Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Основные принципы классификации протеолитических ферментов 11
2. Протеолитические ферменты микроорганизмов 13
2.1. Сериновые протеиназы 13
2.2. Цистеиновые протеиназы 15
2.3. Аспарагиновые протеиназы 16
2.4. Металлопротеиназы 16
2.5. Бактериальные внеклеточные цинксодержащие металлопротеазы 18
3. Механизмы регуляции протеолитических ферментов 21
3.1. Роль протеолитических ферментов в биологической регуляции 21
3.2. Механизмы активации зимогена 22
3.3. «Цистеиновый свитч» 22
3.4. Регуляция активности бактериальных протеиназ 24
3.5. Организация генов бактериальных протеиназ 24
3.6. Контроль генетической экспрессии на уровне транскрипции и трансляции 26
3.7. Посттрансляционные модификации протеиназ 27
3.8. Внеклеточные бактериальные протеазы и из роль в патогенезе 30
3.9. Взаимодействие протеиназ с ингибиторами 30
3.10. Другие факторы, контролирующие активность протеиназ 33
4. Ограниченный протеолиз 35
4.1. Ограниченный протеолиз как метод исследования структуры и функции белков 35
4.2. Актин и его протеолиз 37
4.3. Протеолиз актина бактериальной протеазой ЕСР32 38
5. Механизмы бактериальной инвазии 41
5.1. Инвазирующие бактерии 43
5.2 Инвазирующие бактерии, проникающие в цитоплазму 44
5.3. Генетические основы инвазии бактерий Sh. flexneri 48
5.4. Организация генов Sh. flexneri на большой вирулентной плазмиде 48
5.5. Хромосомные гены бактерий, связанные с вирулентностью 51
Материалы и методы 53
1. Бактериальные штаммы, использованные в работе, условия культивирования 53
2. Клеточные линии и условия культивирования 54
3. Получение актина скелетных мышц кролика 54
4. Определение протеолитической активности 55
5. Клонирование гена гримелизина 55
6. Определение сайта расщепления актина 56
7. Заражение эукариотических клеток бактериями 57
8. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 57
9. Оценка количественной инвазии бактерий 57
10. Саузерн-гибридизация ДІЖ 5 8
11. Аффинная очистка белков 58
12. Методы компьютерного анализа 59
Результаты и обсуждения 60
1. Ограниченный протеолиз актина и инвазивный фенотип бактерий, подвергшихся действию фуразолидона 60
1.1. Инвазивные свойства непатогенного мутанта Shigella flexneri 5а2с, полученного под действием фуразолидона 60
1.2. Анализ клинических изолятов ZF3, ZF7, и ZF53, полученных
от пациентов, длительно лечившихся фуразолидоном 64
2. Исследование распространения ЕСР-подобной протеолитической активности в различных бактериях
2.1. Выявление ЕСР32-подобной активности в энтеробактериях 72
2.2. Количественная инвазия штаммов энтеробактерий, обладающих и не обладающих ЕСР32/гримелизин-подобным фенотипом 74
3. Клонирование гена протеазы и характеристика фермента 76
3.1. Идентификация штамма А2, продуцента протеазы ЕСР 32 76
3.2. Последовательность гена гримелизина из штаммов-продуцентов Serratia grimesii А2 и Serratia grimes И 30063 DZMO 81
3.3. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью His6 на N-конце 86
3.4. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью His6 на С-конце 87
3.5. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком 89
3.6. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком 91
3.7. Определение сайта расщепления актина рекомбинантным гримелизином 92
3.8. Очистка рекомбинантного гримелизина на Ni-содержащих аффинных носителях 94
3.9. Очистка рекомбинантного гримелизина в денатурирующих условиях 95
3.10. Анализ ДНК энтеробактерий 97
4. Анализ инвазии рекомбинантных штаммов-продуцентов гримелизина 99
4.1. Анализ инвазии по данным конфокальной микроскопии 99
4.2. Количественная инвазия рекомбинантных штаммов 103
Заключение 105
Выводы
По список литературы 111
- Цистеиновые протеиназы
- Актин и его протеолиз
- Организация генов Sh. flexneri на большой вирулентной плазмиде
- Заражение эукариотических клеток бактериями
