Содержание к диссертации
Стр.
Список условных сокращений 4-5
Введение 6-26
ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ПРИ
НЕОПЛАЗИИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
(обзор литературы) 27-66
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 67-80
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ....81-124
Клинические признаки у больных раком предстательной железы и у больных с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и их связь с ПСА 81-91
Сравнительное содержание VEGF в сыворотке крови больных раком и доброкачественной гиперплазией
предстательной железы 92-98
Концентрация IGFBP1 в сыворотке крови больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы 99-105
Концентрация IGFBP3 в сыворотке крови больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы 106-111
Концентрация IGF1 в сыворотке крови больных новообразованиями предстательной железы и его связь с
основными клиническими признаками болезни 112-115
3.6. Концентрация IGF2 в сыворотке крови больных новообразованиями
предстательной железы и его связь с
клиническими признаками болезни 116-119
3.7. Связь разных показателей в сыворотке крови больных раком
и доброкачественной гиперплазией предстательной железы 120-121
3.8. Использование изученных показателей в диагностике рака
предстательной железы 122-124
ГЛАВА 4. КОНЦЕНТРАЦИЯ ОСНОВНЫХ АНДРОГЕНОВ В
СЫВОРОТКЕ КРОВИ И АКТИВНОСТЬ 17р-
ГИДРОКСИСТЕРОИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ В БИОПТАТАХ ОПУХОЛЕЙ
У БОЛЬНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ 125-130
ГЛАВА 5. МАРКЕРЫ РЕЗОРБЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ В МОЧЕ БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ 131-139
ГЛАВА 6. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В
ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ 140-149
ГЛАВА 7. КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ
ПОКАЗАТЕЛИ В ОЦЕНКЕ ПРОГНОЗА РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ 150-158
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРОВЕДЕННОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ 159-171
Выводы 172-173
Практические рекомендации 174-174
Список, цитируемой литературы 175-208
Список условных сокращений
17Р - ГСР - 17р~гидроксистероидредуктаза
Дпид - дезоксипиридинолин
ДГПЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы
ЖХВР - жидкостная хроматография высокого разрешения
ИГХ - иммуногистохимический метод
ИЛ-6 - интерлейкин-6
ИФА - иммуноферментный анализ
КФНТ - кислая фосфатаза, неингибируемая тартратом
Пид - пиридинолин
ПКФ - простатическая кислая фосфатаза
ПСА - простатический специфический антиген
ПРИ - пальцевое ректальное исследование
РА - рецепторы андрогенов
РИА - радиоиммунный анализ
РПЖ - рак предстательной железы
РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста
УЗИ - ультразвуковое исследование
ТРУЗИ - трансректальное ультразвуковое исследование
ТУР - трансуретральная резекция
ЩФ - щелочная фосфатаза
ФРЭС - фактор роста эндотелия сосудов
VEGF - фактор роста эндотелия сосудов
RVEGF - рецептор фактора роста эндотелия сосудов
ПИН П - простатическая интраэпителиальная неоплазия II типа
aFGF - кислый фактор роста фибробластов
bFGF - основной фактор роста фибробластов
EGF - эпидермальный фактор роста
IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста I типа
IGF-2 - инсулиноподобный фактор роста II типа
IGFBP13 - белки 1 и 3 типа, связывающие инсулиноподобные факторы роста
HER-2/neu - рецептор эпидермального фактора роста HER-2/neu (с-егЬ2) Ki-67 - антиген пролиферативной активности
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема рака предстательной железы (РПЖ) в настоящее время считается одной из наиболее актуальных, так как среди злокачественных новообразований мочеполовых органов этот вид опухоли выявляется наиболее часто (В.А.Соловов, 2006). В структуре онкоурологических заболеваний в России РПЖ составляет 36% (В.Н.Шолохов, 1999). По данным отечественных и зарубежных авторов РПЖ занимает второе место с постоянной тенденцией к росту в последнее десятилетие (М.П.Гойхберг и соавт., 1984; Н.Е.Кушлинский и соавт., 2003; М.И.Давыдов и соавт., 2006), уступая первое место меланоме. Так, за период с 1990 по 1995 гг. прирост заболеваемости РПЖ составил 32,3% (В.В.Двойрин и соавт., 1996). За период с 1985 по 1995 гг. прирост смертности от РПЖ составил 29,8% (Е.М.Аксель и соавт., 1996). В целом по России 5-летняя выживаемость среди взятых на учет больных РПЖ составляет около 25%. Статистические данные также показывают, что ежедневно регистрируется в России 25-30 новых случаев РПЖ, а умирает 14-17 пациентов (Е.М.Аксель и соавт., 2002). Высокие показатели летальности при РПЖ обусловлены длительным скрытым и бессимптомным развитием опухолевого процесса, при этом уже при первичном обращении от 60 до 80% больных имеют отдаленные метастазы (Б.В.Бухаркин, 1999; А.М.Гарин, 2005). Кроме того, по данным ряда авторов уже через 18-25 месяцев после начала антиандрогенной терапии у большинства больных развивается гормонорезистентность опухоли и, как следствие, прогрессирование ее роста и метастазирование, что и объясняет весьма низкую выживаемость данного контингента больных (А.В.Важенин и соавт., 2006). Это заболевание является ведущей причиной смерти от злокачественных опухолей у мужчин. Следовательно, повышенный интерес отечественных и зарубежных исследователей к проблеме РПЖ объясняется неуклонным ростом заболеваемости и смертности, а также трудностями своевременной
диагностики этого заболевания (Н.А.Лопаткин, 1999; Л.М.Гориловский и соавт., 1999).
