Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов Чайка Олег Вадимович

Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов
<
Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Чайка Олег Вадимович. Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов : ил РГБ ОД 61:85-3/1691

Содержание к диссертации

Принятые сокращения 3

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1. Геном аденовирусов и его экспрессия 7

  1. Строение генома аденовирусов ?

  2. Экспрессия генома аденовирусов Ю

  1. Ранняя фаза инфекционного цикла Ю

  2. Поздняя фаза инфекционного цикла ^

1.1.3. Информационные РНК (мРНК) аденовирусов. . 19

1.2. Структурные белки аденовирусов 31

  1. Физико-химические свойства 31

  2. Иммунологические свойства 36

1.3. Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных системах 39

  1. Особенности мРНК эукариот 39

  2. Системы бесклеточной трансляции 43

  3. Бесклеточная трансляция мРНК аденовирусов 48

  4. Трансляция мРНК аденовирусов в системах 51 in 7ҐІ7ГО

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54

  1. Материалы 54

  2. Методы исследования 56

  1. Получение бесклеточной системы из лизата ретикулоцитов 56

  2. Выделение РНК вируса табачной мозаики . . 57

  3. Выделение поздних мРНК аденовирусов ... 58

  4. Выделение поли(А)-содерясащей фракции мРНК 59

  5. Выделение глобиновой мРНК ... 60

  6. Получение С и S-меченых in nw белков аденовирусов 60

  1. Трансляция РНК в бесклеточной системе . . 61

  2. Обработка проб после трансляции 62

  3. Диск-электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.2.10. Авторадиография 64

2.2.П. Очистка антигексоновых антител с помощью

иммуноаффинной хроматографии 64

2.2.12. Удаление примеси антител против гексона

из препарата антиотростковой сыворотки. . 65

  1. Радиоиммунопреципитационный анализ. ... 65

  2. Олигопептидный анализ гексонов аденовирусов бб

  3. Электрофорез мРНК в полиакриламидном геле 67 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 69

3.1. Выделение поздних мРНК аденовирусов и их физико-
химическая характеристика 69

  1. Получение препаратов РНК из клеток, зараженных аденовирусами ........... 69

  2. Электронно-микроскопический и электрофоре-тический анализ мРНК 73

3.2. Бесклеточная трансляция мРНК аденовирусов ... 78

  1. Оптимизация бесклеточной системы из рети-кулоцитов 78

  2. трансляционная активность мРНК SA7 и AdI 85

3.3. Характеристика продуктов трансляции бесклеточ
ной системы из ретикулоцитов 89

  1. Электрофоретический анализ продуктов трансляции 89

  2. Олигопептидное картирование гексонов аденовирусов SA7 и AdI 97

  3. Идентификация продуктов трансляции методом тп_ радиоиммунопреципитационного анализа . . . IUd

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 109

ВЫВОДЫ 122

ЛИТЕРАТУРА . ..... 123

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - информационная (матричная) РНК

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

HEPES - (2-оксиэтил) пиперазин-^'-2-этансульфоновая кислота

РРО - 2,5-дифенилоксазол

ЭГТА - этиленгликоль бис- /У,-//-тетраацетат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ВТМ - вирус табачной мозаики

Мол.масса - молекулярная масса

ПААГ - полиакриламидный гель

Д,кД,мД - дальтон, килодальтон, мегадальтон

Трис - трис-(оксиметил)-аминометан

Н.п. - нуклеотидные пары

дЦМФ - дезоксицитидин монофосфорная кислота

ДСБ - ДНК - связывающий белок аденовирусов

ТБ - терминальный белок аденовирусов

ТХУ - трихлоруксусная кислота.

- Ц. -

Введение к работе

Среди значительного многообразия ДНК-содержащих вирусов особый интерес представляют аденовирусы. Это связано в первую очередь с широким спектром заболеваний, вызываемых аденовирусами не только у человека, но и у ряда сельскохозяйственных животных и птиц. Кроме того, геном аденовирусов обладает онкоген-ными и трансформирующими свойствами, что имеет большое значение для исследования процессов превращения нормальной клерки в опухолевую на молекулярном уровне. Аденовирусы являются также удобной экспериментальной моделью для выяснения механизмов экспрессии и репликации эукариотических геномов. Особенно важным в этом смысле представляется изучение продуктов экспрессии аденовирусного генома на разных стадиях инфекционного цикла.