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования последних лет показали, что протеолитические ферменты не только участвуют в обмене веществ, но и играют фундаментальную роль во внутриклеточной регуляции на посттрансляционном уровне. Для понимания этих процессов необходимо изучение внутриклеточных протеаз и тех реакций, которые они катализируют. Кроме того, протеолитические ферменты все более активно применяются в промышленности, медицине и в различных биохимических исследованиях. Особенно перспективным является применение ферментов бактерий, так как бактерии обладают широким набором различающихся по субстратной специфичности протеаз. С этой точки зрения особый интерес вызывают металлопротеазы, поскольку они обладают высокой субстратной специфичностью. В частности металлопротеазы внеклеточного матрикса участвуют в формировании иммунного ответа на инфекцию, привлечении лейкоцитов, процессинге цитокинов и хемокинов, модулировании внеклеточного матрикса. Металлопротеазы бактерий активируют экспрессию металлопротеаз внеклеточного матрикса хозяина и тем самым влияют на развитие инфекции в организме (Elkington et al., 2005). Металлопротеазы также участвуют в процессах ограниченного протеолитического расщепления; например, в образовании активных ферментов из их предшественников (Neurath, 1989), в процессинге секреторных и мембранных белков (Cheyance, Hughes, 2008), морфогенезе вирусов (Galloway et al., 2005), разрушении колицинов (Gillor et al., 2004), инактивации некоторых регуляторных белков (Bramkamp et al., 2006) и др.
Кроме того, подобные ферменты находят применение в структурно-функциональных исследованиях белков с помощью метода ограниченного протеолиза. Примером такого использования протеиназ может служить исследование структуры и функций актина, одного из основных сократительных белков клетки. Актин обладает несколькими функциональными центрами, локализованными в разных частях молекулы. Одним из возможных подходов к изучению локализации этих центров в молекуле актина является исследование функциональных свойств фрагментов молекулы, полученных с помощью разных протеиназ. В ходе такого исследования был обнаружен ограниченный протеолиз
актина бактериальной протеазой ЕСР32 в единственном сайте между Гли42 и Вал43. Актин, расщепленный протеазой ЕСР32, обратимо теряет способность к полимеризации (Khaitlina et al., 1991), а бактерии-продуценты протеазы ЕСР32 оказались способными к инвазии в эукариотические клетки (Efremova et al., 2001). Аналогичная протеолитическая активность была обнаружена в мутантных штаммах Shigella flexneri, полученных в результате обработки патогенных Shigella flexneri фуразолидоном (Федорова, Хайтлина, 1990).
Поскольку прокариоты не содержат актина, функция протеазы в бактериях остается неясной, и выяснение этой функции актуально в свете широко развивающихся сегодня исследований внутриклеточной инвазии бактериальных патогенов. Известно, что воздействие энтеробактерий на эукариотическую клетку проявляется, в частности, в активной перестройке ее актинового цитоскелета. Можно предположить, что ЕСР32 вовлечена в механизмы, обусловливающие патогенность бактерий. Протеаза обладает высокой избирательностью к субстратам, очевидно являясь ферментом, чувствительным к их конформации. Более того, протеаза гидролизует в актине лишь одну, не затрагиваемую другими протеазами, связь, которая играет особую роль в функционировании актиновой молекулы. Широкое распространение актина в живых клетках и большое разнообразие и важность выполняемых им функций вызывают огромный интерес исследователей к этому белку, и продукт ЕСР32-протеолиза является уникальной моделью для исследования актина in vitro и in vivo. Таким образом, протеаза ЕСР32 важна и как объект, и как инструмент в исследованиях процессов в про- и эукариотической клетке и механизмов взаимодействия бактерия — эукариотическая клетка в патогенезе.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование ЕСР32 и ЕСР32-подобных бактериальных металлопротеаз, ограниченно расщепляющих актин, в связи с их возможным участием в инвазии бактерий в эукариотические клетки.
Задачами данной работы было:
Выяснить, содержат ли непатогенные мутанты Sh. flexneri 5а2с, полученные с помощью фуразолидона, известные вирулентные гены Sh. flexneri, и сохраняют ли они способность к инвазии.