Этиология РПЖ не известна, патогенетические механизмы активно исследуются и направлены на изучение «биологического» поведения опухоли с использованием современных молекулярно-биологических маркеров в оценке ранней диагностики болезни, инвазивнои и метастатической активности опухоли. Все это позволит выявить новые факторы прогноза и маркеры неблагоприятного течения заболевания, оценить чувствительность опухоли к гормональным и химиотерапевтическим препаратам.
Благодаря успехам биохимии и молекулярной биологии, в настоящее время в арсенале исследователей и клиницистов имеется огромное количество биологически значимых показателей, которые могут помочь в прогнозе раннего рака предстательной железы и выборе адъювантной терапии при распространенном процессе. Задачей исследователей, работающих в данной области, является определение того набора наиболее значимых, дополняющих друг друга показателей, который позволил бы при минимально возможной стоимости обследования обеспечить максимальную эффективность лечения каждого больного (Н.С.Сергеева, 2006). Спектр исследований в каждом конкретном случае может зависеть от стадии заболевания, возраста больного, планируемой терапии и материально-технической базы учреждения.
Следует отметить, что для некоторых молекулярных маркеров конкретная биологическая функция пока не установлена. Практически ни один из молекулярных маркеров в их традиционном понимании не может быть использован для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований предстательной железы. Их основная роль заключается в том, чтобы помочь в оценке прогнозировании исхода заболевания и в индивидуализации лекарственной терапии. При этом, количество показателей, рассматривающихся в качестве потенциальных
молекулярных маркеров, увеличивается лавинообразно, отражая достижения и находки в области изучения механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки опухолевых клеток. В их число входят онкогены и протоонкогены, онкобелки, различные факторы роста и их рецепторы (в большинстве случаев также являющиеся продуктами онкогенов), рецепторы стероидных и пептидных гормонов, супрессорные гены и продукты их экспрессии, гормонозависимые белки, протеазы, участвующие в процессах метастазирования, интегрины, отвечающие за межклеточные контакты, активаторы ангиогенеза (Н.С.Сергеева, 2006).
Определение любого молекулярного маркера при раке предстательной железы может, в принципе, иметь два практических результата: либо выявление группы риска, требующей дополнительного лечения или более тщательного наблюдения, среди больных ранними стадиями, не подлежащих адъювантной терапии по другим клиническим и лабораторным показаниям, либо оценка чувствительности к определенным видам терапии и индивидуализация схем адъювантного лечения больных с распространенным процессом (Н.С.Сергеева, 2006).
Еще одним аспектом практического использования результатов изучения молекулярно-биологических характеристик опухолей предстательной железы может быть разработка новых препаратов, направленно воздействующих на эти молекулы и блокирующих, регулируемые ими процессы. Этот подход особенно актуален тогда, когда исследуемый маркер имеет непосредственное отношение к регуляции пролиферации и/или дифференцировки клеток или их метастатической активности.
Одними из наиболее важных направлений в этих исследованиях при раке предстательной железы считаются метаболизм андрогенов в опухоли и ее чувствительность к андрогенам (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2005). В настоящее время имеются все основания полагать, что гормональное действие андрогенов в большинстве тканей-мишеней осуществляется не
столько теми андрогенами, которые поступают в них из крови, сколько за счет образования активных метаболитов в самих тканях, в первую очередь андрогена-эффектора (В.Г.Дегтярь, 1992; В.Г.Дегтярь и соавт., 1998; В.Г.Дегтярь и соавт., 20006; Shaw G. et al., 2000). Следовательно, из крови в ткань поступают неактивные андрогены-предшественники, источником которых являются стероидогенные ткани — половые железы и надпочечники, и качественный и количественный состав андрогенов в ткани-мишени зависит не только от секреции их половыми железами и надпочечниками, но и от активности ферментов метаболизма андрогенов в этой ткани, что и обусловливает содержание каждого отдельного андрогена в клетке-мишени (В.Г.Дегтярь, 1992). Для метаболизма андрогенов и для механизма их действия чрезвычайно важно превращение Т в ДГТ при участии 5ос-Р, поэтому иногда этот фермент называют «ключевым» ферментом метаболизма андрогенов (В.Г.Дегтярь и соавт., 2000а; Bruchovsky N., 1997). Важную роль во многих случаях играет фермент 17(3-ГСР, в первую очередь во взаимном превращении Т и А4, Е1 и Е2, ДЭА и А5-ЗР-Д, при биосинтезе андрогенов и эстрогенов как в половых железах, так и в периферических тканях (Labrie F. et al., 1994; Bonney R.C. et al., 1996; Penning T.M., 1997; El-Alfy M. et al., 1999;). Этот фермент проявляет преимущественно редуктазную активность, однако при некоторых патологических состояниях в периферических тканях соотношение редуктазной и дегидрогеназной активностей 17р-ГСР может значительно изменяться, как это показано, по данным предварительных исследований для предстательной железы у пожилых мужчин, что, безусловно, может иметь важное значение при канцерогенезе (Labrie F. et al., 1994; Hakimi J.M. et al., 1997; El-Alfy M. et al., 1999).
