Введение к работе
Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности на планете, составляя более 25% случаев всех смертей в развитых странах. Рак желудка (РЖ) остается одним из лидеров по показателям смертности среди больных со злокачественными новообразованиями во всем мире, несмотря на снижение показателей заболеваемости в развитых странах Европы и в США. Ежегодно в мире регистрируется более миллиона новых случаев заболевания РЖ, более 50 тысяч из которых диагностируется в РФ. В структуре заболеваемости мужского населения России РЖ занимает второе место, женского - третье. Среди больных РЖ высоки показатели одногодичной летальности– 53,2%, а показатели 5-летней выживаемости не превышают 20,2–21,1%, что объясняется высокой запущенностью процесса при первичной диагностике в связи с отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания [Давыдов и соавт, 2009; Чиссов и соавт, 2011]. Известно, что ранняя первичная диагностика любых типов злокачественных опухолей и точное прогнозирование их развития существенно повышают вероятность эффективного лечения. Так, у больных РЖ, диагностированном на I стадии заболевания, 5-летняя выживаемость составляет 69,3–75,5%, а при IV стадии – лишь 5,1–6,4% [Чиссов и соавт, 2011]. В настоящее время в мире не существует скрининговых программ РЖ, а инструментальные методы диагностики РЖ не всегда позволяют распознать заболевание на ранних стадиях, при этом нет общепринятых эффективных молекулярных маркеров ранней диагностики заболевания. Лишь в Японии, где на протяжении нескольких последних декад были внедрены скрининговые программы на основе фото-флюорографии с дальнейшей гастроскопией, удалось в 50% выявлять процесс на ранних стадиях и существенно повысить показатели 5-летней выживаемости [Hamashima et al , 2008].
В мировой клинической практике для послеоперационного мониторинга пациентов c РЖ используется ряд сывороточных маркеров (СА19-9, СА 72-4, РЭА), обладающих умеренной прогностической значимостью примерно лишь для трети всех больных РЖ, однако они имеют высокую перекрестную реактивность и неэффективны для ранней диагностики [Кадагидзе З. Г., Шелепова В. М., 2008]. Данные международной патентной базы США (http://www.uspto.gov) показывают, что за последние 10 лет заявлено всего несколько патентов по диагностике РЖ на основе идентификации новых молекулярных маркеров, однако в клинической практике запатентованные инновации не применяются, вследствие их низкой эффективности. Остается актуальным и поиск новых прогностических маркеров, использование которых могло бы определять показания к объему оперативного вмешательства.
Известно, что 95% всех опухолей желудка представлены аденокарциномами, которые по гистологическому строению подразделяют на интестинальный и диффузный типы, различающиеся по эпидемиологии, характеру клинического течения и прогнозу [Lauren, 1968], а, следовательно, и патогенезу [Rajkumar T et al, 2010, Nobili et al., 2011]. В частности, установлено, что РЖ диффузного типа чаще возникает у молодых пациентов, склонен к более агрессивному течению и более частому метастазированию [Park do Y.et al, 2010].
Хотя большинство генетических повреждений являются общими для указанных гистологических субтипов, все более очевидным становится представление о различиях ключевых генетических перестроек и молекулярного патогенеза, определяющих формирование и прогрессию диффузного и интестинального РЖ [Имянитов Е.Н. 2009, Nobili et al., 2011]. Это указывает на актуальность исследований по планомерному поиску генов, белковые продукты которых могут служить маркерами ранней диагностики и/или прогноза клинического течения РЖ разных гистологических типов.
В последние годы появились сведения, указывающие на потенциальную диагностическую и/или прогностическую значимость некоторых секреторных белков, таких как NF2, NEK6, INHBA, CDH17, PDCD6, SPARC при раке желудка, однако необходимы дальнейшие трансляционные исследования для подтверждения их клинической значимости и определения связи с диффузным или интестинальным типом РЖ [, et al, 2012, , et al, 2011].