Провести скрининг бактерий, выделенных из клинических изолятов, для выявления штаммов, способных к синтезу ЕСР32-подобных актин-специфических протеаз.
Клонировать и экспрессировать ген протеазы ЕСР32.
Исследовать свойства рекомбинантного фермента ЕСР32.
Исследовать инвазивную активность природных и рекомбинантных бактерий, синтезирующих актин-специфические протеазы.
Основные положения, выносимые на защиту:
В референтном штамме Serratia grimesii 30063 DZMO обнаружена новая металлопротеаза - гримелизин, сходная по молекулярной массе, N-концевой последовательности, способности ограниченно расщеплять молекулу актина между Гли42 и Вал43 и чувствительности к действию хелаторов с протеазой ЕСР32. Таким образом, ЕСР32, по-видимому, является гримелизином.
Клонирован и экспрессирован ген гримелизина. Сравнение гримелизина с металлопротеазой протеализином из Serratia proteamaculans выявило различия по 8 аминокислотным остаткам, большинство из которых находится на N-конце молекулы фермента и, возможно, имеет функциональную значимость.
Скрининг бактерий из клинических изолятов выявил бактериальные штаммы, способные к ограниченному протеолизу актина, сходному с ограниченным протеолизом актина ЕСР32/гримелизином. Протеолиз актина термолизиноподобными металлопротеазами энтеробактерий видов Serratia, Proteus и Pseudomonas может быть частью механизма инвазии этих бактериальных штаммов в эукариотические клетки.
Научная новизна. Впервые установлено точное систематическое положение штамма бактерий-продуцентов протеазы ЕСР32, специфически расщепляющей актин. Показано, что по данным 47 биохимических реакций и последовательности 16S-pPHK бактерии, определенные ранее как Eschericha coli А2, идентичны энтеробактериям Serratia grimesii А2. В референтном штамме Serratia grimesii 30063 DZMO впервые выявлена и охарактеризована протеаза гримелизин. Ген гримелизина клонирован и экспрессирован в штамме Е. coli К-12. Показано, что фермент является нейтральной термолизиноподобной металлопротеиназой семейства М4. Показано, что гримелизин и ЕСР32 - это один и тот же белок. Впервые выявлена ЕСР32/гримелизиноподобная актиназная активность в широком спектре бактериальных штаммов. Впервые показано, что бактерии S. grimesii 30063 DZMO способны к инвазии в эукариотические клетки. Впервые установлена корреляция между протеолитической активностью рекомбинантных штаммов, продуцентов ЕСР32/гримелизина и их инвазией в эукариотические клетки.
Теоретическое и практическое значение работы. Рекомбинантный гримелизин может быть использован для ораниченного протеолиза актина с целью изучения его свойств и процесса полимеризации, лежащего в основе функционирования актина в клетке, а также при исследовании внутриклеточных функций актина. Кроме того, возможно использование рекомбинантного гримелизина при изучении структуры и функций других белков.
Рекомбинантные бактерии-продуценты могут быть использованы для изучения инвазии бактерий в эукариотические клетки, а также для изучения функциональных особенностей клетки. Поскольку высокой чувствительностью к инвазии обладают только трансформированные клетки, инвазия рекомбинантных бактерий, экспрессирующих гримелизин, может использоваться в качестве физиологического теста при изучении факторов, связанных с трансформацией клеток, и фармакологических агентов, влияющих на трансформацию.
Цистеиновые протеиназы
Большинство мсталлопротеиназ бактерий являются Zn-содержащими. Zn представляет собой существенный элемент многих белков, которые участвуют в метаболизме различных таксономических групп. С помощью кристаллографического анализа различных Zn-содержащих белков удалось установить основные свойства каталитического и Zn-связывающих сайтов. Во всех Zn-содержащих ферментах с известной кристаллической структурой атом Zn в каталитическом центре связан тремя аминокислотными остатками белка и молекулой воды (Vallee, Auld., 1990). Комбинация остатков Гис, Глу, Асп или Цис составляют тройной (тридентный) активный цинковый сайт. Большой вклад в понимание между структурой и активностью металлозависимых ферментов был получен с помощью создания искуственных металлосодержащих ферментов с различными функциями (Pessi et al., 1993). Введения металл связывающих сайтов в белки может вызывать специфические, прогнозируемые конформационные изменения, а также давать возможность регулировать ферментативную активность. С помощью компьютерного анализа в трехмерной структуре фермента можно идентифицировать сайты, которые при замещении аминокислотных остатков на остатки Гис, будут формировать сайты связывания металла (Higaki et al., 1992).
