Содержание к диссертации
Введение
I . Опухолевый процесс и иммунологический надзор 13
2. Иммунное распознавание опухолей 20
3. Механизмы "ускользания" опухолевых клеток от иммунологического распознавания 24
3.1. Структурные и функциональные изменения антигенраспознагощего рецептора Т-лимфоцитов при развитии опухолей 24
3.2. Нарушения в экспрессии молекул МНС, ТАР, LMP, В-7, ICAM-1, участвующих в процессинге и презентации антигена 26
4. Основные механизмы иммуносупрессии при развитии опухолей 31
4.1. Нарушение баланса регуляторных лимфоцитов Thl/Th2 32
4.2. Регуляторные лимфоциты-супрессоры 34
5. Механизмы иммуносупрессии, индуцированные опухолями, при онкологических заболеваниях человека 37
6. Система апоптоза Fas/FasL в индукции иммуносупрессии при развитии опухолей 40
7. Иммунная стимуляция опухолевого роста 48
8. Эпидемиология опухолевых заболеваний 51
Материал и методы исследований 57
Результаты исследований
Глава 1. Изучение функциональной активности лимфоцитов при развитии опухолей 62
1.1 Индуцированная митогенами пролиферативная активность лимфоцитов крови у онкологических больных 63
1.2. Пролиферативная активность лимфоцитов крови у больных раком легкого ; 77
1.2.1. Сравнительная оценка уровня пролиферации лимфоцитов у больных с разными стадиями онкологического заболевания 77
1.2.2. Анализ уровня пролиферации лимфоцитов в зависимости от гистологического типа опухоли 88
1.2.3. Динамика пролиферативной активности лимфоцитов в процессе лечения , 99
Глава 2. Индукция реакции гиперчувствительности замедленного типа с использованием аутологичных лимфоцитов 105
Глава 3. Характеристика фенотипов лимфоцитов при развитии опухоли 113
3.1. Фенотипический анализ экспрессии CD-маркеров на лимфоцитах крови при различных онкологическихзаболеваниях 114
3.2. Фенотипический анализ экспрессии CD-маркеров на лимфоцитах крови у больных раком легкого 122
3.3. Изучение фенотипа лимфоцитов периферической крови у больных с опухолями органов желудочно-кишечного тракта 129
3.3.1 Сравнительный анализ фенотипов лимфоцитов крови у онкологических больных и здоровых лиц 129
3.3.2. Изучение фенотипа лимфоцитов периферической крови при раке желудка 135
3.3.3. Уровень экспрессии поверхностных маркеров лимфоцитов у больных колоректальным раком 147
3.3.4. Сравнительная характеристика иммунологических параметров у больных с опухолями в различных отделах желудочно-кишечного тракта... 151
3.4, Влияние рекомбипаїггного IL-2 на иммунологические показатели онкологических больных 154
3.5, Сравнительный анализ экспрессии активационных антигенов при онкологических и аутоиммунных заболеваниях 159
3.6, Сравнительный анализ фенотипов лимфоцитов при онкологических заболеваниях и гепатите 162
Обсуждение 166
Заключение 180
Выводы 186
Литература 188
Список сокращений 247
- Иммунное распознавание опухолей
- Структурные и функциональные изменения антигенраспознагощего рецептора Т-лимфоцитов при развитии опухолей
- Индуцированная митогенами пролиферативная активность лимфоцитов крови у онкологических больных
- Фенотипический анализ экспрессии CD-маркеров на лимфоцитах крови при различных онкологическихзаболеваниях
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение функционирования иммунной системы при возникновении и развитии злокачественных новообразований представляет огромный интерес поскольку, несмотря на значительные успехи в изучении молекулярных и генетических аспектов онкогенеза, в настоящее время пет достаточно ясного представления о роли противоопухолевого иммунитета, о взаимоотношениях, которые складываются между иммунной системой хозяина и развивающимися опухолями. Особая актуальность таких исследований для онкологии обусловлена ростом числа заболеваний, связанных с новообразованиями. Недостаточность имеющихся знаний о разнообразных механизмах воздействия опухоли на организм, в частности, на функции иммунной системы, затрудняет разработку новых методов ранней диагностики и эффективной иммунотерапии.
Существует представление о том, что опухоль индуцирует иммуносупрессию, которая может проявляться в широком диапазоне: от слабого иммунного ответа до полной анергии (Dranoff, 2003; Whiteside, 1999). Именно иммуносупрессией объясняют неэффективность противоопухолевой терапии, направленной на стимуляцию иммунных механизмов у больных с растущими опухолями (Kang et al., 1997; Rabinowichetal., 1996). Однако закономерности формирования иммунологической недостаточности, причины и механизмы, приводящие к снижению реактивности иммунной системы, до сих пор четко не определены.