В настоящее время большое внимание уделяется проблеме неоангиогенеза в злокачественных опухолях, так как уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов, обеспечивающих снабжение
клеток кислородом и питательными веществами. Интерес к этой проблеме возник более 30 лет назад, однако до относительно недавнего времени основной характеристикой активности неоангиогенеза в опухолях являлась микроскопическая оценка плотности сосудов в опухолевой ткани (микрососудистой плотности). И только относительно недавно, в результате изучения молекулярных механизмов ангиогенеза, интенсивно развивавшегося в последние 5-10 лет, было продемонстрировано наличие целого ряда регуляторных ангиогенных и антиангиогенных факторов, динамический баланс которых и обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли.
В регуляции ангиогенеза тем или иным образом участвуют многие известные факторы роста и цитокины, такие как основные и кислые факторы роста фибробластов (оФРФ и кФРФ), эпидермальный фактор роста (ЭФР), а-и р-трансформирующие факторы роста (ТФР), тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток/тимидинфосфорилаза, фактор некроза опухолей, интерлейкины и др. Однако, наиболее важным положительным регулятором ангиогенеза бесспорно является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), называемый также фактором проницаемости сосудов. Уникальность этого фактора заключается в том, что, в отличие от всех других факторов роста, он митогенен только по отношению к эндотелиальным клеткам.
Основными растворимыми формами VEGF являются молекулы размером 121 и 165 аминокислотных остатков, они же являются и основными биологически активными формами VEGF.
На поверхности эндотелиальных клеток имеется три рецептора для VEGF, являющихся типичными рецепторными тирозинкиназами. Все рецепторы представляют собой трансмембранные гликопротеиды с мол. массой 170-235 кЕ>а и для эффективного связывания VEGF с рецепторами необходимо его взаимодействие с гепарино-подобными компонентами внеклеточного матрикса. Показано (Speirs V. et al., 1999), что как опухолевые, так и стромальные клетки, выделенные из первичных карцином
различного гистогенеза, продуцируют VEGF in vitro, и уровень его продукции значительно выше, чем у соответствующих клеток, выделенных из нормальной ткани соответствующего органа. Кроме того, показана тесная связь между активностью процессов неоангиогенеза в первичной опухоли и ее склонностью к инвазивному росту и метастазированию (Ferrara N., 1997; Muzzucchelli R., 2000).
Несмотря на то, что простатический специфический антиген (ПСА) в настоящее время считается общепризнанным опухолевым маркером, и широко используется в диагностике и мониторинге рака предстательной железы (РПЖ) (Л.М.Гориловский, 1999; Н.А.Лопаткин, 1999), фактором, ограничивающим использование ПСА в ранней диагностике и скрининге РПЖ, является его низкая специфичность и обусловлена повышением концентрации маркера в сыворотке крови при не опухолевых заболеваниях ПЖ, а также у здоровых мужчин в пожилом возрасте. Изучение механизмов канцерогенеза ПЖ за последнее десятилетие привело к открытию ряда биологически активных веществ, которые играют важную роль в этих процессах. Так, одними из мощных промоторов роста раковых клеток считаются инсулиноподобные факторы роста I и II типов (ИФР-І, ИФР-И), которые непосредственно стимулируют процессы репликации и дифференцировки опухольтрансформированных клеток.
Показано, что в неопластический процесс при РПЖ может быть вовлечен ИФР-І, и это происходит под влиянием локального воздействия гормонов, в частности, андрогенов. В литературе обсуждается возможность индукции роста злокачественных опухолей, в том числе и РПЖ, под действием ИФР-І и ИФР-ІІ, мощных аутокринно-паракринных регуляторов роста и дифференцировки клеток при взаимодействии с другими биологически активными веществами. Кроме того, в литературе появились первые сообщения о том, что ИФР наряду с ПСА могут быть использованы в дифференциальной диагностике РПЖ и ДГПЖ.
Стало известно, что систему ИФР составляют лиганды, связывающие их белки и рецепторы (Jose F. Сага, 1994). Лиганды, ИФР-І и ИФР-И, - это пептиды, присутствующие в сыворотке крови и в тканях и вместе с инсулином представляющие группу сывороточных белков со сходной структурой и функциями. Указанные белки состоят из "А" и "В" цепей, связанных дисульфидными мостиками, на 50% гомологичны по структуре, однако каждый имеет свои особенности. ИФР-І и ИФР-П имеют соединяющий, или "С" пептидный сегмент, состоящий из 12 и 8 аминокислотных остатков, соответственно, который связывает обе цепи и "D" сегмент, продолжающий "А" цепь на 8 и 6 аминокислотных остатков, соответственно. Кроме того, известно, что существует 2 формы ИФР-П: с большим и меньшим молекулярным весом, причем первая форма продуцируется опухолями, а вторая обнаружена в сыворотке крови здоровых людей (Daughaday W.H. et al., 1988). Наличие общего в первичной структуре у ИФР и инсулина позволило высказать предположение и о сходстве их пространственного строения (Blundell T.L. et al., 1980).