Наиболее хорошо изученные металлосодержащие белки служат стандартами для изучения структур других белков, и сходство в первичной структуре белка часто используют для объединения белков в группы. По современным представлениям, все металлоэндопептидазы классифицируются в пять отдельных семейств, в соответствии со сравнительным анализом первичной структуры (классификации по системе MEROPS, http://merops.sanger.ac.uk/). Далее будут рассмотрены секретируемые Zn-содержащие металлопротеиназы бактерий.
В числе бактериальных металлопротеаз, исследованных с помощью кристаллографии, наиболее хорошо изучены Zn-содержащие, стабилизированные Са , нейтральные металлоэндопептидазы, такие как: термолизин из Bacillus thermoproteolytics (Holmes, Matthews, 1982; Colman et al., 1972), нейтральная протеаза из Bacillus cereus (Stark et al., 1992) и эластаза из бактерий вида Pseudomonas aeruginosa (Thayer et al., 1991). Последовательность термолизина, нейтральной протеазы Bacillus cereus и эластазы были использованы для сравнения с последовательностями других металлопротеиназ, для которых пока не получено ренгеноструктурных данных.
В последние года значительно увеличилось количество информации о семействе Zn-зависимых металлопротеиназ. Первая "консенсусная последовательность" семейства металлопротеаз была получена на основе гомологии между коллагеназой человека и 11 аминокислотными остатками, образующими Zn-связывающий сайт протеазы из бактерий вида Serratia, это бактериальная протеаза также высокогомологична термолизину в этом сайте (McKerrow, 1987). Позднее была обнаружена первичная структура мотива НЕХХН, который характерен для множества Zn-содержащих протеаз, включая цинковые протеазы эукариот. Наличие этой структуры является отличительным признаком белков этого семейства (Jongeneel et al., 1989).
Детально изучено множество внеклеточных бактериальных металлопротеиназ из патогенных организмов и показано, что они играют важную роль в вирулентности. Секретируемые металлопротеиназы бактерий идентифицированы как у грамположительных, так и грамотрицательных патогенов.
Представители семейства нейтральных протеаз бактерий вида Bacillus , для которых были определены аминокислотные последовательности, такие как нейтральные протеазы B.thermoproteolyticus (термолизин), B.Stearothermophilis, B.subtilis, B.cereus, B.brevis, B.polymyxa, B.cardolyticus, B.megaterium, B.amyloliquefaciens, B.mesentericus имеют высокую степень гомологии по аминокислотному составу между собой. Zn-связывающие сайты и аминокислотные остатки каталитического центра в этих металлопротеиназах очень консервативны, и все эти протеиназы содержат крупные пропептиды между сигнальной последовательностью и последовательностью зрелого белка, которые удаляются в процессе секреции.
Среди известных протеаз, продуцируемых бактериями, термолизин наилучшим образом изучен структурно, известна его первичная структура и третичная структура, охарактеризованы его активные и субстрат-связывающие сайты. Фермент состоит из одной полипептидной цепочки, в которой отсутсвуют тиоловые или дисульфидные группы, ионов цинка, локализованных на активный сайтах и четырех ионов кальция, необхлдимых для стабильности белка (Holmes, Matthews., 1982; Colman et al., 1972). Кристаллическая структура нейтральной протеиназы B.cereus очень похожа на структуру термолизина, и протеазы содержат одинаковые цинк-связывающие лиганды. Структура и механизм активности нейтральной металлопротеазы, выделенной из B.subtilis, очень похожы на структуру и механизм активности термолизина (Signor et al.,1990).
