Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современная концепция цервикального канцерогенеза, клинические и молекулярно-генетические аспекты CIN и МРШМ (обзор литературы) 19
1.1 Роль ВПЧ в возникновении и развитии РШМ 23
1.2 Клинически перспективные маркеры прогрессии CIN 28
1.3 Скрининг предрака и рака шейки матки 39
1.4 Клиника и диагностика CIN и МРШМ 43
1.5 Лечение С IN и МРШМ 52
1.6 Наблюдение за больными CIN и МРШМ 57
1.7 Сочетание неопластического процесса с беременностью: особенности и прогноз 60
Глава 2. Материалы и методы 62
Глава 3. Особенности клиники, диагностики и информативности различных методов обследования больных CIN и МРШМ 72
3.1 Клинические характеристики больных CIN и МРШМ 72
3.2 Результаты цитологического обследования больных CIN и МРШМ 81
3.3 Вирусологический статус больных CIN и МРШМ 87
3.4 Информативность расширенной кольпоскопии в диагностике CIN и МРШМ 194
Глава 4. Морфологические особенности CIN и МРШМ, влияющие на эффективность диагностики и лечения 118
4.1 Морфологические ошибки в диагностике степени неоплазии,
сопряженные с видимостью ЗТ шейки матки 119
4.2 Полиморфность поражений при CIN и МРШМ — объективная причина ошибок в диагностике степени цервикальной неоплазии 125
4.3 Вовлеченность цервикальных крипт — объективная причина неполноценности эксцизий и деструкций при CIN и МРШМ 130
Глава 5. Особенности лечения CIN и МРШМ и оценка его эффективности 140
5.1. Дифференциальный подход к лечению легких и тяжелых эпителиальных повреждений 140
5.2. Клинические и технические особенности электрорадиохирургической конизации у больных CIN3/CIS и МРШМ, обеспечивающие эффективность операции 145
5.3 Целесообразность предэксцизионной терапии иммуномодуляторами в комбинированном лечении тяжелых CIN, оцененная по изменению вирусной нагрузки НС2 152
5.4. Результаты наблюдения за больными после лечения. Факторы риска неизлеченности и рецидива CIN и МРШМ 159
5.5. Роль тестирования на ВПЧ высокого канцерогенного риска методами гибридного захвата (НС2) и ПЦР в оценке эффективности
органосохраняющего лечения CIN2-3/CIS и МРШМ 161
Глава 6. Ведение беременных с CIN2-3/CIS и МРШМ 166
Глава 7. Изучение молекулярно-биологических маркеров пролиферации, апоптоза, неоангиогенеза и межклеточных связей (Кл-67, тимидинфосфорилазы, PTEN, VEGF, COX2, е-кадгерина, ламинина-5у2- цепей, коллагена IV типа, Вс1-2, Вах, pakt, ММР-2, ММР-9) при CIN и МРШМ для оценки эффективности их использования в иммуногистохимической панели с целью прогнозирования течения CIN и обнаружения скрытой инвазии 179
Глава 8. Изменения и прогностическое значение сывороточного содержания молекул, играющих роль в формировании иммунного ответа при ВПЧ- ассоциированных CIN и МРШМ: дифференцировочных молекул CD54 (ICAM-1), CD-50 (ICAM-3), CD 18, CD8, CD38, CD95, главного комплекса гистовсовместимости (HLA1) и их ассоциатов 222
Глава 9. Инсулиноподобные факторы роста, связывающие их белки, и эпидермальный фактор роста в сыворотке крови больных CIN, МРШМ и РШМ как перспективные маркеры диагностики и прогрессии цервикальных неоплазий 243
Глава 10. Теломеразная активность как потенциальный маркер прогрессии CIN и варианты сплайсированных форм РНК hTERT 259
Заключение 268
Выводы 277
Практические рекомендации 281
Указатель литературы 285
Приложения 338
- Клиника и диагностика CIN и МРШМ
- Вирусологический статус больных CIN и МРШМ
- Полиморфность поражений при CIN и МРШМ — объективная причина ошибок в диагностике степени цервикальной неоплазии
- Целесообразность предэксцизионной терапии иммуномодуляторами в комбинированном лечении тяжелых CIN, оцененная по изменению вирусной нагрузки НС2
Введение к работе
Актуальность исследования
Рак шейки матки (РШМ) – третье наиболее распространенное злокачественное новообразование среди женщин в мире, первое по частоте – среди женщин 15-39 лет и самая частая причина смерти от онкологических заболеваний в развивающихся странах (Jemal A. et al., 2011).
