриона определяли число кровеносных сосудов 1, 2 и 3 порядка, до и после опыта. Прирост сосудов оценивали по разнице между этими значениями и сравнивали для опытной и контрольной групп. После 4-х дней инкубации мы наблюдали прирост сосудов в 1-ой (опытной) группе. Значительно меньший прирост наблюдался в 2-х контрольных группах (рис 10). Сосудистая плотность в месте нанесения была значительно увеличена в опытной группе. Сосуды располагались подобно "спицам колеса", что совпадает с литературными данными по индукции роста кровеносных соудов в ХАМ белками-ангиогенами [Ribatti D. et al., 1995]. Аналогичные результаты были получены для плазмиды PS415VEGF. Чтобы свести к минимуму влияние того, что хорио-аллантоисные мембраны куриных эмбрионов, взятых для опыта, изначально отличаются друг от друга по сосудистой плотности, подсчет сосудов был произведен как до, так и после опыта, а эффективность действия факторов оценивалась по приросту сосудов (разница между числом сосудов на 12 и на 8 дни инкубации) . Таким образом, мы считали реальные цифры увеличения количества сосудов в каждом эмбрионе (таб. 2). Таблица 2. Среднее число кровеносных сосудов, а также средний прирост сосудов, вычисленный по разнице между их числом до нанесения препаратов плазмид pS415Ang, pGREEN-la, буфера ТЕ (8-ой день инкубации) и по окончании опыта (12-ый день инкубации). Приведенные выше результаты демонстрируют, что проникновение рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ангиогенина человека и фрагмент генома аденовируса птиц CELO, эффективно индуцирует рост кровеносных сосудов в клетках хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов. Полученные данные позволяют использовать разработанную нами методику для тестирования биологической активности продуктов экспрессии различных генов, находящихся в составе рекомбинантных плазмид. 3.1.3. Получение аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток. Рекомбинантные аденовирусы получали методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH [Д.Ю. Логунов и др., 2002; М.М. Шмаров и др., 2002]. Для получения аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF, плазмидами pS415ANG и pS415VEGFl21, совместно с фрагментом генома аденовируса птиц CELO от 0 до 99.7 ед. карты, полученным в результате гидролиза геномной ДНК CELO по эндонуклеазе рестрикции Swa І, трансфицировали клетки LMH. В результате гомологичной рекомбинации восстанавливалась инфекционность вирусного генома с включением экзогенной последовательности (промотора, гена фактора роста кровеносных сосудов и сигнала полиаденилирования) , что приводило к генерации рекомбинантных вирусов CELO-ANG и CELO- VEGF (рис. 12).
Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.
Все хирургические манипуляции с лабораторными животными проводились совместно с к.м.н. Вороновым Д.А. (Российский научный центр хирургии) и с к.б.н. Хайдаровой Н.В. (ИМГ). Переднюю болыпеберцовую мышцу крыс линии Wistar однократно инъецировали вирусами CELO-GFP и Ad-GFP (109 б.о.е. на животное) (рис. 19), контрольным животным был введен буфер PBS. На 3-ий день после инъекции срезы мышц исследовали в люминесцентном микроскопе и в видимом свете. В клетках мышц животных, инъецированных рекомбинантными вирусами, при исследовании в люминесцентном микроскопе при длине волны 4 90 нм наблюдалась характерная для GFP флуоресценция (зеленое свечение). В клетках мышц животных контрольной группы такое свечение полностью отсутствовало. УЛЬТРАФИОЛЕТ - передняя большеберцовая мышца крысы, обследованная в люминесцентном микроскопе при длине волны 4 90 нм; ФАЗОВЫЙ КОНТРАСТ - передняя большеберцовая мышца крысы, обследованная в световом микроскопе. А - введение вируса CEL0-GFP. Б - введение вируса Ad-GFP. В - введение буфера PBS. После однократной инъекции рекомбинантного аденовируса CELO-SEAP (109 б.о.е. на животное) в переднюю большеберцовую мышцу крыс, активность SEAP в сыворотке крови крыс была максимальна на 3 день, постепенно уменьшаясь до 7 дня. В качестве контроля использовали сыворотку крови крыс, инъецированных вирусом CELO-GFP. Активность SEAP на 3-ий день после инъекции составляла 0,825 мЕд/мл в опытной группе и 0,165 мЕд/мл в контрольной. Таким образом, используя вирусы CELO-GFP, Ad-GFP и CELO-SEAP, мы показали способность векторов на основе аденовируса птиц CEL0 осуществлять доставку генов в клетки мышечной ткани и возможность экспрессии этих генов под контролем регуляторных элементов CMV. 3.2.2. Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. Рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG были инъецированы крысам линии Wistar в переднюю болынеберцовую мышцу. В качестве контроля другим группам мышей проводили инъекцию рекомбинантного аденовируса CELO-SEAP, несущего ген секретируемого белка термостабильной щелочной фосфатазы или Ad-GFP, несущего ген зеленого флуоресцирующего белка.