Актин и его протеолиз
Штамм Escherichia coli А2, экстракты которого обладали ранее не известной протеолитической активностью по отношению к глобулярному актину (Г-актину) (Khaitlina et al., 1988, 1991; Усманова, Хайтлина, 1989), был спонтанно обнаружен на биостанции "Восток" Института биологии моря ДВНЦ РАН. Экстракты этих бактерий ограниченно расщепляли актин in vitro (Мантуленко и др., 1983). В экстрактах штамма E.coli А2 идентифицирована нейтральная протеиназа ЕСР32 (КФ 3.4.24) с молекулярной массой 32 кДа, обусловливающая данную специфическую активность (Matveyev et al., 1996).
Протеаза ЕСР32 является внутриклеточным ферментом, синтезируемым и накапливаемым на постлогарифмической фазе роста. Активность протеазы ингибируется о-фенантролином и ЭДТА, которые являются ингибиторами металлопротеаз. Оптимум протеолитической активности протеазы при использовании в качесве субстрата актина находится в области рН 7,0—7,8. Кроме актина, из нескольких десятков проанализированных белков протеаза ЕСР32 расщепляет лишь гистоны и бактериальный "гистоноподобный" белок HU, что свидетельствует о высокой субстратной специфичности фермента (Matveyev et al., 1996).
При расщеплении актина протеазой ЕСР32 образуется два фрагмента, подвижность которых в DsNa-ПААГ соответствует 36 кДа и 8 кДа (рис. 3) (Khaitlina et al., 1991). N-концевая последовательность большого фрагмента была определена как Вал—Мет—Вал—Тли—Мет, что в известной аминокислотной последовательности актина соответствует расщеплению связи Гли42—Вал43 в ДНКазной петле субдомена 2 (рис. 3). Расщепленный протеазой ЕСР32 актин, остается интактным (Khaitlina et al., 1991). Молекулярная масса меньшего (N-концевого) фрагмента, определенная с помощью масс-спектрометрии (4372 кДа), хорошо соответствовала расчетной молекулярной- массе фрагмента актина, содержащего остатки 1—42 (4369 кДа) (Миргородская и др., 1995).
Таким образом, в молекуле актина протеазой ЕСР32 расщепляется только одна пептидная связь, не затрагиваемая другими, коммерчески выпускаемыми протеазами. При этом протеолиз является ограниченным в широком диапазоне соотношений фермент—субстрат (от 1:3000 до 1:25). Фрагменты остаются ассоциированными между собой до тех пор, пока актин содержит прочно связанный катион, Са2+ или Mg2+, мономер сохраняет нативную структуру. Тем не менее, расщепленный актин полностью терял способность к полимеризации, индуцированной КС1, и был не способен удлинять нерасщепленный Ф-актин, добавленный в качестве зародышей полимеризации (Khaitlina et al., 1988, 1991). Пептидная связь, которую ЕСР32 расщепляет в актине, не расщепляется другими протеазами. Однако, как было отмечено выше, многие другие протеазы расщепляют полипептидную цепь актина в пределах той же ДНКазной петли (Mornet and Ue, 1984). Оказалось, что, хотя сайты расщепления актина субтилизином (Мет47—Гли48) и химотрипсином (Мет44—Вал45) удалены от сайта расщепления протеазой ЕСР32 (Гли42—Вал43) всего на несколько аминокислотных остатков, расщепление субтилизином и химотрипсином ухудшает полимеризуемость актина лишь частично, но не ингибирует ее полноостью. Поэтому протеаза ЕСР32 оказалась уникальным инструментом для выявления конформационных изменений в одном из наиболее функционально важных сайтов в молекуле актина (Strzelecka-Golaszewska et al., 1993), а расщепленный протеазой актин стал удобной моделью для изучения механизмов полимеризации актина (Khaitlina el al., 1993; Khaitlina, Hinssen, 1997).
В полимеризации—деполимеризации актина в клетке особенно интересна роль актин-связывающих белков, в частности, способность некоторых из них стабилизировать зародыши полимеризации. Остается неясным, является ли такая стабилизация только результатом сближения мономеров при их взаимодействии с актин-связывающим белком или же, кроме того, этот белок вызывает и конформационные изменения в самих мономерах, способствующие их ассоциации.