ИФР циркулируют в организме в комплексе с высокоспецифичными ИФР связывающими белками (ИФРСБ), выполняющими важные биологические функции (Lamson G. et al., 1991; Rechler M.M. et al., 1992). В настоящее время известно 10 ИФРСБ, по мере открытия им присваивались соответствующие номера от ИФРСБ-1 до ИФРСБ-10, и доказано, что они присутствуют в тканях и в плазме крови и обладают подобными структурными и функциональными характеристиками (Rechler M.M. et al., 1992). ИФРСБ специфически связывают ИФР-І и ИФР-И, проявляя при этом высокую аффинность, и не связывают инсулин и проинсулин. У ИФРСБ-2, -5 и -6 определена большая связывающая способность к ИФР-П, а ИФРСБ-1 ,-3 и -4 проявляют одинаковое сродство, как к ИФР-1, так и к ИФР-П. Все десять белков в различной степени снижают биологические эффекты ИФР. Поэтому ИФРСБ скорее следует рассматривать как модуляторы физиологической функции ИФР-1. ИФРСБ-1 - это негликозилированный протеин, Mr 25000,
который впервые выделили из децидуальной оболочки эндометрия и амниотической жидкости (Jose F. Сага, 1994). У человека ген ИФРСБ-1 связан с 7-й хромосомой и экспрессируется клетками децидуальной оболочки эндометрия, печени и грануляционной ткани яичников. Экспрессия гена и уровни указанного белка регулируются, в первую очередь, инсулином; отмечено увеличение экспрессии ИФРСБ-1 при дефиците инсулина у нелеченых больных сахарным диабетом и недостатке гормона роста, и резкую супрессию синтеза ИФРСБ-1 после инсулинотерапии. Детальное изучение структуры этого белка показало наличие в нем участка, состоящего из трех последовательно расположенных аминокислот Арг-Гли-Асп, которые принимают участие в связывании ИФРСБ-1 с белками клетки-мишени и помогают выполнению их биологической роли. Что касается функции, то доказано, что ИФРСБ-1 способен, в определенных условиях, как снижать, так и повышать активность обоих ИФР.
ИФРСБ-3 - основной циркулирующий в сыворотке крови белок этой группы, связывающий более 90% ИФР. У человека ген ИФРСБ-3 локализован в хромосоме 7, вблизи гена ИФРСБ-1. Его экспрессия отмечена в печени и во многих других тканях, в том числе и в почках, желудке, сердце, яичниках и яичках. В сыворотке крови ИФРСБ-3 находится в комплексе с зависящей от гормона роста кислотолабильной субъединицей, Mr 150000. Уровни этого ИФР связывающего комплекса зависят от гормона роста и отражают уровни ИФР-І в плазме крови; низкие показатели наблюдали у детей и при недостаточности гормона роста, а высокие - при введении гормона роста или ИФР-І. Относительно влияния указанного ИФРСБ на активность ИФР следует сказать, что описаны примеры как активирующего, так и подавляющего воздействия (Rechler М.М. et al., 1992; Jose F. Сага, 1994). При дальнейшем изучении ИФРСБ-3 было установлено, что он сохраняет способность подавлять пролиферацию и рост ткани, даже когда лишен возможности связываться с ИФР. Он ингибировал рост клеточной линии фибробластов, в которых был разрушен рецептор ИФР-І. Таким
образом, ИФРСБ-3 может проявлять свое биологическое действие без участия ИФР-І. Дополнительные исследования показали связывание ИФРСБ-3 с поверхностными мембранами клеток, которое коррелировало с вызываемым им подавлением роста и пролиферации, и оба эти эффекта ингибировались ИФР-І. ИФРСБ-3 стимулировал также апоптоз и проявлял способность проникать в ядро. Известный ингибитор роста — онкосупрессор р53 стимулировал продукцию ИФРСБ-3 (Ю.А.Панков, 1999). Выше изложенные данные позволяют предположить, что для осуществления своей функции ИФРСБ-3 должен предварительно связаться со специфическим рецептором на поверхности клеток и, исходя из этого, его можно отнести к группе гормонов-ингибиторов роста и антагонистов ИФР-І.