При опухолевом росте часто обнаруживаются изменения в функциях сигнальных и структурных цепей антигенраспознающего рецептора TCR (Zea et al,, 1995). Есть данные о том, что среди Th-лимфоцитов крови онкологических больных наблюдается количественный сдвиг в сторону Th2, вызванный способностью опухолевых клеток продуцировать цитокины (TGFp и IL-10), поддерживающие дифференцировку этих клеток (Maeda et al., 1996). Отсутствие иммунного ответа или его недостаточная эффективность могут быть также обусловлены способностью опухолевых клеток различными путями избегать
иммунологического распознавания (Bennett et al., 1999; O'Connell et al., 1996; Macher et al., 2003), Клетки опухолей могут избегать распознавания за счет изменения экспрессии молекул МНС, отсутствия корецепторов, мутаций в транспортных белках ТАР1,ТАР2 и др.
Иммунное распознавание опухоли имеет свои особенности, так как опухолевые клетки происходят из "своего" и антигены опухолей не совсем соответствуют традиционной роли "чужого" (если сравнивать с вирусами и бактериями, которые поступают в организм извне). В связи с этим считается, что противоопухолевый иммунитет составляет особенную парадигму иммунного распознавания "своего" и "измененного своего" (Houghton, 2001; Turk et al., 2002). Действительно в силу низкой иммуногеїнюсти антигенов аутологичпого происхождения, видимо, развивается слабый и кратковременный иммунный ответ, который не приводит к разрушению опухоли in vivo (Boon, Van der Bruggen, 1996; Lay et al., 1996; Restifo et al., 2002). Кроме того, следствием противоопухолевого иммунитета может быть инициирование аутоиммунных процессов, что важно учитывать при разработке различных способов индукции или стимуляции иммунного ответа к опухолевым антигенам (Bronte et al., 2000; Overwijk et al., 1999; Turk et al., 2002; Wei et al., 2004). Несмотря на эти сомнения в сколько-нибудь значимой роли противоопухолевого иммунитета, ряд авторов признают решающую роль специфического иммунитета в отторжении опухоли и видят перспективу в создании эффективных противоопухолевых вакцин (Alexandroff et al., 1998; Dupont, 2002; Ostrand-Rosenberg, 2004; Pawelec, 2004).
В последние годы появилась концепция "иммунного редактирования опухолей", согласно которой реакция иммунной системы на опухолевые антигены даже способствует трансформации и прогрессированию опухолей, так как происходит селекция и выживание только иммунологически "невидимых" клонов опухолевых клеток, которые в состоянии преодолеть иммунологический барьер (Дейчмаи, 2000; Balkwill and Mantovani, 2001; Coussens and Werb, 2001; Spadaro et al., 2004). Несмотря на разные взгляды, авторы солидаризуются в том, что нельзя недооценивать сложность тонкой сети взаимодействий, которые устанавливаются между клетками иммунной системы и опухолевыми клетками.
И только проведение фундаментальных исследований в опкоиммунологии позволит установить нарушения в основных механизмах функционирования иммунной системы организма при развитии опухолевого процесса (Valeri et al., 2003).
Для понимания механизмов, генерирующих иммуносупрессшо при опухолевом росте, необходимо изучать сдвиги в дифференцировке лимфоцитов, изменение пролиферативной активности и апоптоз клеток иммунной системы, закономерности экспрессии молекул клеточной поверхности. Оценка функциональной активности лимфоцитов, их фенотипических особенностей у больных имеет и практический аспект. Результаты исследований могут быть применены для диагностики иммунодефицитных состояний, определения характера и интенсивности повреждения иммунной системы, а также в целях совершенствования методов иммунотерапии (Кадагидзе, 1998, 1999; Кадагидзе и др., 2002; Пинегин, Хаитов, 1997; Baryshnikov et al., 1997; Wang et al., 2001). Bee вышесказанное позволяет считать изучение функций иммунной системы в процессе опухолевого роста чрезвычайно актуальным, поскольку оно обогатит он ко иммунологию новыми знаниями и будет способствовать решению проблем иммунотерапии.
Цель и задачи исследования. Основная цель исследования заключалась в выяснении закономерностей функционального и фенотипического сдвига в субпопуляциях лимфоцитов крови у больных с различными онкологическими заболеваниями. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
В сравнительном исследовании охарактеризовать особенности функционального состояния Т- и В-лимфоцитов крови по уровню пролиферации при стимуляции митогенами у больных раком легкого, раком желудка, раком молочной железы, колоректальным раком.
Изучить фенотипы лимфоцитов крови по экспрессии дифференцировочных CD3, CD4, CD8, CD16, CD19 и активационных маркеров CD25, CD71, CD95, HLA-DR у больных раком легкого, раком желудка, раком молочной железы, колоректальным раком.
Сопоставить динамику изменений уровня пролиферативной активности лимфоцитов и экспрессии антигенов клеточной поверхности на разных стадиях заболевания у больных с различными онкологическими патологиями. Оценить функциональные сдвиги основных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов,
Охарактеризовать изменения в фенотипе лимфоцитов крови больных в зависимости от стадии заболевания, локализации и гистологического типа опухоли. Оценить феиотипические сдвиги в лимфоцитах онкологических больных в зависимости от течения и исхода заболевания.
Сопоставить функциональные и феиотипические изменения в лимфоцитах крови при различных онкологических заболеваниях и определить наиболее характерные системные сдвиги в функциях иммунной системы, происходящие в процессе развития опухолей.