Предрак шейки матки – цервикальные интраэпителиальные неоплазии (Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN) – инициируются и поддерживаются персистирующей инфекцией, вызванной вирусами папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). CIN предшествуют РШМ на протяжении нескольких лет и даже десятилетий. За столь длительный период они могут быть выявлены и излечены до развития инвазивного рака.
Открытие роли ВПЧ ВКР в возникновении CIN и РШМ кардинально изменило стратегию скрининга и профилактики заболевания (zur Hausen H., 1982, 2002; Stern P., 2008). Тестирование на ВПЧ ВКР в дополнение к цитологическому методу существенно улучшило диагностику, а разработка и применение вакцин против инфицирования ВПЧ 16 и 18 типов внушает надежды на выраженное снижение заболеваемости РШМ (Stern P., 2008; Arbyn et al., 2005, 2006; al., 2008; Cuzick J. et al., 2006, 2008; Harper D., 2010; Heideman D. et al., 2008). Однако, в России вакцинация не имеет широкого распространения из-за высокой стоимости вакцин и консервативных взглядов населения. Заболеваемость РШМ в стране высока (12,9 на 100 000 женщин) и выросла за последние 5 лет на 12,4%, а запущенность составила 39,8% вновь выявленных случаев заболевания (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2011). На стадии CIN и микроинвазивного рака шейки матки (МРШМ) заболевание диагностируется нечасто. Это связано с отсутствием государственной программы организованного скрининга и неполноценным использованием современных его инструментов – тестирования на ВПЧ ВКР – в скрининге оппортунистическом, присутствующем лишь в некоторых центральных регионах.
Частота персистирующей инфекции, вызванной ВПЧ ВКР, крайне высока - от 10 до 20-40% молодых женщин в популяции, а CIN и тем более РШМ развиваются лишь в единичных случаях (Huang C., 2007; Bosch X. et al., 2002). В мире в результате скрининга в 2008г зарегистрировано 300 млн инфицированных ВПЧ высокого и низкого канцерогенного риска и 10 млн CIN3. CIN являются этапами цервикального канцерогенеза: CIN1 (легкая дисплазия), CIN2 (умеренная дисплазия), CIN3 (тяжелая дисплазия и преинвазивный рак, т.е. carcinoma in situ, CIS). На каждом этапе возможна персистенция, прогрессия или регрессия (Tranbaloc P., 2008). Для обозначения относительного риска прогрессии до цервикального рака CIN1 в классической концепции относят к легким повреждениям, а CIN2 и CIN3, включающую CIS – к тяжелым, истинно предраковым повреждениям. В дальнейшем для обозначения тяжелых повреждений будет использоваться термин CIN2-3/CIS.
При CIN1 вероятность регрессии высока (60-70%), а регрессирующие крайне редко CIN2-3/CIS являются облигатным предраком (Shadeo A. et al., 2008; Song S. et al., 2006; Trabanloc P., 2008). Молекулярно-генетические механизмы персистенции, регрессии или прогрессии вплоть до инвазивного рака не до конца исследованы и не ясны.
Для предсказания исхода неоплазии и построения индивидуального прогноза изучается продукция молекулярных маркеров при разных степенях CIN и стадиях РШМ и их экспрессия под влиянием отдельных генов ВПЧ, в основном Е6 и Е7, на этапах вирусного канцерогенеза. Наиболее изученным маркером является p16INK4a, однако данные о других маркерах инициируемой ВПЧ ВКР опухолевой трансформации клеток через различные сигнальные пути часто противоречивы и критериев течения CIN пока не существует (Branca M. et al., 2004, 2008; Cricca M. et al, 2007; Dursun P. et al., 2007; Tsoumpou I. et al., 2009; Valasoulis G. et al, 2011).
Диагностика микроинвазивного рака шейки матки (МРШМ) крайне трудна из-за отсутствия макроскопических признаков опухолевого роста. Обнаружение в сыворотке маркеров инвазии позволило бы диагностировать микроинвазию до операции, однако экспрессия этих маркеров, изучаемая при РШМ, почти не исследовалась при CIN и МРШМ.
В клинической практике часты случаи расхождения результатов цитологических и гистологических исследований, несовпадения гистологических диагнозов у одной больной, недооценки степени эпителиальных повреждений по материалу ограниченных биопсий, повлекшие за собой неправильное ведение пациенток. Нередко в анамнезе больных инвазивным раком обнаруживаются факты неадекватного лечения или наблюдения CIN, а также очевидные ошибки в определении степени неоплазии. Часто отсутствует эффект от деструктивных воздействий.