ИФР осуществляют свои функции путем связывания со специфическими рецепторами, имеющимися на поверхности клеток. В настоящее время описано два вида ИФР рецепторов, I тип - рецепторы ИФР-І и II тип - рецепторы ИФР-И/манозо-6-фосфата (Rechler М.М. et al., 1985). Оба типа рецепторов клонированы и определена их первичная структура. Связывание гормонов с описанными рецепторами приводит к активации процессов митоза и, подобно инсулину, влияет на метаболизм в клетках-мишенях. ИФР-І является мощным промотором роста клеток, непосредственно стимулируя процессы репликации и дифференцировки (Froesch E.R. et al., 1990). Свою биологическую роль он выполняет, как уже было ранее отмечено, взаимодействуя с рецепторами ИФР I типа, однако имеются данные о том, что 1% имеющегося в наличии ИФР-І связывается с рецепторами инсулина. Детальные исследования по изучению физиологической роли ИФР-І показали, что очень незначительное количество последнего циркулирует в сыворотке крови в свободном состоянии. В норме, большая часть, 70-80% ИФР-І, как и ИФР-П, связана с ИФРСБ-3, образуя комплекс 150 Ш, состоящий из субъединицы связывающего белка -З (СБ-3), кислотолабильной субъединицы и одной молекулы ИФР (Е.Г.Зезеров, 1999). Эта довольно большая молекулярная
форма не способна проникать через капиллярный барьер и, поэтому, имеет относительно большой период жизни, около 12-16 часов. Для сравнения укажем, что соединение ИФР с субъединицами СБ-1, СБ-2 или СБ-3, 50 Ш, составляет 20-30% , существует около 20-30 минут и может проникать через капиллярный барьер в ткани (Zapf J. et al., 1990). ИФР в свободной форме составляет всего 2% от общего количества и существует несколько минут (Guler Н.Р. et al., 1989). В литературе обсуждаются вопросы возможной индукции роста злокачественных опухолей, в том числе и рака предстательной железы, под воздействием ИФР-І и ИФР-П, которые являются мощными аутокринно-паракринными регуляторами роста и дифференцировки клеток, а также связь ИФР с показателями безрецидивной выживаемости и прогнозом болезни. В настоящее время ИФР рассматриваются в качестве маркеров опухолей различного гистогенеза, важных в прогностическом плане (Е.С.Герштейн и соавт., 1999), а также, как потенциальная мишень для блокирования передачи митогенного сигнала в клетку. Тем не менее, несмотря на активные экспериментальные и клинические исследования, однозначного понимания роли ИФР-подобных пептидов и их рецепторов при различных злокачественных опухолях человека и, в частности, при раке предстательной железы до сих пор нет.
Среди злокачественных новообразований, которые метастазируют в кости, рак предстательной железы занимает первое место. По данным C.S.Galasko (1986) 54-85% больных раком предстательной железы имеют метастазы в кости. Метастазы рака предстательной железы чаще всего поражают кости таза, пояснично-крестцовый отдел позвоночника. Такая локализация сопровождается выраженным болевым синдромом, приводит к опасным для жизни осложнениям и в конечном итоге к гибели больных.
Относительно высокая выживаемость этих больных (по данным R.Coleman (1994) медиана составила 24 месяца), а также появление новых эффективных подходов к лечению метастазов в кости делает весьма актуальной проблему своевременной их диагностики. Используемые для
этого в клинической практике рентгенологические и радиоизотопные методы исследования скелета обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью (М.А.Чибисова, 1993; Tubiana-Hulin М., 1991), что затрудняет раннюю диагностику метастазов в кости, правильное планирование терапии, а также наблюдение за течением процесса и оценку эффективности проводимого лечения.
Все выше перечисленное, делает актуальным поиск более чувствительных методов оценки состояния скелета у больных раком предстательной железы.
В последние несколько лет в связи с интенсивными исследованиями молекулярных механизмов костного метастазирования, а также появлением новых подходов к профилактике метастазов в кости, стала очевидной необходимость поиска чувствительных и специфичных маркеров, позволяющих проводить своевременную диагностику и мониторинг поражения скелета у больных раком предстательной железы.
По данным литературы, межмолекулярные пиридиновые связи коллагена, пиридинолин и дезоксипиридинолин, экскретирующиеся с мочой в составе коллагеновых фрагментов при деструкции костного матрикса, являются объективными критериями интенсивности костной резорбции при заболеваниях скелета метаболического характера (Robins S.P. et al., 1995; Seibel MJ. et al., 1992).
Сведения литературы, касающиеся изучения пиридиновых связей коллагена как критериев резорбции костной ткани при метастатическом поражении скелета, немногочисленны и выполнены на небольших группах онкологических больных (Coleman R.E. et al., 1992). Практически отсутствуют данные о значении и возможности клинического использования этих показателей в диагностике и мониторинге поражения скелета у больных раком предстательной железы.
Другим наиболее экспериментально и клинически изученным биохимическим маркером костного метастазирования является активность
щелочной фосфатазы и, прежде всего, ее костного изофермента (Withold W. et al., 1996; Woitge H.W. et al., 1996). Несмотря на общее признание этого фермента как рутинного теста, до настоящего времени не существует единого мнения о специфичности и взаимосвязи изменений щелочной фосфатазы с другими биохимическими и клиническими критериями метастатического поражения скелета при раке предстательной железы.