Выявить особенности состояния иммунной системы у онкологических больных в сравнении с заболеваниями иной природы.
Основные положения, выносимые на защиту:
Изменения функциональной активности лимфоцитов крови у больных с разными онкологическими заболеваниями обусловлены активацией Treg лимфоцитов-супрессоров, экспрессирующих маркер CD25. Наряду с ростом числа клеток CD25+ происходит усиление экспрессии молекул HLA-DR на лимфоцитах большинства онкологических больных, что отражает процесс активации С04+С025+Т-лимфоцитов. Эти клетки могут ингибировать стимулированный митогенами пролиферативный ответ, опосредованный CD4+ и С08+Т-клетками.
Прогрессирование опухоли сопровождается снижением эффективности взаимодействий между разными субпопуляциями лимфоцитов. Наиболее низкий пролиферативный ответ характерен для онкологических больных при стимуляции митогеном лаконоса, который индуцирует пролиферацию В-клеток только при совместном культивировании с Т-лимфоцитами. Главной причиной подавления пролиферации являются нарушения в цитокиновой регуляции.
У больных раком легкого и раком желудка фенотипические сдвиги характеризуются увеличением числа С095+-лимфоцитов крови, что указывает на усиление апоптоза Т-клеток в процессе развития опухолей.
Лимфоциты крови онкологических больных характеризуются усилением экспрессии активационных маркеров CD25, CD71, CD95, HLA-DR.. Изменения в фенотипах лимфоцитов у больных с онкологическими заболеваниями носят более глубокий и системный характер по сравнению с больными с аутоиммунными заболеваниями и хроническими инфекциями.
Научная новизна. Впервые получены данные о комплексе функциональных и фенотипических изменений в лимфоцитах крови у больных раком легкого, раком желудка, раком молочной железы и колоректальным раком на разных стадиях заболеваний.
Впервые показано, что развитие опухоли сопряжено с угнетением клеточной пролиферации, стимулированной митогенами. При этом снижение пролиферативноЙ активности лимфоцитов наиболее выражено при использовании митогена лаконоса, что свидетельствует о нарушении механизмов межклеточных Т-В взаимодействий.
Впервые установлено, что у больных раком желудка в большей степени подавлена функциональная активность CD4+-, а у больных раком легкого - CD8+ Т-лимфоцитов.
Впервые показано, что снижение пролиферативного ответа лимфоцитов в процессе роста опухоли у больных раком легкого носит обратимый характер и может восстанавливаться после радикального удаления опухоли.
Впервые охарактеризованы в сравнительном аспекте активационные фенотипы лимфоцитов крови больных раком легкого, раком желудка, раком молочной железы, колоректальным раком.
Впервые показано, что у больных раком легкого и раком желудка наиболее выражен фенотипический сдвиг в сторону лимфоцитов CD25+, CD95+, HLA-DR+.
Впервые показано, что экспрессия рецептора апоптоза CD95 на лимфоцитах повышена уже на ранних стадиях рака желудка и сохраняется на
высоком уровне в процессе опухолевого развития, что свидетельствует об индукции Fas-опосредованной гибели Т-клеток.
Теоретическое и практическое значение. На основании проведенных исследований и литературных данных предложена концепция развития взаимоотношений между иммунной системой и опухолевыми клетками, заключающаяся в том, что роль иммунной системы трансформируется в процессе онкогенеза. Это проявляется в последовательной смене противоопухолевого иммунного ответа толерантностью, анергией, а затем наступает этап, когда иммунная система способствует развитию опухолей и становится фактором опухолевой прогрессии. Одним из механизмов устойчивого роста опухолей является сдвиг в дифференцировке Treg-клеток (ТЫ—>Th3) и активация супрессорных субпопуляций с фенотипом CD4+CD25+ (Trl) с соответствующим изменением спектра секретируемых цитокинов (усиление синтеза ингибиторных цитокинов IL-10, TGF-P). Об этом свидетельствуют данные о системных функциональных и фенотипических сдвигах в лимфоцитах крови онкологических больных. Происходит значительное снижение пролиферативной активности CD4+-, CD8+-, CD19+-лимфоцитов крови при стимуляции митогенами. Одновременно с этим фенотипы лимфоцитов при опухолевом росте характеризуются усилением экспрессии активационных маркеров CD25, CD71, CD95, HLA-DR. У пациентов с разными онкологическими заболеваниями популяции лимфоидных клеток крови отличаются как по набору фенотипических маркеров активации, так и по степени поликлоналыюй активации митогенами. У больных раком легкого значительно снижен пролиферативный ответ лимфоцитов при стимуляции КонА и МЛ, у больных раком желудка - при стимуляции ФГА, а у больных раком молочной железы - при стимуляции МЛ.
