Содержание к диссертации
Введение
РОЛЬ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ 5S рРНК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ 5s рРНК
1.1. Множественность 5s рРНК некоторых организмов 6
1.2. Конформационные изомеры 5s рРНК. 7
1.3. Организация генов 5s рРНК эукариот 9
1.4. Транскрипция генов 5S рРНК II
1.5. Комплексы 5SpPHK с белками 15
1.6. Комплексы с белками ооцитной и соматической 5SpPHK 18
1.7. Взаимодействие 5SpPHK с большими рибосомными РНК 20
П. Методы исследования пространственной структуры 5spPHK
П.І. Физические методы исследования пространственной структуры 5 S рРНК 24
П.2. Исследование пространственной структуры 5SрРНК методом химических модификаций 32
П.З. Ферментативные методы 43
П.4. Эволюционный подход к исследованию пространственной структуры 5S рРНК 50
П.5. Обобщенные модели вторичной структуры 5S рРНК.. 53
I. Материалы и методы 60
II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. РАЗДЕЛ
I. Обнаружение и выделение из половых и соматических клеток вьюна ооцитнои и соматической 5 S рРНК 73
П. Определение степени повторяемости генов 5 s рРНК 77
РАЗДЕЛ 2
Ш. Исследование конформационных изомеров 5 s рРНК
вьюна 81
IV. Локализация однослиральных и двуспиральных участков в молекулах соматической и ооцитнои 5 s рРНК 85
V. Определение экспонированных цитозиновых остатков в соматической и ооцитнои 5 S рРНК вьюна 92
III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Сравнение характера расщепления структурно-специфическими нуклеазами соматической и ооцитнои s рРНК вьюна и 5 s рРНК других организмов 97
2. Проблема нестабильности вторичной структуры 5 S рРНК 99
3. Модели вторичной структуры соматической и ооцитнои 5 S рРНК вьюна Ю2
4. Некоторые функциональные аспекты структурных различий между соматической и ооцитнои 5 s рРНК
ІV. ВЫВОДЫ 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 116
- Множественность 5s рРНК некоторых организмов
- Обнаружение и выделение из половых и соматических клеток вьюна ооцитнои и соматической 5 S рРНК
- Сравнение характера расщепления структурно-специфическими нуклеазами соматической и ооцитнои s рРНК вьюна и 5 s рРНК других организмов
Множественность 5s рРНК некоторых организмов
Хори и Осава (87) разделяют 5s РНК всех организмов на 4 типа: прокариотный 116-И тип, прокариотный 120-N тип, метабактериаль-ный тип и эукариотный тип. Все эти типы 5s РНК различаются по длине Сот 116 до 123 нуклеотидов) и по ряду физико-химических признаков, что вероятно, отражает различия в организации их пространственной структуры. 5S РНК архебактерии Halococcus mor-.. rhuae (метабактериальный тип) уникальна по своей структуре, ее длина 231 нуклеотид, т.к. она содержит внутри себя вставку длиной 108 нуклеотидов (103).
В отличие от тРНК 5s РНК, в основном, представлена в организме одним видом. Но у некоторых про- и эукариот обнаружена 5S РНК двух и более видов, которые различаются как по длине, так и по небольшому количеству замен в первичной структуре. Два и более ВИДОВ 5S РНК найдено у Е.соli, Bacillus stearothermopholus, Б. subtilis, Lactobacillus viridescens (68). Дарликс и сотр. (59) показали, что у одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomo-nas reinhardii существует два вида 5s РНК: основной (122 нуклеотида) и минорный (121 нуклеотид), которые различаются по .. первичной структуре по 17 положениям. Авторы предполагают на.основании этого, что у зеленой водоросли есть две функционально-различающиеся группы рибосом. Два вида 5S РНК найдено также у нематоды Rhabditis tokai, которые различаются по первичной структуре по ІЗ положениям (96), и в яичниках медузы Aurelia aurita (188).
Дени и Вегнец (63) и Форд и Браун (73) показали, что в соматических и половых клетках рыб и амфибий находятся различные 5s рРНК, которые авторы обозначили как соматическая и ооцитная 5S рРНК. У рыбы Tinea tinea соматическая и ооцитная 5s JDFHK различаются по первичной структуре по 3 положениям (63), у.Хепо-pus laevis и X.borealis по 6 и 7 положениям (68,73). Эти различные типы 5s рРНК кодируются разными генами, активность которых в разных клетках организма неодинакова: только небольшая часть ооцитных генов ксенопуса экспрессируется в раннем зародыше-и они не экспрессируются в соматических тканях, тогда как в ооци-тах они экспрессируются практически все. Во время эмбриогенеза соотношение их синтеза в клетке меняется. Как показали Ворминг-тон и Браун (192) у ксенопуса на стадии бластулы синтезируется -примерно одинаковое количество соматической и ооцитной 5s рРНК, а к концу гаструляции - почти 95$ соматической и только Ъ% ооцитной 5S рРНК. В печени и мозгах цыпленка (97) обнаружено два вида 5s р?НК, 5SjpPHK и 5S2pPHK, которые находятся в этих тканях примерно в равных соотношениях. Эти 5 s рРНК одинаковы по длине (120 нуклеотидов), но различаются по первичной структуре по 10 положениям. Оказалось также, что 5SjpPHK по первичной структуре -идентична 5s РНК из фибробластов куриных зародышей (49). Биологическая роль такой гетерогенности 5s рРНК у одного и того же организма пока не ясна.