Определенный прорыв в области практического использования маркеров, связанных с РЭФР-зависимой регуляцией роста рака произошел после появления препарата Герцептин, представляющего собой гуманизированные антитела к HER2/neu - одному из рецепторов семейства ErbB, к которому принадлежит и РЭФР (Foekens J.A. et al., 1989; Coradini D. etal.,2001).
Семейство тирозинкиназных рецепторов - продуктов онкогенов группы с-erbB, в которое входят четыре сходных по структуре трансмембранных рецептора - РЭФР (ErbB-1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3 (HER3) и ErbB-4 (HER4), - это одна из важнейших регуляторных систем передачи митогенного сигнала (Brown L.F. et al., 1999; Duffy M.J., 2001).
Помимо структуры, рецепторы семейства ErbB отличаются между собой по относительной специфичности и сродству к различным общим лигандам. Основной особенностью всех рецепторных тирозинкиназ является трансмембранная локализация и необходимость во взаимодействии с соответствующим лигандом (активирующим фактором) для реализации киназной активности и последующих биологических эффектов. После активации в результате связывания лигандов и димеризации внутренняя тирозинкиназа рецепторов активируется и приобретает способность фосфорилировать как сам рецептор, так и другие клеточные белки, участвующие в передаче митогенного сигнала. Рецепторы семейства ErbB могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры, при этом во многих случаях наиболее активными являются гетероструктуры с участием рецептора HER2/neu, не имеющего собственного лиганда.
Таким образом, HER2/neu - это уникальный представитель рассматриваемого семейства трансмембранных тирозинкиназ, так как, не имея собственного лиганда и не взаимодействуя ни с одним из известных факторов роста, активирующих родственные рецепторы, он является, тем не менее, ключевым звеном передачи митогенных сигналов всех ЭФР-подобных пептидов и необходим для успешного функционирования всей системы (Duffy M.J., 2001).
Блокирование HER2/neu может существенно замедлить или остановить рост опухолей, зависимых от подобных стимулов, однако эффективное использование биологически активных препаратов предусматривает предварительную оценку индивидуальной чувствительности больных к данному виду лечения. В случае Герцептина общепринятым и наиболее адекватным методом оценки чувствительности является использование иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания опухолевых тканей на белок HER2/neu (р185) с последующей оценкой амплификации гена с-егЬВ-2 методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) (Foekens J.A. et al., 1991).
Как правило, менее дорогостоящее иммуногистохимическое исследование проводится в качестве предварительного общего скрининга, а FISH-гибридизация используется в спорных случаях, когда ИГХ метод не дает строго положительного или строго отрицательного ответа. Подобный подход уже хорошо зарекомендовал себя в лечении больных раком молочной железы (РМЖ), позволяя обеспечить максимальную эффективность лечения Герцептином, избежав при этом неоправданных затрат. Несмотря на большое число клинических наблюдений больных раком молочной железы, единого мнения о прогностической ценности HER2/neu при РМЖ пока нет (Andreasen P.A. et al., 1990; Coradini D. et al., 2001). Опубликованы данные, свидетельствующие о том, что опухоли с амплифицированным геном HER2/neu слабо реагировали на эндокринную терапию, но были чувствительны к последующей химиотерапии. В настоящее время принято
считать также, что больным с НЕ112/пеи-положительными опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии, чем больным с опухолями, в которых выявлена повышенная экспрессии этого онкогена (Callagy G. et al., 2000). Работ по изучению экспрессии HER2/neu при раке предстательной железы не много и клиническая его значимость неизвестна. Поэтому представляет интерес исследование экспрессии HER2/neu при РПЖ.
Одной из наиболее важных характеристик опухоли является потенциал ее пролиферативной активности (В.Х.Хейфец и соавт., 2004). Стало известным, что пролиферативный антиген Ki-67, тесно связан с биологически агрессивным поведением ряда опухолей, при этом выявлена значительная связь между показателем экспрессии антигена Кі-67 в опухоли и временем прогрессирования заболевания, метастатическим статусом и объемом новообразования, что, вероятно, может иметь клиническое значение при РПЖ.
Успешное исследование выше указанных направлений исследований позволит предложить современные патогенетические методы лечения РПЖ, связанные с неизвестными ранее мишенями противоопухолевой терапии данного заболевания.
Учитывая важность проблемы РПЖ, а также появление современных методологических подходов к оценке «биологического» поведения опухоли, проведение настоящего исследования является крайне актуальным не только для практического здравоохранения, но и для более глубокого понимания роли ряда эндогенных факторов в патогенетических механизмах развития и прогрессирования заболевания.
Цель настоящего исследования - определение клинического значения и возможности использования новых молекулярно-биологических маркеров в диагностике, мониторинге и оценке прогноза рака предстательной железы.
Задачи исследования:
1. Оценить с помощью иммуногистохимического метода исследования
чувствительность злокачественных опухолей предстательной железы к
андрогенам (на основании выявления рецепторов андрогенов в цитозольной
фракции биоптатов новообразований предстательной железы) с учетом
основных клинико-морфологических характеристик заболевания.