Не до конца изучены диагностическая ценность расширенной кольпоскопии для предварительной диагностики неоплазии, и причины несовпадения результатов кольпоскопии с цитологическими и гистологическими данными, в частности, значимость отсутствия аномальных кольпоскопических картин при тяжелых повреждениях в цитологических мазках.
В России предлагаемые рекомендации по ведению больных CIN практическими врачами не соблюдаются, а стандартов не существует. Недостаточно изучена эффективность и целесообразность применения иммуномодуляторов с предполагаемым противовирусным действием у больных c CIN1 и в комбинированном лечении CIN2-3/CIS. Неясны критерии выбора между консервативным ведением или деструкцией при CIN1, между деструкцией и петлевой эксцизией зоны трансформации (Large Loop Electrosurgical Excision of the Transformation Zone (LLETZ), Loop Electrosurgical Excision Procedure (LEEP)) при CIN2, между LLETZ и ее более глубоким вариантом – конизацией при CIN3/CIS. Не существует однозначного мнения о достаточности конизации при обнаружении в конусе МРШМ, что особенно важно для молодых пациенток, желающих сохранить фертильность (Mota F., 2003 Smrkolj S. et al., 2012; Takeda N. et al., 2012; Costa S., 2012 Wright J. et al., 2010; Petry K., 2009, Park J. et al., 2007; Rogers L., D., 2009; Jordan J. et al., 2009). Недостаточно разработаны и внедрены критерии оценки эффективности лечения CIN2-3/CIS и МРШМ, в частности, полноценности эксцизии пораженной части шейки матки при наиболее часто выполняемых органосохраняющих операциях.
Поскольку CIS и МРШМ часто встречаются у женщин детородного возраста (Jemal A. et al., 2011; Bosch X et al., 2008), особенные трудности возникают при выявлении заболевания, особенно преинвазивного и микроинвазивного рака, во время беременности. При обнаружении CIN3/CIS беременным в России абсолютное большинство врачей предлагает прервать беременность, что не соответствует мировым стандартам. В России нет адекватных рекомендаций по ведению беременных с впервые выявленным неопластическим процессом шейки матки, особенно с МРШМ.
Молекулярно-генетические, морфологические, иммуногистохимические, вирусологические и клинические исследования ведутся в разных областях, но не составляют целостной картины и не взаимосвязаны. Стройная клинико-морфологическая концепция развития и течения CIN и РШМ, близкая для понимания практических врачей и позволяющая уменьшить число диагностических и тактических ошибок, отсутствует.
Все это позволяет считать актуальным решение проблемы разработки клинико-морфологических и молекулярно-генетических основ диагностики и лечения больных предраком (CIN) и начальными формами РШМ.
Цель исследования
Улучшение эффективности диагностики и лечения CIN, преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки путем разработки клинико-морфологической и молекулярно-биологической концепций их развития и течения.
Задачи исследования:
-
Определить морфологические особенности шейки матки и цервикальных неоплазий, влияющие на информативность диагностики и выбор способа получения материала для адекватной гистологической верификации диагноза.
-
Оценить значение тестирования на ВПЧ ВКР методами гибридного захвата (НС2) и ПЦР в первичной диагностике CIN и МРШМ и в оценке эффективности органосохраняющего лечения.
-
Определить роль и эффективность органосохраняющего лечения в объёме электрорадиохирургической конизации шейки матки для CIN2-3/CIS и МРШМ 1а1 стадии, выявить наиболее частые технические ошибки операции и пути их коррекции.
-
Изучить особенности клинического течения CIN2-3/CIS и МРШМ у беременных и значение консервативного ведения для прогноза заболевания и исхода беременности.
-
Определить по изменению вирусной нагрузки НС2 ВПЧ ВКР эффективность отечественного иммунокорректора «аллокина-альфа» при использовании его в предоперационном режиме в комбинированном лечении CIN2-3/CIS.
-
Оценить прогностическое значение различных онкомаркеров (Ki-67, тимидинфосфорилазы, PTEN, VEGF, COX2, е-кадгерина, Bcl-2, Bax, pAkt, MMP-2, MMP-9, ламинина-52-цепей, коллагена IV типа), а также активности теломеразы в зависимости от ее сплайсированных форм для прогрессии CIN и возможность их использования в тестовой системе диагностики степени повреждений и прогнозирования течения CIN и МРШМ.