Препараты мышцы фиксировали в 10% растворе формалина в течение 2 4 часов, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, азокармином по Гейденгайну. Из исследуемой мышцы от каждой крысы получали 2 блока. Из каждого блока делали 3 среза и считали капилляры в 30 полях окулярной квадратной сетки. В каждой из исследуемых групп проводился непосредственный подсчет количества капилляров вне зоны продуктивного воспаления в 150 полях зрения окулярной квадратной сетки (по 5 животных в группе). Статистическую обработку проводили методом анализа различий двух средних величин при малых выборках. Определение надежности средних выборочных производилось по критерию Фишера-Стьюдента t. Очевидно преобладание количества кровеносных сосудов в одном из участков поля окулярной квадратной сетки среза из мышцы, инъецированной вирусом CELO-ANG, над количеством капилляров на аналогичном участке из мышцы, инъецированной CELO-SEAP. Аналогичная картина наблюдалась в мышцах, инъецированных рекомбинантными вирусами CELO- VEGF и Ad-ANG. Прирост кровеносных сосудов оценивали по отношению количества капилляров в срезах мышц мышей из групп, инъецированных вирусами к количеству капилляров в срезах мышц мышей из контрольной группы, которой был введен буфер PBS. Гистологический анализ показал, что рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG вызвали заметный прирост кровеносных сосудов в М. tibialis anterior по сравнению со всеми контрольными группами животных (табл. 3, 4, 5, 6) . Прирост капилляров в мышцах животных, которым вводили вирусы, содержащие гены факторов роста кровеносных сосудов, по сравнению с количеством капилляров в мышцах животных из контрольных групп, статистически достоверен (р 0,01). Таким образом, нами показано, что CELO-ANG и CELO-VEGF индуцируют неоваскуляризацию в мышечной ткани лабораторных животных, однако индукция прироста кровеносных сосудов вирусом CELO-VEGF более значительна. VEGF в качестве ангиогенного фактора в мировой науке исследуется уже давно. Известно, что он является мощным индуктором неоваскуляризации, но вызывает прирост «незрелых» кровеносных сосудов. Ангиогенные свойства ANG только начинают исследоваться in vivo. Известные по литературным данным свойства ангиогенина позволяют предположить, что он индуцирует не только рост новых сосудов но и их созревание. По этому, не смотря на меньшую эффективность по сравнению с VEGF, использование ANG может являться эффективным для повышения качества новообразованных капилляров. 3.3. Исследование антимикробной активности ангиогенина. В 2003 году группа ученых опубликовала статью "Ангиогенины: новый класс антимикробных белков, вовлеченных во врожденный иммунитет" [Hooper L.V. et al., 2003]. В данной статье описана серия экспериментов с мышиным ангиогенином (ANG) и ANG человека, в ходе которых авторы доказывают способность данных белков угнетать рост различных условно патогенных микроорганизмов. Это свойство человеческого ангиогенина показалось нам привлекательным для собственных исследований. Чтобы использовать открытие L.V. Hooper и коллег в наших исследованиях, необходимо было повторить описанный опыт.
Однако после постановки аналогичного опыта нами были получены результаты, не соответствующие результатам, описанным в статье L.V. Hooper. В нашей работе мы использовали клинический штамм Candida albicans и штамм Streptococcus pneumoniae №7 4 65. Для данных штаммов определяли логфазу. Культуру засевали в L-бульон в концентрации 105 к.о.е./мл. Через каждый час проводили высев на плотные питательные среды (5%-ный кровяной агар для S. pneumoniae и candida-arap для С. albicans), инкубировали в течение 48 часов (С. albicans при 2бС и S. pneumoniae при 37 С) и проводили подсчет колоний. По 10-ти кратному увеличению числа колоний определяли логфазу. Логфаза для Candida albicans и Streptococcus pneumoniae равна 5 ч. Для определения влияния ангиогенина на рост данных микроорганизмов культуры засевали в L-бульон в концентрации 105 к.о.е./мл. Через 5 часов брали пробы объемом 1 мл, центрифугировали и добавляли к ним либо ЮтМ Na-P буфер, либо буфер PBS. Данные буферы либо не содержали никаких белков, либо содержали ангиогенин человека, либо бычий сывороточный альбумин (BSA). Пробы инкубировали в течение 2-х часов при 37 С, после этого проводили высев на плотные питательные среды (5%-ный кровяной агар для S. pneumoniae и candida-arap для С. albicans) , инкубировали в течение 48 часов (С. albicans при 2бС и S. pneumoniae при 37С) и проводили подсчет колоний. В исследовании L.V. Hooper Candida albicans и Streptococcus pneumoniae, подращенные до логфазы, ресуспендировали в ЮтМ натрий -фосфатном буфере с 7 0пМ и с 2цМ ANG, соответственно. После инкубации в течение 2-х часов при 37 С микроорганизмы раститровывали на чашках с питательной средой. В результате эксперимента наблюдали угнетение образования к.о.е. С. albicans и S. pneumoniae более чем на 99% по сравнению с группами, где в ЮтМ натрий - фосфатный буфер ANG не добавлялся. Кроме того, авторы обращают внимание на то, что угнетение образования к.о.е. С. albicans и S. pneumoniae прогрессивно уменьшается при увеличении концентрации NaCl в буфере от 75 до 150тМ (при 150тМ угнетение менее 1%). В нашем исследовании мы полностью повторили все условия опыта, описанного L.V. Hooper. Мы использовали ANG человека производства фирмы "Sigma" (США), грибковый микроорганизм Candida albicans и грамм-положительный бактериальный микроорганизм Streptococcus pneumoniae. Мы исследовали влияние ANG человека на рост С. albicans и S. pneumoniae с использованием ЮтМ натрий - фосфатного буфера и буфера PBS (концентрация соли 150mM). Однако, кроме контрольной группы, в которой использовался буфер без ANG, мы взяли контрольную группу, в которой в буфер был добавлен другой белок - бычий сывороточный альбумин (BSA).