2. Провести сравнительное исследование общей редуктазной
активности 17П-ГСР (превращение А4 в Т) и дегидрогеназной активности
17П-ГСР (превращения Т в А4) в растворимой фракции биоптатов
доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы.
3. Проанализировать корреляционные связи между общей редуктазной
и дегидрогеназной активностями 17р-ГСР в растворимой фракции биоптатов
доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы с уровнями
общего тестостерона, 5ос-дигидротестостерона и андростендиона в сыворотке
крови этих больных.
Изучить показатели индекса пролиферативной активности при анализе уровней экспрессии Кі-67 в ядрах клеток рака предстательной железы и сопоставить его с основными клиническими, морфологическими и биохимическими методами исследования. Оценить частоту выявления экспрессии рецептора эпидермального фактора роста - Her-2/neu.
Определить уровень ключевого активатора ангиогенеза - фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). в сыворотке крови больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы и сравнить их с уровнем этого фактора роста у практически здоровых мужчин (группа контроля). Установить связь уровней VEGF в сыворотке крови у больных раком предстательной железы с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, стадией опухолевого процесса, возрастом пациентов, гистологическим строением и степенью дифференцировки новообразования (градация Глисона), прогнозом заболевания.
Провести сравнительное исследование уровней инсулиноподобных факторов роста (IGF1, IGF2), белков сыворотки крови, связывающих инсулиноподобные факторы роста (IGFBP1 и IGFBP3) у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы, а так же проанализировать их взаимосвязь с VEGF и соотношением VEGF/IGF1, VEGF#GF2, с показателями ПСА и соотношением IGFl/ПСА, IGF2/nCA в диагностике и оценке прогноза рака предстательной железы.
Исследовать уровни общего и свободного ПСА, их соотношение в сыворотке крови больных раком предстательной железы и сопоставить эти показатели с уровнем VEGF. Оценить соотношение VEGF/ПСА как возможного маркера в выявлении данного заболевания.
Методом жидкостной хроматографии высокого разрешения оценить экскрецию с мочой маркеров костного ремоделирования (пиридинолина и дезоксипиридинолина) у больных раком предстательной железы с костными метастазами и без метастазов и сравнить их с этими показателями у больных доброкачественной гиперплазией предстательной железы и группой практически здоровых мужчин.
Научная новизна исследования
Впервые в отечественной литературе на достаточном клиническом материале одновременно проведено определение ряда молекулярно-биологических маркеров в сыворотке крови: VEGF, ПСА, IGF1, IGF2, IGFBP1, IGFBP3, щелочная фосфатаза, общий тестостерон, 5а-дигидротестостерон, андростендион; в опухолях: редуктазная и дегидрогеназная активности 17й-ГСД, уровни экспрессии Her-2/neu, рецепторов андрогенов, антигена пролиферативной активности Кі-67; в моче: пиридинолин, дезоксипиридинолин у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы.
Полученные нами впервые сравнительные данные по определению редуктазной активности 17П-ГСД в опухолях предстательной железы
позволяют заключить, что высокая редуктазная активность 17П-ГСД может быть связана с развитием РПЖ.
Определение уровней VEGF, IGF1, IGF2, IGFBP1 в сыворотке крови больных можно использовать в качестве молекулярных маркеров вместе с уровнем общего ПСА при диагностике РПЖ. Кроме того, изучение уровня выше указанных маркеров свидетельствует о возможном использовании этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет с целью более раннего выявления РПЖ. Показано, что с прогнозом РПЖ достоверно связаны исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и VEGF (р=0,001) в сыворотке крови.
Это позволило на основании анализа полученных клинических, морфологических и биохимических данных доказать значимость молекулярно-биологических маркеров в диагностике, мониторинге и прогнозе рака предстательной железы.
Практическая значимость исследования
Показано, что совместное определение в сыворотки крови VEGF и общего ПСА позволяет улучшить клиническую диагностику РПЖ на добиопсийном этапе, особенно при уровне ПСА более 10 нг/мл и VEGF менее 160 пг/мл. Также, у больных РПЖ целесообразно исследование концентрации IGF1, так как у данной категории пациентов уровень IGF1 в сыворотке крови прямопорпорционально коррелировал со значениями общего ПСА. При этом показано, что использование пороговых значений общего ПСА (10 нг/мл), VEGF (160 пг/мл) и IGFBP1 (65 нг/мл) позволило выработать алгоритм диагностических решений. Следовательно, применение вышеуказанных маркеров дает возможность определения индивидуальной вероятности правильного диагноза до выполнения биопсии. Кроме того, трактовка этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет помогает раннему выявлению РПЖ, и, стало быть, может способствовать более эффективному лечению этих пациентов и улучшению качества их жизни. Кроме того, при многофакторном анализе обнаружено, что с прогнозом РПЖ
достоверно связаны: показатель Глисона (р=0,001), исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и VEGF (р=0,001) в сыворотке крови. Также убедительно доказано, что первичным методом диагностики метастатического поражения костей при РПЖ является определение экскреции пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче, так как их концентрация свидетельствует о высокой диагностической специфичности при деструктивных процессах в костях. При этом, положительная иммуногистохимическая реакция на рецепторы андрогенов в преобладающем большинстве биоптатов злокачественных опухолей предстательной железы -весьма важный маркер при уточнении гистогенеза метастатического очага поражения в костях, когда не выявлен первичный источник опухоли.