Таким образом, очевидно, что для белка с таким высоким потенциалом для аллостерической регуляции, каким является актин, ограниченный протеолиз высокоспецифичной протеазой ЕСР32 стал уникальным и незаменимым инструментом исследования структуры, функций и взаимодействия с другими белками. С его помощью было показано, что даже такая локальная модификация, как расщепление одной пептидной связи в субдомене 2 молекулы актина, является критической для поддержания стабильности полимера и может приводить к потере способности к полимеризации и взаимодействию с актин-связывающими белками. Кроме того, эти модификации могут вызывать изменения в других частях мономера, в том числе, на С-конце молекулы, в свою очередь влияющие на конформацию отдаленных участков субдомена 1. Эти дистанционные структурные перестройки являются результатом коыформационного сопряжения субдоменов 1 и 2, которое может быть основой для аллостерической регуляции актиновой нити.
Являясь прекрасным инструментом для изучения актина in vitro, протеаза ЕСР32, безусловно, представляет еще больший интерес для исследований in vivo, причем здесь очевидны два направления: изучение функционирования актина в составе цитоскелета живой клетки и, с другой стороны, моделирование воздействия на эукариотическую клетку протеазы как фермента бактериальной агрессии, так как не исключена такая природная роль ЕСР32.
Организация генов Sh. flexneri на большой вирулентной плазмиде
Главным образом он кодирует аппарат секреции III типа, иначе говоря, флагелла -подобные структуры, способные доставлять белки Shigella напрямую из цитоплазмы бактериальной клетки в цитоплазматическую мембрану эпителиальной клетки, или напрямую в ее цитоплазму. Чтобы сформировать этот аппарат, собираются, по крайней мере, 5 белков, закодированных птхі-опероном. Этот аппарат секреции условно можно разделить на три основных домена. Первый - цитоплазматическая «луковица», мультидиск, второй - трансмембранный домен, который пронизывает внутреннюю и внешнюю мембрану бактерии, формируя базальную тело-подобную структуру, и наконец, «иголку» размером 60 нм, которая обеспечивает доставку белков эффекторов по каналу размером 2-3 нм.
Этот секреторный аппарат, сходный с аппаратом секреции III типа Salmonella, активируется при контакте с клеточной поверхностью.
Около 20 белков выделяются через этот аппарат секреции в месте контакта бактерии с поверхностью эпителиальной клетки. Пять из них, IpaA-D и IpgD, закодированы в 30-кб PAI участке патогенности. Другие кодируются генами, разбросанными по вирулентной плазмиде. Эти гены обладают низким содержанием GC пар, около 30%. Эти белки не имеют никакого сигнального пептида, но, вероятно, имеют общие черты на N-концах, которые узнаются аппаратом секреции. Некоторые из них связаны в бактериальной цитоплазме со специально предназначенными шаперонами, которые предотвращают их протеолитическое расщепление. Существует две категории белков, которые секретируются аппаратом секреции III типа:
1) ІраВ, ІраС и IpaD - главные белки для начальных этапов секреции. ІраВ и IpaD формируют комплекс, который контролирует поток белков через аппарат секреции III типа. По-видимому, это первый сигнал, вызывающий секрецию в месте контакта бактерий с эукариотическими клетками. Затем ІраВ и ІраС формируют комплекс, который встраивается в мембрану эукариотической клетки с тем, чтобы образовать пору. В эпителиальной клетке эта пора выполняет двойную функцию: она индуцирует ранние события полимеризации актина через С -концевой домен ІраС, а также делает возможным введение некоторых белков в цитоплазму клетки. ІраА и IpgD, также как ІраВ, С и D, конститутивно экспрессируются при 37 С, независимо от активности аппарата секреции III типа; гены, кодирующие их, влияют на развитие места входа.
2) Вторая категория белков включает в себя две подгруппы, белки семейств IpaH, SopB и вторая подгруппа, белки семейств VirA, функции которых до сих пор неизвестны. Транскрипция этих генов индуцируется в процессе активации секреции. Таким образом, аппарат секреции III типа и его белки-мишени считаются основным оружием, используемым Shigella для проникновения в эпителиальные клетки хозяина.