В наших исследованиях было установлено, что у больных раком легкого пролиферативная активность С08+Т-лимфоцитов восстанавливается после радикальной операции. Поэтому определение пролиферативной активности лимфоцитов крови до и после операции может быть рекомендовано к
использованию как показатель восстановления функциональной активности иммунной системы в процессе лечения. Предложен способ интерпретации результатов бласттрансформации с использованием суммарного дозового эффекта, что позволит стандартизировать метод, и облегчит его использование на практике. Разработан оригинальный метод иммунодиагностики рака легкого с использованием кожной реакции "Способ дифференциальной диагностики новообразований легких". Сущность метода заключается в индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа путем введения взвеси аутологичных лимфоцитов после их активации фитогемагглготиишюм. Метод защищен патентом на изобретение. Полученные результаты могут быть использованы для оценки иммунного статуса человека и при диагностике иммунологической недостаточности. Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций по иммунологии студентам и ординаторам ПетрГУ.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований" (Москва-Ангарск, 1987), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989), Международном симпозиуме "Реабилитация иммунной системы" (Дагомыс, 1990), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на I съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), Выездной сессии Отделения физиологии РАН (Петрозаводск, 1996), II и III Конференции хирургов Северо-Запада России (Санкт-Петербург, 1997, 2001), Международной конференции "Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира Восточной Фенноскандии" (Петрозаводск, 1999), II Съезде онкологов стран СНГ (Киев, 2000), IV, V, VI, VII Всероссийских научных конференциях с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2000, 2001, 2002, 2003), IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), I, II, IV - XIII Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва - Санкт-Петербург,1994 - 2003), Научной конференции "Карелия и РФФИ" (Москва -Петрозаводск, 2002), Международной конференции "Наземные и водные
экосистемы Северной Европы" (Петрозаводск, 2003), Международной научно-практической школе-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет" (Санкт-Петербург, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 79 работ, в том числе 25 статей.
Диссертационная работа выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биологии Карельского научного центра РАН, включающем государственные задания и программы (№ гос. регистрации 01.90.0046799, 01.96.0000640, 01.20.0012497) и при поддержке гранта РФФИ, проект №98-04-03521 (1998-2000г.)
Иммунное распознавание опухолей
Распознавание опухолевых клеток обеспечивается как врожденным, так и адаптивным иммунитетом. С одной стороны клетки-эффекторы врожденного иммунитета, используя свои рецепторы и молекулы клеточной поверхности, прямо выявляют опухолевую клетку. Например, NK-клетки, другие цитотоксические лимфоциты, фагоциты имеют рецептор NK.G2D, лигаидом которого являются белки, кодируемые стресс-связанными генами, и эти молекулы (MICA, MICB) часто эксирессиругатся опухолевыми клетками (Diefenbach, Raulet, 2002; Davis, Gillies, 2003). Дендритные клетки могут активно, с использованием молекул CD36 и интегринов (avp5), фагоцитировать апоптотические опухолевые клетки (Albert et аі., 1998). Определенную роль в элиминации опухолевых клеток играют NKT-клетки и у5+Т-клетки, которые представляют собой цитотоксические Т-лимфоциты, функционирующие на пересечении врожденного и адаптивного иммунитета (Girardi et аі., 2001; Smyth et al., 2002; Gao et al., 2003). С другой стороны в адаптивном иммунитете обычно имеет место непрямой путь распознавания опухоли, который называется кросс-примированисм (cross priming).
Если опухолевые клетки во многих случаях не экспрессируют важные молекулы-костимуляторы, например из семейства В7, которые необходимы для прямого потенцирования эффективного ответа Т-лимфоцитов (Sharpe, Freeman, 2002), то дендритные клетки, наоборот, усиливают экспрессию молекул В7-1 и В7-2 и мигрируют в регионарные лимфоузлы для презентации опухолевых антигенов и индукции специфического иммунного ответа (Banchereau, Steinman, 1998).
В последнее время растет число доказательств того, что у разных онкологических больных иммунный ответ Т-клеток против антигенов опухолей развивается. практически всегда (Kawakami, Rosenberg, 1997; Kammula et al., 2001; Letsch et al., 2000; Scheibenbogen et al., 2002; Ladekarl et al., 2004). В результате в периферической крови обнаруживаются CD4+ и С D8+T клетки, которые специфически реагируют на МНС-рестртегированные опухолевые пептиды, образующиеся в результате процессинга измененных белков, аберрантно экспрессированных генных продуктов, а также нормальных диффереицировочных антигенов, которые продуцируются опухолевыми клетками (Boon, Van der Bruggen, 1996), Таким образом, циркулирующие в крови опухоль-реактивные Т-лимфоциты могут быть полезным источником информации об иммунном ответе на опухоль. Изменения в фенотипических и функциональных характеристиках этих клеток в процессе опухолевого роста могут быть использованы как диагностический или прогностический критерий, а также как показатель эффективности иммунотерапии.