Таким образом, на основании молекулярно-биологических исследований уровней VEGF, ПСА, IGF1, IGF2, IGFBP1, IGFBP3, щелочной фосфатазы, общего тестостерона, 5а-дигидротестостерона, андростендиона -в сыворотке крови; показателей экспрессии рецепторов андрогенов, антигена пролиферативной активности Ki-67 и Her-2/neu, редуктазной и дегидрогеназной активностей 17[3-ГСД - в опухоли; уровня экскреции пиридинолина, дезоксипиридинолина - в моче доказано практическое значение выше указанных маркеров в диагностике, мониторинге и оценке прогноза рака предстательной железы.
Апробация работы
Основные результаты диссертации доложены на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва, 20-22 октября 2004г.); на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005г.); на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2005» (Москва, 10-14 октября 2005г.); на 16th International Congress on Anti-cancer Treatment (Париж, 1-4 февраля 2005г.); на VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 11-15 октября 2005г.); на II Международной
конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.); на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 22-24 ноября 2005г.); на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.); на международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г.); на XIV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.)
Апробация диссертации проведена 14 декабря 2006г. на совместной научной конференции отделения урологии, кафедры урологии, кафедры онкологии и торакальной хирургии факультета усовершенствования врачей Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф.Владимирского и лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликована 21 научная работа.
Структура и объем работы
Диссертация написана на 208 страницах машинописного текста, включает введение, обзор данных литературы, глав «Материалы и методы исследования» и «Результаты собственных исследований», обсуждение полученных данных, выводы и список цитируемой литературы, который состоит из 38 работ отечественных и 264 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 58 рисунками.
Уровень внедрения
Предложенные молекулярно-биологические маркеры внедрены в работу урологического отделения МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского; в медицинском центре «Центр здоровья и реабилитации» г. Москвы; в
медицинском центре «Столичный доктор» г. Москвы; в урологическом отделении ГКБ № 20 г. Москвы.
Форма внедрения На основании результатов планируется выпустить пособие для врачей. Основные положения, выносимые на защиту
Уровни общего ПСА в сыворотке крови больных ДГПЖ и РПЖ достоверно различались. При пороговом значении общего ПСА равном 10 нг/мл ошибочная классификация в группе ДГПЖ составляет 22,2%, в группе РПЖ - 22,4%.
У больных ДГПЖ уровень общего ПСА в сыворотке крови повышается после 70 лет, у больных РПЖ - после 60 лет. При однородном варианте гистологического строения РПЖ уровень общего ПСА в сыворотке крови был достоверно ниже, чем при смешанных гистологических вариантах опухоли.
У больных ДГПЖ коэффициент соотношения VEGF/ПСА достоверно выше, чем при РПЖ.
При длительности анамнеза заболевания от одного года и более значения IGF1 в сыворотке крови больных РПЖ выше, чем при ДГПЖ, а также при наличии сопутствующих заболеваний у больных обеих групп по сравнению с их отсутствием.
Концентрация IGF2 в сыворотке крови практически здоровых мужчин достоверно выше, чем у больных ДГПЖ и РПЖ.
Соотношение IGFBPl/ПСА высокодостоверно различается между больными РПЖ и ДГПЖ. При уровнях IGFBP1 до 65 пг/мл и ПСА до 10 нг/мл в сыворотке крови точность диагностики РПЖ составляет 100%.
При длительности анамнеза заболевания от одного года и более у больных РПЖ концентрация IGFBP3 в сыворотке крови достоверно выше, чем при ДГПЖ.
Определение концентрации VEGF в сыворотке крови при значениях общего ПСА более 10 нг/мл, а уровня IGFBP1 - при значениях ПСА до 10
нг/мл в сыворотке крови позволяет с минимальной вероятностью ошибки уточнить клинический диагноз РПЖ у 50% пациентов с этим заболеванием.
Значение уровней VEGF, IGF1, IGF2 IGFBP3 в сыворотке крови больных вместе с уровнем общего ПСА можно использовать в качестве дополнительных молекулярных маркеров в диагностике РПЖ.
Редуктазная активность 17р-гидроксистероиддегидрогеназы в РПЖ на порядок выше по сравнению с ДГПЖ. Общая активность 17р~ гидроксистероиддегидрогеназы в растворимой фракции тканей РПЖ прямо пропорциональна концентрации 4-андростен-3,17-диона в сыворотке крови больных.
У больных РПЖ с метастазами в костях экскретируемые с мочой пиридиновые связи в составе коллагеновых фрагментов при деструкции костного матрикса выше, чем у больных без признаков поражения скелета, больных ДГПЖ и практически здоровых мужчин соответствующего возраста. Диагностическая эффективность выявления метастазов РПЖ в костях высока при определении уровней экскреции пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче этих пациентов.
