Содержание к диссертации
Стр.
Введение 4
Список обозначений и сокращений 6
Литературный обзор 7
1. Инициация транскрипции эукариотической РНК-полимеразой II. . , .7
Элементы последовательности ДНК, участвующие в инициации транскрипции РНК-полимеразой II 8
Общие транскрипционные факторы РНК-пол им еразы II 8
Медиатор РНК-пол им еразы II 10
2. Oct-1 - полифункциональный фактор 13
Строение белка Oct-1 15
Взаимодействие Oct-1 с участками связывания 19
Альтернативный сплайсинг Oct-1 пре-мРНК 22
Взаимодействие Oct-1 с факторами транскрипции и коактиваторами . 25
Фосфорилирование Oct-І в клеточном цикле 32
Взаимодействие Oct-1 с белками HMG 32
Взаимодействие Oct-1 с белками ядерного матрикса. . 33
Участие Oct-1 в репликации ДНК. . .-г . . 35
Участие Oct-І в эмбриональном развитии, морфогенезе и дифференцировке клеток 35
Oct-1, иммунная система и гемопоэз 37
Oct-1 и эндокринная система 41
Цели и задачи исследования 43
Материалы и методы 44
Реактивы и материалы 44
Стандратные методы 48
Выделение плазмидной ДНК с тритоном Х-100 48
Получение компетентных клеток 48
Трансформация 49
Мечение ДНК 49
Получение клеточных экстрактов из клеток миеломы NS/0 50
Задержка подвижности в геле комплексов ДНК-белок 52
Выделение больших количеств суперскрученной плазмиды с очисткой bCsCI 52
Рестрикция 53
Лигирование 53
Электрофорез ДНК в агарозном геле 54
Выделение ДНК из легкоплавкой агарозы 54
Культивирование клеток 54
Транзиентная трансфекция и определение люциферазной активности 55
3. Клонирование 5'-нетранслируемых областей гена oct-1 мыши ... 56
Клонирование 5'-нетранслируемых областей гена oct-1 мыши перед экзоном 1L 51
Клонирование 5'-нетранслируемых областей гена oct-1 мыши перед экзоном 1U 57
Футпринтинг 57
Создание репортерных плазмид 58
Результаты исследования 60
Экзон-интронная структура гена Oct-1 мыши и человека 60
Клонирование и анализ 5'-областей перед экзонами Ш и 1L .... 61
Поиск сайтов связывания, потенциально способных
участвовать в ауторегуляции гена Oct-1 65
Анализ ДНК-белковых комплексов методом задержки подвижности в геле 65
Поиск методом футпринтинга сайтов связывания,
потенциально способных участвовать в ауторегуляции гена Oct-1 . . 67
4. Изучение промоторной активности 51-областей перед экзонами
ШиІЬ в клетках линии фибробластов 10(1) 69
/ 4. Юпределенте активности промоторов 1U и 1L 69
4.2Функциональный анализ 5'-фланкирующей области экзона 1L . . . .71 4.3Изучение активности промоторов 1U и 1L в лимфоидных и
нелимфоидных клетках 72
Обсуждение результатов 75
Выводы 83
Список литературы 84
Список публикаций по теме диссертации 100
Благодарности 101
Введение к работе
В отдельной клетке экспрессируются не все представленные в геноме гены, а только малая их часть. Спектр экспрессирующихся генов зависит от типа клетки и степени ее дифференцированности и может изменяться в ответ на поступающие извне сигналы. Одним из основных процессов, определяющих экспрессию, является процесс регуляции транскрипции через регуляторные элементы: промоторы, энхансеры, сайленсеры (цис-регуляторные элементы) и белковые транскрипционные факторы (транс-регуляторные элементы). В настоящее время описаны десятки факторов транскрипции и множество сигнальных путей, конечной точкой приложения которых являются универсальные процессы инициации (и реинициации) транскрипции и синтеза пре-мРНК РЫК-пол имеразами. При изучении процессов регуляции транскрипции и механизмов действия различных белковых транскрипционных факторов важно понять в какой мере данный процесс является специфическим или универсальным. Несомненный интерес представляет изучение механизмов, позволяющих одному и тому же белку участвовать как в активации, так и в репрессии целого ряда генов.
Белок Oct-І — фактор транскрипции, принадлежащий к POU-семейству. Описанный в конце 1980х годов, Oct-І долгое время считался исключительно «вездесущим» фактором транскрипции, регулирующим работу генов «домашнего хозяйства» клетки. Позднее было показано, что Oct-І принимает участие в регуляции экспрессии ряда тканеспецифических генов, в том числе генов интерлейкинов, легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, генов пролактина, гонадолиберина, тиреотропина и др.
К настоящему моменту описано более полутора десятков генов-мишеней Oct-І, несколько взаимодействующих с ним кофакторов, показано его участие в прикреплении хроматина к ядерной мембране. При этом ничего не известно о регуляции экспрессии самого гена oct-1. Данная работа посвящена анализу
I*
5 промоторных областей гена oct-1 мыши, поиску возможных механизмов регуляции экспрессии гена этого полифункционального фактора.
i%