Ранние исследования были сфокусированы в основном на С08+Т-клетках, которые осуществляют МНС I класса рестриктированпый киллинг опухолевых клеток (Hanson et al., 2000). Однако в настоящее время повышенный интерес вызывают С04+Т-лимфоциты, которым отводится главная роль в развитии противоопухолевого ответа. Во-первых, С04+Т-клетки выступают в роли хелперов в процессе примирования и генерации эффекторных опухоль-специфических цитолитических лимфоцитов. Во-вторых, эти клетки оказались также необходимы для индукции памяти С08+Т-клеткам и установления продолжительного специфического иммунитета против опухолей. В третьих, было показано, что CD4+ эффекторные Т-клетки могут подавлять опухолевый рост независимо от С08+Т-клеток и в отсутствии на опухолевых клетках (карцинома легкого) молекул МНС I и II класса (Eglimez et al., 2002). Кроме того, С04+Т-клетки могут также оказывать помощь В-лимфоцитам в продукции антител к опухоль ассоциированным антигенам (Sahin, 1995; Old, Chen., 1998).
В последнее годы повышенное внимание уделяется субпопуляции регуляторних СВ4+Т-клеток, имеющих маркер CD25+(Treg). Эти клетки в норме обеспечивают иммунологическую толерантность и в значительной мере определяют реактивность иммунной системы при аутоиммунных процессах, а также при отторжении трансплантата. Возможно, что и при опухолевом росте CD4+CD25+T-клетки также индуцируют толерантность к антигенам опухолей и таким образом выступают в роли супрессоров. Особенностью распознавания и развития иммунного ответа против опухолевых клеток является риск возникновения аутоиммунных реакций. Есть точка зрения, что методы иммунотерапии, направленные на усиление иммунного ответа против опухолевых клеток, могут привести к нежелательным для хозяина аутоиммунным процессам, так как опухолевые антигены представляют собой не что иное как "свое" или "измененное свое" (Jones et al., 2002; Phan et al., 2003; Wei et al., 2004). В действительности с помощью моноклональных антител, полученных к опухолевым клеткам больных, выявляются различные антигены, широко представленные как на опухолевых, так и на нормальных клетках (Wang et al., 1999; Роит и др., 2000; Moreau-Aubry et al., 2000; Zeng et al., 2000). В сыворотке крови больных с опухолями, как правило, обнаруживаются соответствующие низкоаффинные антитела к аутоантигенам (Chen, 1997; Clynes et al., 2000). Это связано с тем, что для многих опухолей характерна зкспрессїія антигенов нормальных клеток, измененных за счет гликозилирования. В результате структурных изменений могут открываться новые углеводные эпитопы или эпитопы белкового остова, которые редко обнаруживаются на нормальных клетках (Zeng et al., 2000). Примером служит муцин, образуемый клетками эпителия. Муцин представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, в котором повторяющийся сердцевинный пептид несет боковые углеводные цепи. Изменения в структуре углеводной части открывают новые белковые эпитопы, которые могут стать антигенными и иммунологическая толерантность к клеткам эпителия будет нарушена (Barad et al., 1989; Weber, 1998; Wolchok et al., 2001).
В результате, следствием распознавания опухолевых антигенов и развития противоопухолевого иммунного ответа могут быть аутоиммунные процессы, что в действительности наблюдается у части пациентов (например, витилиго). Поэтому, при разработке методов иммунотерапии, направленных па стимуляцию иммунного ответа, следует учитывать, что индукция более мощного противоопухолевого иммунитета должна быть каким-то образом сбалансирована с риском аутоиммунизации (Naftzger et al., 1996; Trcka, 2002; Turk et al., 2002).
Структурные и функциональные изменения антигенраспознагощего рецептора Т-лимфоцитов при развитии опухолей
Особое внимание уделяется изучению структуры и функций TCR при опухолевом росте. Рядом авторов показано снижение у онкологических больных экспрессии -цепи TCR на CD4+- и С08+-лимфоцитах периферической крови, а также на Т-клетках опухолевого микроокружения (Levey, Srivastava, 1996; Whiteside, 1998; Finke et al., 1999). В частности, подобные нарушения экспрессии -цепи TCR описаны при карциноме поджелудочной железы (Tsiolias et al., 1993; Schindowski et al., 2000), колоректалыюм раке (Matsuda et al., 1995; Ngoi et al.,
1996; Choi et al., 1998), почемно-клеточной карциноме (Bukovvski et al., 1998), раке предстательной железы (Healy et al., 1998). Некоторые авторы считают, что уровень экспрессии -цепи TCR связан со стадией заболевания и выживаемостью пациентов. У больных раком толстой кишки с вовлечением регионарных лимфатических узлов и отдаленными метастазами выявлен более низкий уровень экспрессии -цепи на Т-лимфоцитах периферической крови по сравнению с больными I—II стадиями онкологического процесса (Matsuda et al., 1995). Снижение или отсутствие экспрессии -цепи на инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (ОИЛ) при злокачественных новообразованиях головы и шеи было характерным для больных с меньшим сроком выживаемости по сравнению с пациептами, у которых выявлялся нормальный уровень экспрессии -цепи (Whiteside, 1998). При колоректальном раке по мере роста опухоли и прогрессирования заболевания происходит последовательное снижение экспрессии С,- цеп и па Т-лимфоцитах крови и ОИЛ (Matsuda et al., 1995; Choi et al., 1998). Некоторые авторы полагают, что эти изменения в экспрессии молекул сигнальной транедукдии в Т клетках усиливают чувствительность лимфоцитов крови к аиоптозу (Chen et al., 2000). Таким образом, анализ уровня экспрессии сигнальных -цепей TCR на лимфоцитах периферической крови может быть использован для выявления прогрессирования онкологического процесса (Gunji et al., 1994;), а также для контроля за эффективностью проводимого лечения (Nishiyama et al., 2002). Снижение экспрессии С,-цепи на Т-лимфоцитах периферической крови наблюдается при некоторых имму но дефицитных состояниях, при ряде аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и системная красная волчанка (Finke et al., 1999; Головизнин, 2001).