-
Исследовать белки семейства инсулиноподобных факторов роста и эпидермального фактора роста в сыворотке больных CIN1-2, МРШМ и инвазивным РШМ для определения их роли в цервикальном канцерогенезе, прогностической и диагностической ценности.
-
Изучить сывороточное содержание дифференцировочных молекул CD54 (ICAM-1), CD-50 (ICAM-3), CD18, CD8, CD38, CD95 и HLA1 , отвечающих за адгезию и эффекторные пути врожденного и приобретенного иммунитета, а также их ассоциатов на различных этапах цервикального канцерогенеза для определения их влияния на патогенез и прогноз течения CIN.
Научная новизна
Впервые на обширном клиническом материале (880 больных CIN1-3 и МРШМ) доказано исключительное значение зоны трансформации (ЗТ) и эндоцервикальных крипт шейки матки, как мишени для поражения ВПЧ ВКР и места возникновения предрака и рака шейки матки, выявлена взаимосвязь анатомических и возрастных особенностей ЗТ с клиническими проявлениями, эффективностью диагностики и лечения CIN и МРШМ.
Впервые показано изменение информативности расширенной кольпоскопии и шансов гиподиагностики тяжелых CIN и МРШМ в зависимости от видимости ЗТ, возраста больных и оценена значимость кольпоскопии для выбора метода получения первичного морфологического материала (ограниченная биопсия, петлевая эксцизия, конизация) и адекватной гистологической верификации диагноза.
Впервые изучена частота сочетания эпителиальных повреждений разной степени, отражающего единый непрерывный процесс канцерогенеза, и выявлена роль полиморфности поражений в гиподиагностике степени неоплазии шейки матки.
Впервые доказана важность вовлеченности эндоцервикальных крипт в неопластический процесс, как основной причины неполного удаления неоплазированного эпителия при петлевых эксцизиях и конизациях и негативного фактора прогноза, оценено значение кольпоскопической диагностики поражения крипт для выбора метода лечения CIN и обосновано предпочтение эксцизионного метода перед деструкцией.
Впервые в России показана роль тестирования на ДНК ВПЧ ВКР методом гибридного захвата в диагностике CIN и МРШМ и его высокая информативность, и необходимость использования в оценке эффективности органосохраняющих операций и наблюдении за больными.
Впервые по изменению вирусной нагрузки HC2 ВПЧ ВКР оценена эффективность предэксцизионного лечения CIN2-3/CIS иммуномодулятором аллокин-альфа, доказана патогенетическая оправданность его применения в консервативном и комбинированном лечении CIN разной степени.
Впервые разработан алгоритм информирования беременных женщин с HSIL и более в мазках и подозрением на CIN2-3, включая CIS, и МРШМ, помогающий женщине принять решение о судьбе ребенка.
Впервые изучена прогностическая и диагностическая роль совокупности 14 маркеров (Ki-67, тимидинфосфорилазы, PTEN, VEGF, COX2, е-кадгерина, ламинина-52, коллагена IV типа, Bcl-2, Bax, pAkt, MMP-2, MMP-9, теломеразы) при CIN и МРШМ для оценки целесообразности их включения в панель тестовой системы с целью уточнения степени повреждений и индивидуального прогнозирования течения CIN.
Впервые в мире исследована присутствие pAkt в тканях шейки матки больных CIN и МРШМ, показана прямая зависимость экспрессии маркера от степени эпителиальных повреждений и его высокая диагностическая и прогностическая ценность.
Впервые на материале собранной автором большой коллекции сывороток от 173 больных CIN и РШМ изучено сывороточное содержание дифференцировочных молекул адгезии, Fas-опосредованного апоптоза, главного комплекса гистосовместимости и других молекул адаптивного иммунитета (CD54, CD50, CD18, CD95, HLAI, CD8, CD38 и их ассоциатов), показано их участие в возникновении неоплазии, выявлен прогностически неблагоприятный вариант сочетания значений маркеров.
Впервые с использованием той же коллекции изучено содержание в сыворотке крови больных CIN и РШМ белков семейства инсулиноподобных факторов роста и EGF и отмечены прогностически неблагоприятные их соотношения и значения.
Впервые оценена взаимосвязь сплайсированных форм мРНК hTERT с экспрессией мРНК hTERT и активностью теломеразы при CIN и МРШМ.