Согласно сведениям литературы, достаточно широко для оценки прогноза клинического течения РЖ используется целый ряд иммуногистохимических маркеров апоптоза, пролиферации и клеточной дифференцировки (Ki-67, CDX2, MUC-2, MUC-5, p53, bcl-2) однако следует отметить, что данные различных авторов об информативности маркеров для больных с разными гистотипами РЖ не всегда согласуются между собой [Cletus, 2010, Barros et al, 2011, Kim , 2006, Namikawa, 2010, Sym, 2011, Завьялова М.В. и др., 2012], и исследования в этом направлении остаются актуальными, также как и поиск новых прогностических маркеров.
Известно, что злокачественный фенотип формируется в результате изменения экспрессии патогенетически значимых белков, поэтому выявление ассоциированных с РЖ белков, для которых установлены выраженные количественные изменения в опухоли, их идентификация в опухолевых клетках, с учетом внутриклеточной локализации и взаимодействий друг с другом, позволит получить новые знания о процессах регуляции на разных этапах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. При этом возможно как выявление новых протеиновых молекул, вовлеченных в канцерогенез желудка, так и получение новых сведений о функциональной значимости известных белков.
Методы сравнительной протеомики, открывающие возможность идентификации белковых онкомаркеров, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто различается в опухолях и нормальных тканях. Этот подход основан на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей, идентификации белков с заметно изменённым уровнем экспрессии в опухолях с использованием масс-спектрометрии и последующем отборе секреторных белков по имеющимся базам данных.
Однако результаты исследований, проводимых различными авторами, с целью выявления маркеров ранней диагностики и прогноза, часто являются противоречивыми, а информативность предлагаемых маркеров низка, при этом практически нет «работающих» дифференциальных критериев разных гистологических типов РЖ. В литературе представлено ограниченное число публикаций по идентификации белков с различной концентрацией в нормальной и озлокачествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая вариабельность белков, ассоциированных с РЖ, выявленных в разных исследованиях, что может быть обусловлено как методическими особенностями получения белковых экстрактов из тканей, которые могут сказаться на результатах протеомного анализа, так и популяционными (этническими) отличиями обследованных выборок больных. В целом картина изменения протеома при аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ [Cheng Y., Zhang J., Li Y. et al., 2007, Yoshihara T., et al, 2006, Li et al., 2008, Nobili et al., 2011, Rajikumar et al., 2010, Kosevar et al, 2012].
Выявление различных белков, вовлеченных в механизмы формирования интестинальной или диффузной форм РЖ, различающихся по тяжести клинического течения, позволит, во-первых, проводить раннюю диагностику у лиц групп «высокого онкологического риска», во-вторых, при диагностике на ранних стадиях, когда макроскопически невозможно определить тип опухоли (при наличии ассоциированных с той или иной формой РЖ белковых маркеров) прогнозировать клиническое течение заболевания, и соответственно, дифференцированно подходить к выбору тактики лечения. При благоприятном прогнозе можно оптимизировать объем операции, что позволит уменьшить уровень хирургического и анестезиологического стресса и обеспечить снижение риска осложнений, связанных с расширенным объемом лимфодиссекции.
Актуальность работы обусловлена немногочисленностью и неоднозначностью имеющихся в мировой литературе сведений о молекулярных механизмах формирования и прогрессии РЖ различных гистологических типов, отсутствием внедренных в клиническую практику информативных маркеров ранней диагностики и прогноза течения заболевания.
Цель работы: идентификация потенциальных белковых маркеров, ассоциированных с РЖ, на основе методов протеомного и биоинформатического анализа, и оценка их прогностической значимости.
Основные задачи исследования
-
Поиск и идентификация потенциальных протеомных маркеров РЖ различных гистологических типов на основе метода 2D-электрофореза, с последующим применением метода MALDI-TOF спектрометрирования.
-
Поиск потенциальных прогностических маркеров РЖ биоинформатическими методами с помощью баз данных Oncomine, dbEST, SAGE.
-
Валидация отобранных потенциальных маркеров со стабильным повышением уровня экспрессии методами ПЦР с обратной транскрипцией и вестерн-блот анализа с использованием собственной коллекции образцов опухолей желудка.
-
Исследование локализации ассоциированных с РЖ белков в клетках опухолей диффузного и кишечного типов и оценка связи их экспрессии с клинико-патологическими характеристиками процесса.
-
Исследование связи экспрессии выявленных белков в опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным и кишечным типами РЖ с известными отдаленными результатами лечения.
-
Получение высокочувствительных антител для детекции выявленных белков в биологических образцах, как основы для создания диагностической тест-системы.
Научная новизна
В настоящем исследовании выявлены новые белки, ассоциированные с РЖ, экспрессия и синтез которых стабильно повышены в опухолевой ткани по сравнению с неозлокачествленной слизистой.
С целью повышения эффективности протеомного анализа предложен оригинальный метод получения растворимой фракции минорных (низкокопийных) белков из тканей, позволяющий увеличить разрешающую способность 2D-электрофореза, за счет удаления высококопийных структурных белков.
Впервые проведен сравнительный протеомный анализ опухолей желудка в российской популяции, выявлены потенциальные белковые маркеры, ассоциированные с РЖ.
Идентифицированы белки, уровень экспрессии которых существенно различается в опухолях диффузного и интестинального типа, что свидетельствует об их патогенетическом значении в формировании новообразований разных гистотипов.
Впервые показаны различия в экспрессии цитокина из группы иммунофилинов PPIA в опухолях желудка интестинального и диффузного типов и выявлена связь отсутствия его белковой экспрессии в клетках опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным типом РЖ.
Впервые получены данные о существенном снижении экспрессии гена фермента альдо-кеторедуктазы AKR1B10, вовлеченного в метаболизм ретиноевой кислоты, в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной тканью.
Показана прогностическая значимость экспрессии белка AKR1B10 в отношении гематогенного метастазирования для опухолей желудка интестинального типа.
Научно-практическая значимость
Полученные на основе биоинформатического анализа данные о стабильном повышении целого ряда белков в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной слизистой являются основой для исследования их патогенетической значимости при раке желудка различных гистологических типов.
Полученные в работе данные о различиях в выраженности экспрессии PPIA в опухолях желудка диффузного и интестинального типов и о прогностической значимости экспрессии PPIA для новообразований диффузного типа свидетельствуют о вовлечении указанного цитокина в патогенез РЖ диффузного типа.
Белок PPIA, обладающий прогностической значимостью при раке желудка диффузного типа, может быть внедрен в клиническую практику в качестве дополнительного прогностического маркера.
Полученные поликлональные антитела к белку AKR1B10, для которого показана взаимосвязь с отдаленным метастазированием у больных РЖ интестинального типа, являются основой для создания тест-системы с целью детекции AKR1B10 в качестве прогностического маркера.
Положения, выносимые на защиту:
1. Использование комплексного подхода на основе сравнительного протеомного анализа и биоинформатического поиска позволяет выявить гены/белки, ассоциированные со злокачественными новообразованиями желудка.
2. Сформированная панель потенциальных белковых маркеров в российской популяции больных РЖ является основой для изучения их прогностической значимости и роли в патогенезе РЖ.
3. Идентифицированные белки иммунофиллин PPIA и альдокеторедуктаза AKR1B10 обладают прогностической значимостью для диффузного и интестинального типов РЖ соответственно в отношении гематогенного метастазирования.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на Российско-Тайваньском форуме “Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии” (Томск, 2009), V-VI Региональной конференции молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии” (Томск, 2010, 2011), международной конференции “Опухоль и организм: современные аспекты старой проблемы” (Киев, Украина, 2010), VIII ежегодной международной конференции “Будущее протеомики” (Сан-Франциско, США, 2012), конференции по фундаментальной онкологии “Петровские чтения – 2012” (Санкт-Петербург, 2012).
Работа выполнена при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (08-04-13705-офи_ц, 09-04-99072-р_офи, 09-04-90729-моб_ст), Международного научно-технического центра (#3909), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт №02.740.11.0769 от 12.04.2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 5 журнальных статей в рецензируемых научных журналах и 7 тезисных работ в материалах съездов и конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 18 рисунков.