Потеря -цеии TCR часто сопровождается снижением экспрессии на лимфоцитах онкологических больных є-цеші (Matsuda et al., 1995; Whiteside, 1999), а также протеинкиназ p56(lck) и p59(fyn), которые отвечают за фосфорилирование остатков тирозина в ITAM С,- и s-цепей (Levey, Srivastava, 1996; Choi et al., 1998; Kim et al., 2000), и компонентов транскрипционного фактора NFKB (Bukowski et al., 1998; Whiteside, 1999). Структурные и функциональные изменения TCR, нарушения во внутриклеточной передаче сигнала, как правило, более выражены в ОИЛ по сравнению с циркулирующими клетками крови. Это указывает на то, что опухолевое микроокружение оказывает влияние на развитие повреждений в экспрессии сигнальных молекул и индуцирует функциональные дефекты лимфоцитов.
Одним из важных механизмов избегания опухолевыми клетками их распознавания является снижение или отсутствие экспрессии молекул МНС I класса. Цитотоксические Т-лимфоциты, рестриктироваиные по МНС I класса, представляют собой главное эффекторное звено в противоопухолевом иммунитете. Утрата HLA-антигенов клетками опухоли защищает их от распознавания и лизиса С08+Т-лимфоцитами (Ikeda et al., 1997; Feenstra et al., 2000; Garrido, Algarra, 2001; Real et al., 2001; Cabrera et al., 2003; Garcia-Lora et al., 2003b), По мере прогрессировапия опухоли, как правило, происходит постепенное снижение уровня экспрессии МНС молекул вплоть до их полного отсутствия на поверхности клеток (Amiot et al., 1998; Seymour et al., 1999; Menon et al, 2002; Paschen et al, 2003), Некоторые авторы считают, что снижение экспрессии молекул HLA I класса и других структур, участвующих в презентации антигена, ассоциируется с усилением прогрессирования опухолевого роста, что предопределяет клиническое течение болезни, например, при меланоме (Kageshita et al, 1999).
Анализ экспрессии молекул МНС I класса на клетках различных опухолей показал, что их полная или частичная утрата наблюдается в большинстве случаев: 90% при карциномах шейки матки (Keating et al, 1995; Brady et al, 2000; Koopman et al, 2000), 73% при колоректальных карциномах (Cabrera et al, 1998), 88% при карциномах молочной железы (Cabrera et al, 1996), 51% при меланомах (Ferrone, Marincola, 1995), 66% при ларингеальных карциномах (Cabrera et al, 2000; Maleno et al, 2002). Полное отсутствие экспрессии МНС I класса, как правило, является следствием делеции р2-микроглобулина (Paschen et al., 2003).
В основе изменения экспрессии HLA I класса (чаще всего аллели HLA-A и HLA-B) на опухолевых клетках могут лежать нарушения в процессинге и презентации опухолевых антигенов цитотоксическим лимфоцитам (Salazar-Onfray et al., 1997; Seliger et al., 2003). В первую очередь эти нарушения касаются функционирования специальных белков ТАР-1, ТАР-2 и LMP2, LMP7, которые кодируются генами, расположенными внутри комплекса МНС (Seliger et al., 1997). LMP2 и LMP7 представляют собой варианты низкомрлекулярных протеасомных субъединиц, осуществляющих деградацию антигена до смыслового пептида, способного соединиться с молекулой МНС для дальнейшей презентации CDS T клеткам. А специальные АТФ-зависимые белки ТАР-1 и ТАР-2 обеспечивают транспорт образовавшихся в цитозоле пептидных фрагмеїгтов во внутреннее пространство эндоплазматического ретикулума для связывания с молекулами МНС I класса. Нарушения экспрессии белков ТАР и LMP выявлены в некоторых линиях опухолевых клеток рака предстательной железы (Sanda et al., 1995), почечно-клеточной карциномы (Seliger et al., 1996), мелко клеточного рака легкого и гепатоцеллтолярной карциномы (Singal et al., 1996). Дефекты экспрессии ТАР и LMP чаще встречаются в метастазах, чем в первичной опухоли, что, вероятно, указывает на селекцию опухолевых клеток, которые способны избежать распознавания цитотоксическими лимфоцитами (Kaklamanis et al., 1995). Снижение функций LMP2 и LMP7 отмечено при опухолях молочной железы, почечной карциноме, при лимфоме Беркитта (Khanna et al., 1998; Vitale et al., 1998; Seliger et al., 2000).Снижение экспрессии TAP ассоциировано с прогрессированием заболевания при опухолях молочной железы (Vitale et al., 1998), при раке шейки матки (Keating et al., 1995; Seliger et al., 2000).