Научно-практическая значимость
Полученные данные значимы для практических врачей: онкологов, акушеров-гинекологов, кольпоскопистов, так как обосновывают и определяют тактику диагностики, лечения и наблюдения больных CIN и МРШМ. Разработана стройная клинико-морфологическая концепция развития и течения CIN и РШМ, позволяющая уменьшить число диагностических и тактических ошибок. Предложены современные алгоритмы диагностики, оценки эффективности лечения и наблюдения за больными CIN и МРШМ с использованием теста гибридного захвата на ДНК ВПЧ ВКР. Раскрыты объективные причины ошибок в определении степени повреждений, влекущих за собой неправильное ведение больных. Предложены критерии выбора метода получения материала для гистологической верификации диагноза во избежание гиподиагностики. Рассмотрены технические особенности и ошибки при выполнении электрорадиохирургической конизации, описаны пути их коррекции. Обоснована целесообразность иммуномодулирующей терапии в комбинированном лечении больных CIN.
Показана безопасность донашивания беременности при CIN3, в том числе преинвазивном раке, и МРШМ.
Созданные автором коллекции образцов тканей шейки матки, взятых под кольпоскопическим контролем, сыворотки и плазмы больных CIN и РШМ, позволили провести комплексный анализ прогностической ценности большой совокупности маркеров для создания тестовых панелей с целью построения индивидуального прогноза CIN. Полученные данные о молекулярно-биологических и иммунологических характеристиках CIN и РШМ задают направления для дальнейших исследований. Некоторые из определенных в тканях шейки матки часто экспрессирующихся маркеров в дальнейшем могут быть использованы как молекулярные мишени для профилактики и лечения РШМ.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Практически все тяжелые CIN2-3, в том числе преинвазивный рак, и МРШМ ассоциированы с ВПЧ ВКР. Чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата теста гибридного захвата (НС2) на ДНК ВПЧ ВКР для диагностики и оценки эффективности лечения CIN2-3/CIS и МРШМ после органосохраняющих операций составляют практически 100% – отрицательный результат теста предсказывает отсутствие тяжелых эпителиальных повреждений шейки матки и неизлеченности. Специфичность и предсказательная ценность положительного результата НС2 выше, чем ПЦР.
-
Тяжелые CIN2-3/CIS и МРШМ развиваются сугубо в зоне трансформации и эндоцервикальных криптах и с возрастом «смещаются» вглубь цервикального канала. Существуют три объективные причины возможной гиподиагностики степени эпителиальных повреждений и снижения эффективности лечения: неполная видимость зоны трансформации с очагами неоплазии, чаще наблюдаемая у женщин старше 35 лет, сочетание неоплазий разной степени у одной больной (71,8% пациенток) и вовлеченность или развитие процесса в эндоцервикальных криптах. С увеличением возраста степень неоплазии увеличивается, а площадь видимых на эктоцервиксе эпителиальных повреждений уменьшается, информативность кольпоскопии и достоверность результатов ограниченных биопсий снижается.
-
Донашивание беременности при CIN2-3/CIS безопасно, риск прогрессии при МРШМ минимален.
-
В тестовую систему для диагностики и построения индивидуального прогноза CIN и МРШМ необходимо включить Е-кадгерин, Ki-67, pAkt, ТФ, VEGF и COX2, предсказание микроинвазии возможно по экспрессии COX2. Включение MMP-2, MMP-9, bax, bcl-2, PTEN, активности TERT также целесообразно для построения индивидуального прогноза, но не для уточнения степени повреждений .
-
IGF-1, IGF-2, IGFBP-3, IGFBP-1, EGF, присутствующие в сыворотке крови больных CIN и РШМ, вовлечены в цервикальный канцерогенез, данные маркеры можно использовать для предсказания скрытой инвазии и прогрессии при CIN3.
-
Дифференцировочные молекулы - CD54, CD50, CD18, CD8, CD38, CD95, молекулы главного комплекса гистосовместимости – HLAI, и их ассоциаты, присутствующие в сыворотке крови больных CIN и РШМ, участвуют в развитии заболевания за счет нарушения активации адаптивного иммунного ответа и имеют прогностическое значение.
-
Активация теломеразного комплекса в виде экспрессии мРНК hTERT в эпителии шейки матки наблюдается уже в начале неопластического процесса во всех случаях CIN и МРШМ, и более чем в образцов прилежащего к CIN условно неизмененного эпителия, но активность теломеразы, как маркера потенциальной прогрессии, выявляют только в половине случаев независимо от степени неоплазии. Активность теломеразы не связана с вариантами сплайсинга мРНК hTERT, ее обнаружение не может служить маркером для определения степени CIN и инвазии, но может выделить больных с неблагоприятным прогнозом.