Наибольший интерес из вирус-специфических продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов представляют главные капсидные белки аденовирусов гексон и отросток. Именно эти белковые компоненты, по-видимому, наиболее важны с точки зрения получения про-тивоаденовирусных вакцин и диагностикумов ввиду того, что не только индуцируют образование вирус-нейтрализующих антител, но и являются основными структурными белками аденовирусов, составляя в сумме более 60% массы белков аденовириона.

Разработка генно-иняенерных подходов к биотехнологии вакци-/Онных и диагностических препаратов открывает перспективу дешевого микробиологического синтеза безопасных и эффективных вакцин и диагностикумов в виде индивидуальных капсидных белков. Однако для этого требуется выяснить, обладают ли такие структурные полипептиды аденовирусов, как гексон и отросток, антигенной и им-муногенной активностью при условии их синтеза в рекомбинантных микроорганизмах. Одним из подходов к решению этой проблемы является изучение особенностей структуры и антигенной активности гексона и отростка в условиях, приближенных к микробиологическому синтезу. Поэтому синтезированные в бесклеточных системах полипептиды гексона и отростка могут являться вполне адекватными объектами для такого исследования.

Целью настоящей работы явилась идентификация продуктов бесклеточной трансляции поздних мРНК аденовирусов обезьян SA7 и человека Adl, а также сравнение их по физико-химическим и иммунологическим характеристикам с соответствующими капсидными белками аденовирусов.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1) выделить и охарактеризовать биологически активные пре параты мРНК аденовирусов обезьян SA7 и человека Adl на поздней стадии инфекционного цикла;

2) провести в бесклеточной системе из ретикулоцитов кроли- у ка трансляцию поздних мРНК SA7 и Adl с полным и эффективным син тезом аденовирусных полипептидов;

3) провести сравнительный анализ структуры и антигенной активности полипептидов гексона аденовирусов, синтезированных in vivo и in vitro , а также полипептидов отростка, синтезированных in vivo и in Уі'ІґО .

В работе впервые проведен электронномикроскопический и электрофоретический анализ гетерогенной популяции молекул РНК аденовируса обезьян .SA7. Впервые показано наличие низкомолекулярных вирус-ассоциированных РНК у аденовируса обезьян А7.

Впервые проведен сравнительный анализ первичной структуры гексонов аденовируса обезьян 5А7 и аденовируса человека Adl, синтезированных in vivo и in vitro , что позволило подтвердить - б - адекватность синтезированного in vitro гексона нативному гексону.

Впервые прямо показано, что в бесклеточной системе из ре-тикулоцитов кролика гексон аденовирусов синтезируется в форме полностью завершенных мономеров, не обладающих антигенной активностью нативного гексона. Показано наличие антигенной активности у полипептида отростка 5А7, синтезированного в бесклеточной системе из ретикулоцитов.

Работа в общем носит теоретический характер, однако представленные в ней результаты могут быть использованы при разработке подходов к получению противоаденовирусных вакцин и диаг-ностикумов.

В результате проведения настоящего исследования на защиту выносятся следующие положения:

При трансляции в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика поли(А)-содержащих поздних мРНК аденовирусов человека Adl и обезьян Ш происходит синтез полноразмерных полипептидов гексона и отростка.

Проведенный в данной работе сравнительный анализ структуры и антигенной активности полипептидов гексонов SA7 и Adl, синтезированных In vivo и in vitro позволяет доказать идентичность размеров и первичной структуры гексоновых полипептидов А7, а также гексоновых полипептидов Adl. Синтезированный in vitro / полипептид гексона не обладает антигенной активностью нативного гексона и не способен к формированию тримеров.

3. Полипептид отростка SA7, синтезированный in vitro иден тичен по размеру, первичной структуре и антигенной активности отростку 5А7, синтезированному in Vivo . - ч -

Похожие диссертации на Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов