Введение к работе
Актуальность проблемы. Фундаментальной проблемой современной экспериментальной онкологии является исследование механизма адаптации опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов, в том числе ингибиторов пролиферации стероидной природы Стероидные гормоны играют исключительно важную роль в регуляции пролиферации нормальных тканей организма, выступая в роли физиологических ингибиторов клеточного деления (глюкокортикоидные гормоны, прогестины) или стимуляторов пролиферации (эстрогены, андрогены) (Берштейн Л М, 2004) Однако не все злокачественные опухоли сохраняют зависимость от гормонов, уровень гормональной зависимости опухолей может существенно снижаться по мере проведения терапии стероидами, приводя в итоге к формированию гормоннезависимых форм Оказалось, что во многих случаях снижение гормональной зависимости опухолей не связано с потерей специфических рецепторов, ответственных за связывание гормона внутри клетки-мишени (Епсагпасюп С A et al, 1993) Что препятствует действию гормонов в таких опухолях, какие факторы могут определять истинный уровень гормональной зависимости опухолей - окончательные ответы на эти вопросы пока не получены
Одним из перспективных направлений экспериментальной онкологии является исследование механизма развития приобретенной резистентности к эстрогенам в клетках рака молочной железы (РМЖ) За последние годы с помощью исследований in vitro выявлено несколько ключевых механизмов, поддерживающих эстрогеннезависимый рост опухолевых клеток активация рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, активация митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и др (Clarke R et al, 2003, Henderson B.E et al, 2003, Ring A et al, 2004) Исследования последних лет показали, что активное участие в регуляции роста и выживаемости опухолевых клеток принимают фосфатидилинозит-3-киназа (PI3K, phosphatidylinositol-3 kinase) и PI3K-зависимые ферментативные системы, под контролем которых находятся важнейшие сигнальные пути клетки.
Поскольку одной из характерных особенностей метаболизма гормон-резистентных клеток является конститутивная, независимая от гормонов,
4 активация митогенных и антиапоптотических сигнальных путей, то особое внимание привлекает возможное участие рецепторов в лиганднезависимои активации таких сигнальных белков Так, было продемонстрировано, что рецепторы стероидов взаимодействуют с регуляторной субъединицей PI3K, стимулируют фосфорилирование и приводят к дополнительной активации белков семейства STAT (signal transducers and activators of transcription) (Bjomstrom L et al., 2002) Описано взаимодействие рецепторов и с некоторыми другими сигнальными белками, включая рецепторы ростовых факторов, NF-kappa В, р53 и др (Nicholson RI et al, 2001, Osborne С К et al, 2001, Sengupta S et al, 2001), но в целом вопрос о значении кооперации между рецептором эстрогенов и митогенными сигнальными путями в развитии гормональной резистентности клеток остается открытым
В этой связи особое внимание исследователей привлекает феномен парадоксальной сенсибилизации гормонрезистентных клеток РМЖ к апоптотическому действию эстрадиола Обнаружено, что при развитии резистентности клеток рака молочной железы к пролиферативному действию эстрадиола и активизации эстрогеннезависимого роста опухолевые клетки могут приобретать чувствительность к апоптотическому действию эстрадиола (Song R X et al, 2003, Liu H et al, 2003, Osipo С et al, 2003, Song R X et al, 2005) Феномен парадоксальной чувствительности к апоптотическому действию эстрадиола, как правило, наблюдается в клетках, длительное время культивированных в бесстероидной среде и/или в присутствии антиэстрогенов in vitro, не чувствительных к пролиферативному действию эстрогенов, но сохранивших высокий уровень экспрессии рецепторов эстрогенов (Song R X et al, 2001, Liu H et al, 2003, Lewis J S et al, 2005) Целый ряд экспериментальных и клинических наблюдений, показавших эффективность эстрогеновой терапии при лечении резистентных форм рака молочной железы, подтверждает возможность сенсибилизации опухолевых клеток к апоптотическому действию эстрадиола in vivo (Lonnmg Р Е et al, 2001, Jordan V С et al, 2003, Song R X et al, 2003, Lewis J S et al, 2005, Osipo С et al, 2005) В целом известные сегодня литературные данные позволяют рассматривать сенсибилизацию клеток к апоптотическому действию эстрогенов в качестве одного из возможных и распространенных вариантов прогрессии опухолей, развивающихся в условиях дефицита эстрогенов и(или) продолжительной терапии антиэстрогеновыми препаратами
Цель работы: исследование природы сигнальных путей, ответственных за поддержание эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы и изучение возможной кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками в процессе развития гормональной резистентности
Задачи исследования:
Выделение и сравнительная характеристика сублиний клеток рака молочной железы MCF-7, полученных в условиях длительного культивирования клеток с антиэстрогеном тамоксифеном (серия MCF-7/T) или в бесстероидной среде (сублиния MCF-7/LS)
Сравнительный анализ активности фосфатидилинозитольного пути и митогенных сигнальных белков в родительской линии MCF-7 и эстрогеннезависимых сублиниях
3 Исследование экспрессии, связывающей способности и
транскрипционной активности рецептора эстрогенов (ER) в клетках MCF-7,
MCF-7/T и MCF-7/LS Значение фосфатидилинозит-3-киназы (РІЗК) в
регуляции активности ER
4 Исследование механизма сенсибилизации эстрогеннезависимых
клеток РМЖ к апоптотическому действию эстрадиола роль NF-kappa В -
сигнального пути
Научная новизна работы. Установлено, что длительное культивирование клеток эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 в присутствии антиэстрогена тамоксифена и/или в бесстероидной среде приводит к формированию эстрогеннезависимой популяции клеток, характеризующейся резистентностью к пролиферативному действию эстрадиола, выраженной активацией эстрогеннезависимых митогенных путей (STAT3, VEGFR2) и, одновременно, парадоксальной чувствительностью к апоптотическому действию эстрадиола Впервые продемонстрировано, что в клетках, чувствительных к апоптотическому действию эстрадиола, последний практически не влияет на содержание рецепторов TNF-R1 и Fas, но существенно подавляет транскрипционную активность NF-kappa В Обнаружено, что в таких клетках на фоне некоторого снижения концентрации и связывающей способности рецепторов эстрогенов резко увеличивается базальная (в отсутствие лиганда) ER-зависимая транскрипционная активность, и продемонстрировано существование взаимной негативной регуляции между ER и NF-kappa В Получены доказательства участия РІЗК в
поддержании лиганд-независимой активации ER В целом результаты работы свидетельствуют, что увеличение базальной транскрипционной активности ER, наряду с сохранением в клетках способности к эстрогензависимому подавлению NF-kappa В, относятся к числу характерных признаков, определяющих сенсибилизацию клеток рака молочной железы к эстроген-индуцированному апоптозу
Научно-практическая значимость работы. Исследование носит экспериментальный характер и направлено на изучение природы сигнальных путей, поддерживающих эстрогеннезависимый рост клеток рака молочной железы Представленные данные демонстрируют, что развитие гормональной резистентности ER-положительных опухолей может сопровождаться изменением активности некоторых про- и антиапоптотических белков и частичной сенсибилизацией клеток к действию проапоптотических соединений Установлено значение транскрипционного фактора NF-kappa В как возможного участника кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками, определяющего чувствительность эстрогеннезависимых клеток РМЖ к действию проапоптотических соединений Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования комбинированного определения активности NF-kappa В, ER и PI3K в качестве дополнительного маркера чувствительности опухолей молочной железы к химио- и гормонотерапии
Апробация работы. Диссертационная работа была доложена 28 сентября 2007 года на совместной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии, механизмов гибели опухолевых клеток, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, генетики опухолевых клеток и биохимии опухолей НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им Н Н.Блохина РАМН
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 9 научных работ
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста, включают 35 графических иллюстраций и схем и 219 ссылок на публикации по теме исследования