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения
Результаты работы внедрены и широко используются в работе поликлиники, отделения оперативной, гинекологии и отделения опухолей женской репродуктивной системы ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. В результате обучения автором врачей из регионов на рабочем месте и чтения докладов на множестве значимых международных, общероссийских и региональных конференциях современные алгоритмы диагностики, лечения и оценки его эффективности с использованием метода НС2 ДНК ВПЧ ВКР внедрены в клиниках Москвы, Приморского Края, г.Ташкента. Результаты исследований активно внедряются в лекциях, читаемых автором при обучении и повышении квалификации врачей в РМАПО.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2012 года на научно-практической конференции ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН с участием поликлиники , отделения гинекологии, отделения опухолей женской репродуктивной системы, патологоанатомического отделения, лаборатории клинической цитологии, НИИ клинической онкологии; отделения по внедрению и оценке эффективности методов профилактики опухолей, лаборатории молекулярной биологии вирусов, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборатории вирусного канцерогенеза, лаборатории иммунологии онкогенных вирусов НИИ канцерогенеза; лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории комбинированной терапии опухолей, лаборатории биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза НИИ ЭДиТО.
Результаты работы доложены на Российской конференции по онкогинекологии (Москва, 8-9 апреля 2009 г), (Белград, Сербия 11-14 октября 2009 г), XIII Российском Онкологическом Конгрессе (Москва, 19 ноября 2009 г), IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 18-21 января 2010 г), Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты» (Москва, 29 марта – 2 апреля 2010 г), Ташкентском международном форуме по раку молочной железы (Ташкент, 14-15 мая 2010), IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Н.Новгород, 18-19 мая 2010 г), X, XI и XII Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2010, 2011, 2012гг), V и VI Международных конгрессах по репродуктивной медицине, (Москва, 2011, 2012гг), Х Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011 г), II научно-практической конференции «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2011 г), XIV международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 6-9 июня 2011 г), заседании общества онкологов №546 (Москва, 27 марта 2008 г), Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология – практическому здравоохранению» (Москва, 20-21 февраля 2012 г), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика – в эпицентре женского здоровья» (Москва, 20-23 марта 2012 г), конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010 г), заседании московского общества онкологов (Москва, 29 марта 2012 г), конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2012» (Санкт-Петербург, 20 апреля 2012 г), научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания женской репродуктивной системы в практике врача акушера-гинеколога», (Москва, 13 июня 2012 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 научных работ, из них 21 статья - в журналах, рецензируемых ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 432 источника, из них 60 отечественных и 372 зарубежных. Работа иллюстрирована 74 таблицами, 87 рисунками.
Клиника и диагностика CIN и МРШМ
Присутствие ВПЧ ВКР в образцах рака шейки матки и CIN2-3 составляет, по данным разных авторов от 96,4% до 99,7% [25,94,96, 222,234, 304, 357, 385, 404]. Исследование блоков патологоанатомических архивов с 1920 по 2005г. установило неизменность участия ВПЧ ВКР и 16 и 18 типов ВПЧ в развитии РШМ как в начале XX, так и XXI века [357]. ВПЧ- независимые формы РШМ встречаются исключительно редко (0,3%), представлены в основном светлоклеточной и эндометриоидной аденокарциномой [22, 234].
Несмотря на то, что инфицируются ВПЧ ВКР 30-40% подростков и молодых женщин до 30 лет, только у 10% из них возникает персистирующая в течении многих лет и десятилетий ВПЧ-инфекция, [47, 357], и лишь у единиц развиваются CIN2-3/CIS и инвазивный рак [96]. Факторы, способствующие персистенции и появлению повреждений, недостаточно ясны. К негативным факторам относят раннее начало половой жизни, частую смену половых партнеров, курение [22,39,40,47,169,326], длительное использование оральных контрацептивов, иммунодефицит [242], дисбаланс ИЛ и ФНО в тканях шейки матки и эндоцервикальной слизи [9], низкий социально-экономический статус, дефицит микронутриентов [300, 380], наличие других ИППП [48, 117].
Недостаточно изучена генетическая предрасположенность к персистенции ВПЧ и развитию РШМ, но имеются данные об особенностях генотипа больных РШМ, таких как: вставки нуклеотидов в хромосомах 1 q, 3q и 20q и утраты в 2q, 3q, 4q, 6q, 11 q и 13q [66,216,392,413], хромосомные аномалии в Зр12, 4q25, 5q 15 и q21,18р 11 [128], 6q [10,29], 3q26 [361]; специфические аллели HLA [11,12], определенные гаплотипы и полиморфизм генов р53, GSTT1, CYP1A1, и CYP2E1 [210], ИЛ-1 А [169], ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-10 [11,12] и Fas [429], инактивация гена TSLC1 [355]. Изучается профиль метилирования генов при CIN и РШМ [40, 412, 413].