Кроме аппарата секреции III типа и его белков-мишеней вирулентная плазмида кодирует другие важные белки. Среди них SepA, секретируемая сериновая протеаза, чья функция еще не до конца ясна.
Наиболее важным, тем не менее, является IcsA (VirG), который обеспечивает подвижность Shigella, основанную на полимеризации актина, и позволяет ей проникать из одной клетки в другую. Shigella является интересным примером ко-эволюции и обоюдной адаптации генов вирулентности, находящихся на плазмиде и на хромосоме. Помимо основных (центральных) генов большой вирулентной плазмиды, которые строго ответственны за прямое взаимодействие бактерии и многочисленных клеточных популяций, составляющих эпителиальный барьер, хромосомные гены также принимают участие в патогенных процессах. На основе классических рекомбинационных экспериментов было показано, что введение вирулентной плазмиды Sh. flexneri в Е. coli К12 дает полную инвазивность в системах in vitro, а последовательные переносы в процессе конъюгации различных частей хромосомы в конечном счете приводили к полной вирулентности в моделях инфекции in vivo.
Хромосомные гены можно классифицировать в две категории: (ii) гены, регулирующие экспрессию генов вирулентности на плазмиде. Геном, входящим в эту категорию, является virR, ген, кодирующий гистоноподобную молекулу сходную с H-NS, которая контролирует температурно-зависимую экспрессию белков, принадлежащих 1ра и Mxi-Spa локусам (Hueck, 1998). (ii) гены, необходимые для выживания бактерий в кишечном тракте и в инфицированных тканях. Кроме того, было установлено, что в Sh. dysenteriae 1 дизентерийный токсин кодируется локусом на хромосоме.
Следует также отметить недавнюю демонстрацию так называемых «черных дыр» на хромосоме Shigella, отвечающих за делеции в локусах, которые могут ухудшать экспрессию полного инвазивного фенотипа Shigella.
Таким образом, процессы, происходящие при инвазии патогенных бактерий в эукариотические клетки, оказались в центре внимания широкого круга исследователей сравнительно недавно, и в настоящее время это - одно из актуальных и активно развивающихся направлений исследований в области биохимии и биологии клетки. Согласно рассмотренным моделям, для проникновения в эукариотические клетки бактерии используют поверхностные рецепторы клетки и систему передачи сигнала или индуцируют образование выростов, захватывающих бактерию. Известно, что в эти процессы вовлечены малые ГТФазы и белки цитоскелета. Поэтому исследование факторов, участвующих в инвазии бактерий, способствует пониманию механизмов передачи сигнала и роли цитоскелета в этом процессе. Особый интерес представляют также данные о том, что чувствительность клеток к инвазии бактериями коррелирует со степенью их трансформированности (Velge et al., 1994; 1995; Efremova et al., 2001). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что инвазия бактерий может быть физиологическим тестом при изучении факторов, связанных с трансформацией клеток, и фармакологических препаратов, влияющих на трансформацию. Преимуществом использования в этих исследованиях инвазирующих бактерий, синтезирующих актин-специфические протеазы, является непатогенность этих бактерий для человека. Приоритетным является также исследование возможной роли специфического протеолиза актина клетки-хозяина в механизме инвазии бактерий.
Заражение эукариотических клеток бактериями
Для оптимизации очистки рекомбинантного гримелизина на Ni-содержащих аффинных носителях, которые обычно применяют для выделения рекомбинантных белков с гистидиновым тагом, ген гримелизина был также клонирован и экспрессирован с His6 на С-конце белка.
Штамм E.coli К-12 SCG1 дополнительно с вектором, несущим конструкцию рекомбинантного гримелизина, трансформирован репрессорной плазмидой pREP4 (lacl) KanR. Ген lad экспрессирует большее количество репрессора лактозного оперона. Для более стабильного распространения экспрессирующих конструкций, особенно для рекомбинантных белков, которые могут быть токсичными для бактерий, был использован штамм компетентных клеток - E.coli К-12 (M15[pRP4]), т.к. он содержит более сильный репрессор.