Обнаружение и выделение из половых и соматических клеток вьюна ооцитнои и соматической 5 S рРНК
Для исследования предполагаемой множественности 5S рРНК у вьюна нами использовалась простая схема получения фракции низкомолекулярных РНК. Тотальные препараты нуклеиновых кислот, выделенные фенольно-детергентным методом из половых клеток (неопло-дотворенная икра) и соматических тканей (печень, мышцы) пресноводной рыбы вьюна переосаждением в 1,7 М Had разделяли на солерастворимую и соленерастворимую фракции. Рибосомные I8S, 28S, мРНК и их предшественники образуют соленерастворимый осадок. В солерастворимую фракцию попадают ДНК и низкомолекулярные РНК, в том числе тРНК, 5S рРНК, 5,83рРНК. Суммарную солерастворимую фракцию нуклеиновых кислот анализировали электрофорезом в 12$ ПААГ в разных условиях: в нативных, в условиях частичной денатурации и в условиях практически полной денатурации РНК.
В нативных условиях электрофореза (ПААГ без мочевины) 5S рРНК из соматических тканей и половых клеток мигрирует с одинаковой скоростью (рис.6а ). В условиях частичной денатурации (ПААГ с 7 М мочевиной при температуре 20), когда расплавляется часть непротяженных спаренных участков и третичная структура, 5SpPHK из печени и неоплодотворенной икры мигрируют с разной скоростью -5SpFHK из печени движется медленнее, чем 5SpPHK из неоплодотворенной икры (рисДб). В условиях полной денатурации (ПААГ с 7 М мочевиной при температуре 50) 5SpFHK из половых и соматических клеток движутся с одинаковой скоростью (рисб в). На основании этих результатов сделали вывод о том, что 5 S рРНК из печени и неоплодотворенной икры одинаковы по длине, но, вероятно, различаются по вторичной и даже по первичной структуре. Это нашло подтверждение в дальнейшем при определении первичной структуры обеих 5 s рРНК. По аналогии с лягушкой и рыбой Tinea tinea 5S рРНК из соматических тканей обозначили как соматическая, а из половых клеток - ооцитная 5SpPHK. Было показано, что соматическая и ооцитная 5SpFHK вьюна одинаковы по длине (120 нуклеотидов), но различаются по первичной структуре по 6 положениям (НО).
Для препаративного выделения соматической и ооцитной 5 s рРНК солерастворимые препараты нуклеиновых кислот из печени и неоплодотворенной икры вьюна разделяли электрофорезом в 12$ ПААГ, затем из геля элюировали фракции, соответствующие 5S рРНК. Такая схема выделения соматической и ооцитной 5 s рРНК достаточно проста и удобна, так как позволяет обходиться без трудоемких методов ультрацентрифугирования.
Аналитический электрофорез в 12% ПААГ в условиях частичной (рис.7а) и полной денатурации (рис.7в) показал, что выделенные препараты индивидуальных соматической и ооцитной 5S рРНК являлись гомогенными, и их подвижность соответствовала подвижности в составе исходных солерастворимых препаратов в тех же условиях разделения (см.рис.6).
Сравнение характера расщепления структурно-специфическими нуклеазами соматической и ооцитнои s рРНК вьюна и 5 s рРНК других организмов
При сравнении мест расщепления нуклеазами Sj, Tj и из яда кобры соматической и ооцитнои 5S рРНК вьюна существенных противоречий не наблюдается: места атак РНКазой из яда кобры, в основном, не перекрываются с местами атак НЖазами Sj и Tj. Это дает возможность определить и сравнить одно- и двуспиральные участки в обеих 5 S рРНК вьюна.
Из табл. УІ видно, что у соматической и ооцитнои 5s рРНК имеются как одинаковые, так и различающиеся места атак нуклеазои из яда кобры, т.е. имеются одинаковые и различающиеся двуспиральные участки. Наиболее доступные для этой нуклеазы участки, одинаковые у обеих 5SpPHK, совпадают с консервативными палиндро-мными участками, постулированными Хори и Осава (87), см. табл.УП
Это свидетельствует о том, что одинаковые для соматической и ооцитной 5 SpPHK двуспиральные участки являются консервативными.
Места расщеплений нуклеазами Sj и Tj у обеих 5 S рРНК вьюна различаются гораздо больше, чем нуклеазои из яда кобры (см.табл. УІ), это означает, что основные различия во вторичной структуре между ооцитной и соматической 5 SpPHK находятся в неспаренных петлевых участках.
Поскольку первичная структура известных 5 SpPHK является консервативной, было интересно сопоставить результаты по распределению атак нуклеазами s1 и из яда кобры, полученными нами для обеих 5S рРНК вьюна, с аналогичными литературными данными для 5spFHK других объектов,(см.табл.Ш,1У).
Из табл. ІУ видно, что характер расщепления нуклеазои из яда кобры у обеих 5s рРНК вьюна, в основном, не отличается от 5S рРНК других организмов. Так, у 5s рРНК крысы, D.discoideum, дрожжей, галобактерий и др. и у 5s рРНК вьюна имеются примерно одинаковые участки расщепления с 5 по 8, с 17 по 21, с 94 по 99 нуклеотиды. Кроме этих общих мест у каждой 5S рРНК имеются свои участки расщепления этой нуклеазои: ооцитная 5S рРНК различается по 35, 36, 70 нуклеатидам, 5S рРНК БотЪух тогі - по 45 нуклеотиду и т.д.
Несколько иная ситуация наблюдается для нуклеазы s. . У обеих 5S рРНК вьюна, так же как у 5s рРНК крысы, B.mori, D.discoideum , дрожжей, галобактерий, хвоща, места наиболее сильных расщеплений нуклеазои s1 сосредоточены в области с 33 по 57 нуклеотиды.