Наиболее распространены 16 и 18 типы ВПЧ - они встречаются более чем в 60-70% случаев CIN и РШМ [14,45,95,132,357]. При аденокарциноме ассоциацию с 18 типом ВПЧ наблюдают в 36,2%, что в три раза чаще, чем при плоскоклеточном раке [183,343].
Так как практически все РШМ ассоциированы с ВПЧ ВКР, для первичной профилактики заболевания разработаны и успешно внедряются в практику вакцины против инфицирования ВПЧ - квадривалентная (Gardasil, против наиболее часто встречающихся 16,18,6,11 типов) и бивалентная (Cervarix, против 16,18 типов). В когортных исследованиях продемонстрированавысокая эффективность вакцин против инфицирования ВПЧ соответствующих типов и для предупреждения CIN [32,166,174,183,198,218,357,411]. По заявлению Харальда цур Хаузена ожидаемое от вакцинации снижение заболеваемости при широком охвате населения составит 70-80%. По данным же эмпирически калиброванного микросимуляционного моделирования, проведенного Goldhaber-Feibert и соавт. (2008), возможно снижение риска РШМ на 36% при условии повсеместного вакцинирования детей предпубертатного возраста и продолжении текущих скрининговых программ с полным охватом населения. В третьей фазе двойного рандомизированного контролируемого исследования применения бивалентной вакцины против 16 и 18 типов ВПЧ все же наблюдались случаи CIN2-3, в том числе вызванные 16 и 18 типом, а также случаи непосредственного инфицирования [174,291]. Аналогичные результаты получены в плацебо-контролируемом исследовании FUTURE I и II [198]. Следует обратить внимание, что 30% РШМ вызываются типами ВПЧ ВКР, не входящими в вакцину (т.е. не 16 и 18). При этом отмечен эффект перекрестной иммунизации, хотя и неполной, с 31,33,35 и 45 типами ВПЧ [411, 381], что дает надежду на дополнительное снижение заболеваемости. Для оценки влияния вакцинации на заболеваемость РШМ необходимы 3-5 десятилетий и широкий охват населения, чему пока препятствует высокая стоимость вакцин [166,175,218].
Поскольку полный охват населения труднодостижим, и вакцины малоэффективны у женщин, уже имеющих ВПЧ-инфекцию, скрининг и лечение CIN и РШМ в обозримом будущем останутся насущной необходимостью [175,218].
Молекулярно-генетические механизмы с участием ранних генов ВПЧ Е6 и Е7, роль их продуктов в диагностике и оценке прогноза
Все типы ВПЧ имеют сходную генетическую структуру, их ДНК содержит две группы генов: ранние (El, Е2, Е4, Е5, Е6, Е7), кодирующие функциональные белки, и поздние (L1,L2), кодирующих структурные белки оболочки вириона [54,378]. Роль основных вирусных белков - продуктов ранних генов ВПЧ ВКР - в опухолевой трансформации эпителия шейки матки кратко представлена в таблице 2 [193].
Процесс инфицирования ВПЧ в литературе традиционно описывается так: вирус проникает в стволовые клетки базального слоя плоскоэпителиального пласта через микротравмы и участки воспаления. Репликация и образование вирионов происходит по мере дифференцировки клеток и перемещения их в верхние слои, где вирус собирает капсид, и в процессе отшелушивания высвобождаются вирионы [154].
На этапе продуктивной ВПЧ ВКР-инфекции, до развития CIN2-3, существует баланс экспрессий ранних вирусных генов Е2, Е4, Е6 и ,Е7, регулируемый по принципу обратной связи и обеспечивающий завершение жизненного цикла вируса с образованием и выходом вирионов. Белок Е2 ВПЧ 16 типа является регуляторным протеином, незаменимым для создания оптимальных условий персистенции инфекции и адекватного завершения жизненного цикла вируса [20, 54].
Вирусологический статус больных CIN и МРШМ
Однако оба эти метода недостаточно чувствительны для обнаружения неизлеченности или рецидива CIN [258], частота которых составляет 15% , варьируя, по данным разных авторов, от 1,9 до 66,8% [136,152,236,238,374]. Надежность цитологического метода для выявления рецидива невысока, особенно в первые 3-6 месяцев наблюдения, когда часты ложноположительные результаты [116,369]. Verguts с соавт.(2006) выявили, что даже при положительном ВПЧ-тесте через 3-6 месяцев после конизации наличие патологических изменений в мазках ( ASCUS) не всегда является признаком рецидива CIN - он подтверждается лишь у 50% женщин с аномальными мазками.