Поэтому селекцию клонов проводили по чуствительности к двум антибиотикам ампициллину (необходим для экспресии) и канамицину (необходим для поддержания конструкции репрессора). Кроме того, использовали штамм E.coli К-12 SG13009, который имеет мутацию в локусе генов lon/sulA/sulB, благодря этому значительно снижена деградация белка. Штамм также трансформирован плазмидой экспрессионного контроля pREP4. Таким образом, ген гримелизина был клонирован и экспрессирован в следующих системах; вектор pQTEV2, pQE16 и pET23b (см. рис. 21)
В данной системе был клонирован только полноразмерный ген гримелизина. В результате индукции экспрессии рекомбинантного белка IPTG (0,25 мМ) наблюдали появление фрагмента с молекулярной массой 37 кДа (рис. 20). Эффективность экспрессии была ниже, чем в предыдущей системе, что может быть связано с не оптимальными условиями для индукции или с тем, что необходима другая линия компетентных клеток для экспрессии. Присутствие необходимых фрагментов гена гримелизина в рекомбинантных плазмидах подтверждали секвенированием.
Далее было проверено, гидролизуют ли рекомбинантные бактерии актин. Рекомбинантный фермент может секретироваться из клеток. Поэтому методом ограниченного протеолиза параллельно анализировали супернатанты (рис. 22, блок а-б), в данном случае культуральную жидкость после осаждения бактерий, и бактериальные лизаты (рис. 22, блок А-Б) из 2 клонов, несущих последовательность пропептида, из штаммов S. grimesii А2 и S. grimesii 30063. Также анализировали лизаты (рис. 22, блок В-в) и супернатанты (рис. 22, блок Г-г) из одного клона, экспрессирующего фермент без пропептида, для штаммов S. grimesii А2 и S. grimesii 30063. Лизаты рекомбинантных бактерий (полноразмерный гримелизин) гидролизовали актин с образованием фрагмента размером 36 кДа, актин не подвергался дальнейшей деградации, аналогично тому, как было показано для протеазы ЕСР 32 (Khaitlina et al., 1991).
Как видно из рис. 22, клонированный фрагмент без N-концевого пропептида не способен к гидролизу актина, что указывает на то, что пропептид необходим для правильного фолдинга белка. Рис. 22 показывает также, что супернатанты после осаждения бактерий, экспрессирующих полноразмерный гримелизин, ограниченно расщепляют актин. Возможно, это связано с секрецией белка. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком с His6 на С-конце
Аналогично тому, как это было в описанных выше экспериментах, мы проверили, способен ли лизат бактерий, синтерирующих рекомбинантный гримелизин с His 6-С конце, ограниченно расщеплять актин.
Ограниченный протеолиз актина рекомбинантным гримелизином, с последовательностью His6 на С-конце. Протеолиз лизатом полноразмерного гримелизина (E.coli К-12 SCG1 вектор pQE16) из S. grimesii А2 (1), и S.grimesii 30063 (2). Протеолиз лизатом полноразмерного гримелизина {E.coli К-12 SCG1 вектор рЕТ23Ь) из S. grimesii А2 (3), и S.grimesii 30063 (4). Дорожка 5 показывает протеолиз лизатом бактерий, экспрессирующих регуляторную последовательность вектора pQE16 без вставки гена. Дорожка 6 показывает протеолиз лизатом бактерий, экспрессирующих регуляторную последовательность вектора рЕТ23Ь без вставки гена. Актин 0,5 мг/мл, время протеолиза 2 ч.
Как показано на рис. 23, лизаты рекомбинантного гримелизина с His6-C концом ограниченно расщепляли актин с образованием фрагмента 36 кДа.
Очищенная протеаза ЕСР32 не ингибировалась ингибиторами сериновых и аспарагиновых протеаз, но ингибировалась хелаторами, ингибиторами металлопротеаз, о-фенантролином и ЕДТА (Matveyev et al., 1991). Поэтому мы проверили ингибирование рекомбинантного фермента теми же агентами. В результате было установлено, что данная протеолитическая активность аналогично ингибируется о-фенантролином и ЕДТА (рис. 24), PMSF не ингибировал протеолитическую активность (не показано).