Индуцированная митогенами пролиферативная активность лимфоцитов крови у онкологических больных
Нашей задачей было изучение пролиферативиой активности лимфоцитов как показателя функционального состояния иммунной системы у больных с онкологическими заболеваниями. Мы исследовали уровень стимулированной митогепами пролиферативиой активности лимфоцитов периферической крови больных с разными локализациями опухолевого роста: раком легкого, раком желудка, раком молочной железы, колоректальным раком и сравнивали с контрольной группой практически здоровых лиц. Всего было обследовано 85 онкологических больных (рак легкого - 42, рак желудка - 13, рак молочной железы - 21, колоректальпый рак - 9) и 24 здоровых.донора, которые составили контрольную группу.
Полученные результаты показали, что при стимуляции ФГА уровень пролиферации лимфоцитов у больных раком легкого, раком желудка, колоректальным раком был ниже по сравнению с контролем (табл.1). Наиболее значительным различие было в группе больных колоректальным раком (р О,05). В то же время при раке молочной железы пролиферативная активность лимфоцитов практически не отличалась от контроля, а при дозе митогена 20 и 40 мкг/мл даже несколько превосходила контрольный уровень.
При стимуляции КонА уровень пролиферации лимфоцитов у больных с раком легкого, колоректальным раком, раком молочной железы был значительно ниже по сравнению с контролем, в то время как у больных раком желудка снижения индекса стимуляции мы не наблюдали. Наиболее заметным подавление пролиферации было в группах больных раком легкого и колоректальным раком, причем при колоректалыюм раке различия были достоверными (р 0,05) при всех концентрациях митогена.
При использовании в качестве стимулятора МЛ также отмечалось снижение уровня пролиферации во всех группах больных, что четко Таблица 1. Уровень пролиферативного ответа лимфоцитов крови у онкологических больных при стимуляции митогенами (индекс стимуляции, M±m ) квадратичная ошибка - различия между опытом и контролем достоверны (р 0,05) РЛ- рак легкого, РЖ - рак желудка, КРР - колоректальпый рак, РМЖ - рак молочной железы. прослеживается при суммировании индексов стимуляции (см. ниже). Однако, в отличие от других митогенов, стимуляция МЛ была наименее эффективной в группах больных раком легкого и особенно раком молочной железы, где наблюдалось снижение уровня пролиферации в 2 и более раза по сравнению с контролем. В этих группах различия с контролем были достоверны при всех трех дозах митогена (5, 20 и 40 мкг/мл). В меньшей степени подавление пролиферативной активности выявлено у больных раком желудка и колоректальным раком, в этих группах с увеличением дозы МЛ (до 40 мкг/мл) различия с контролем становились менее значительными.
Если уровень пролиферации выразить в процентах к контролю, то можно видеть более четкую картину снижения пролиферативного ответа лимфоцитов у разных групп онкологических больных. Общая тенденция подавления пролиферации оказалась характерной для всех трех митогенов. При стимуляции ФГА значительная разница с контролем отмечена для групп больных раком легкого, раком желудка, колоректальным раком (рис. 1). Исключение составляет только группа больных раком молочной железы, которая характеризовалась тем, что при высоких дозах ФГА (20 и 40 мкг/мл) уровень пролиферации лимфоцитов был даже несколько выше контроля, хотя при дозе митогена 5 мкг/мл стимуляция была все-таки снижена. Для всех исследованных групп больных замечено снижение различий с контролем, по мере роста концентрации ФГА.
Несколько другая картина складывалась при стимуляции КонА. Здесь можно выделить больных раком желудка, у которых не обнаруживается существенных различий в пролиферативной активности лимфоцитов по сравнению с контролем при всех использованных дозах КонА (рис. 2). Напротив, группа больных колоректальным раком отличалась от контроля, а также от других групп больных резко выраженным снижением уровня пролиферации при всех дозах митогена. Для больных раком легкого можно отметить, что по мере увеличения концентрации КонА пролиферативный ответ снижался.
Можно видеть, что все группы больных отличаются значительно более низким уровнем пролиферации по сравнению с контролем. Самые низкие уровни пролиферативного ответа на МЛ отмечаются у больных раком легкого и раком молочной железы, в этих группах наблюдается снижение ответа в несколько раз (2 и более) в зависимости от дозы митогена.
Таким образом, анализ полученных результатов для разных митогенов показывает, что наиболее существенное подавление пролиферативной активности лимфоцитов у онкологических больных происходит при стимуляции МЛ, затем в несколько меньшей степени при стимуляции КонА, а при использовании ФГА уровень бластной трансформации в целом снижается меньше, чем при МЛ и при КонА.
Это означает, что рост опухоли сопровождается снижением пролиферативного потенциала клеток иммунной системы. При этом наиболее выражено нарушение Т-зависимой В-клеточной пролиферации, которая зависит от наличия адекватных межклеточных взаимодействий, необходимых для индукции МЛ пролиферации В-клеток. Можно отметить снижение пролиферативного потенциала С08+Т-лимфоцитов, которые являются основными клетками мишенями для КонА. В меньшей степени подавление функциональной активности отмечается и для С04+Т-клеток, которые стимулируются ФГА.
Если сравнивать уровень пролиферации лимфоцитов в группах онкологических больных с различными локализациями опухоли, то можно отметить, что степень подавления стимулированной пролиферации зависела от митогена (ФГА, КонА, МЛ) и каждая группа имела свои характерные черты. Для проведения такого анализа мы суммировали индексы стимуляции, полученные для разных доз митогена. На рис.4-6 показан уровень пролиферации лимфоцитов больных с различными локализациями опухоли при стимуляции ФГА, КонА и МЛ, где каждый столбик состоит из трех частей, представляющих величину индекса стимуляции для трех доз митогена (5, 20, 40 мкг/мл).
Фенотипический анализ экспрессии CD-маркеров на лимфоцитах крови при различных онкологическихзаболеваниях
Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) - это Т-зависимая реакция, в основе которой лежит специфическое взаимодействие между Т-лимфоцитами и антигеном, проявляющаяся в виде воспаления в месте попадания в организм антигена - обычно в коже. У человека интенсивность ГЗТ определяют по диаметру уплотненного с гиперемией участка кожи через 24-48 часов после инициации реакции.
Реакция ГЗТ отражает состояние клеточного иммунитета, так как именно сенсибилизированные Т-эффекторы ГЗТ (Т-ГЗТ) после контакта с антигеном секрстируют про воспалительные цитокипы, привлекая к месту событий макрофаги и другие клетки.
Было проведено изучение функционального состояния иммунной системы онкологических больных с использованием разработанного нами способа постановки кожной реакции ГЗТ с модифицированными аутологичными лимфоцитами.
Предварительные исследования показали, что ГЗТ может быть индуцирована путем внутри кожного введения взвеси аутологичных лимфоцитов, предварительно модифицированных инкубацией in vitro с Т-клеточным митогеном - ФГА. Были подобраны оптимальные концентрации ФГА, не вызывающие агглютинации клеток. Кожные пробы ставили у не подвергавшихся лечению больных раком легкого. Всего реакции ГЗТ с аутологичными лимфоцитами были изучены у 216 больных с заболеваниями легких.
Суспензию лимфоцитов, предварительно про инку бированных с ФГА, вводили виутрикожно на предплечье. Для контроля также вводили не обработанные лимфоциты в таком же количестве, как в опыте и физиологический раствор. Более подробно метод представлен в описании к заявке на патент N 2051385 "Способ дифференциальной диагностики новообразований легких", зарегистрировано в Гос. реестре изобретений 27.12.1995г..
Классическая реакция ГЗТ в виде эритемы развивалась, как правило, только в варианте, где фактором, инициирующим реакцию, служили аутологичные лимфоциты, обработанные ФГА. Осложнений при постановке проб не было. ГЗТ ставили больным при поступлении в стационар, а затем на 30-е сутки после операции и по возможности в более отдаленные сроки (от нескольких месяцев до 3-х лет).
В таблице 5 приведены результаты постановки реакции ГЗТ в разных группах больных легочными заболеваниями. У больных раком легкого І-Ш стадии положительная реакция наблюдалась в 92,9% случаев, при IV стадии - в 80,0%. Частота положительных реакций у больных доброкачественными опухолями легких (ДОЛ) составила 7,1%, при ХНЗЛ - 10,4%, а у здоровых лиц -5,0%.
Были отмечены существенные различия в величине зоны гиперемии в зависимости от характера заболевания. Так, у 84% больных раком легкого диаметр эритемы составлял более 10 мм. В то же время из 14 больных ДОЛ лишь у одного диаметр эритемы составил 8 мм. В контрольной группе лишь в 2-х наблюдениях диаметр превышал 5 мм.
Отмечался рост диаметра эритемы у больных раком легкого в зависимости от стадии заболевания. Максимальные зоны гиперемии отмечены у больных с III стадией, а у больных с IV стадией реакция была такой же, как при I стадии (рис. 24). У больных ДОЛ средний диаметр эритемы составил 2,9±0,6 мм, приХНЗЛ-4,1±0,5 мм и в контрольной группе-3,7±0,5 мм(р 0,05).
Была проанализирована зависимость реакции ГЗТ от гистологического типа опухоли. Оказалось, что реакция была наиболее выраженной при низкодифференцировашюм раке - 18,3±0,95 мм. Несколько ниже был ответ у больных с аденокарцшюмой - 17,4±1,85 мм, и плоскоклеточным раком легкого-15,6±1,9 мм, хотя различия между этими группами были не достоверны (р 0,05).
Сопоставление результатов положительных проб ГЗТ в зависимости от времени учета реакции показало, что у больных ДОЛ, ХНЗЛ, а также у здоровых лиц, реакция через 24-48 часов после постановки становилась отрицателыгой (табл.7). У больных раком легкого через 48 часов реакция была положительной в 47,4% случаев, а через 72 часа - в 9,6%. В 3-х наблюдениях (1,9%) реакция оставалась положительной свыше 72 часов с момента постановки.