После конизации вероятность неизлеченности или рецидива CIN2-3 составляет 5—28,8% [173,257,362,376]. Средний срок до повторной манифестации заболевания составляет 9-10 месяцев (от 3 до 23) [69,116]. При этом в течение первого года наблюдения после конизации по поводу CIN3 вероятность рецидива составляет от 5,8% до 15% [145,148,298].
Предикторами неизлеченности и рецидива CIN после органосохраняющих операций являются аномальные цитологические мазки, позитивный ВПЧ-тест [33, 75, 196, 293], вирусная нагрузка до лечения более 300 RLU [294], наличие неоплазии в краях резецированного конуса [69, 106, 136, 152, 194, 196], наличие CIN в соскобе эндоцервикса [196; 235], вовлечение эндоцервикальных крипт [33, 152, 136,194, 340], иммунодефицит [342], обширность поражения [303], возраст больных старше 40 лет [196,327, 340, 400], курение и количество половых партнеров более четырех [340].
В ходе хирургического лечения возможно неполное иссечение участков CIN как со стороны эктоцервикса, так и со стороны эндоцервикса. Положительный край резекции - гистологически определяемая неоплазия в крае резецированной ЗТ или конуса - по данным разных авторов, встречается в 5-48% [134, 294, 303, 363], причем значительно чаще со стороны эндоцервикса из-за невозможности визуального контроля. По некоторым данным, определенную роль в прогнозе играет не только наличие, но и степень CIN в крае резекции [167,219]. И все же рецидив при положительном крае резекции развивается не всегда, а лишь у каждой 3—4 больной [294, 303]. Тем не менее, большинство авторов считают положительный край резекции чрезвычайно серьезным фактором риска прогрессии до инвазивного рака, особенно при поражении эндоцервикального края, и предлагают в этих случаях реконизацию [81, 85, 194, 196].
Гистерэктомия не рекомендуется не только в качестве первичного вмешательства, но и при положительном крае резекции конуса [298]. Так, Kim et а! (2007) при выполнении гистерэктомии больным с положительным краем резекции не обнаружили остатков заболевания у 35% пациенток.
Другим важным негативным прогностическим фактором, даже более значимым, чем признаки CIN в крае резекции, является положительный ВПЧ-тест [78,293,315]. Признаки персистенции ВПЧ ВКР после конизации сохраняются у 17,6-45,6% пациенток [278,211,293], риск рецидива у них многократно выше - 36% против 2% больных с отрицательным ВПЧ-тестом после конизации [293].
Наибольшую прогностическую ценность после конизации имеют результаты НС2-теста: прогностическая ценность отрицательного результата — 100%, то есть отрицательный НС2 после конизации является гарантией успеха лечения CIN [33,176,194,213,303,327,400]. При развитии рецидива CIN2-3 показана повторная эксцизия, допустима гистерэктомия.
Чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата сочетания цитологического метода и ВПЧ теста приближаются к 100%. При негативных результатах обоих тестов пациентку можно отнести к группе низкого риска, в то время как больные с положительными результатами должны быть отнесены к группе высокого риска и наблюдаться более интенсивно и длительно [33, 78].
Несмотря на многочисленные исследования роли различных факторов прогрессии CIN, до сих пор не разработаны единые методические рекомендации, определяющие оптимальные сроки и методы наблюдения, а также дальнейшее ведение больных из групп повышенного риска рецидива. Однако в целом, большинство авторов, в связи с тем, что рецидив развивается нечасто, склонны к наблюдению подобных пациенток, а не к немедленному хирургическому лечению. Стандарты ведения могут быть разработаны лишь при дальнейших исследованиях по этому вопросу, включающих очень большое число наблюдений.
CIN2-3, в том числе преинвазивный рак и МРШМ - заболевание молодых женщин с длительностью течения 8-10 лет и более, а потому часто и закономерно сочетающееся с беременностями [52,53,205,333,359]. При обнаружении инвазивного рака в течение двух лет после родов его также следует отнести к опухолям, ассоциированным с беременностью, так как он почти наверняка существовал и на момент вынашивания, и не был своевременно диагностированы из-за недостаточно высокой чувствительности цитологического метода. CIN, как этапы развития РШМ, выявляют у 1% беременных [317, 359], а аномальные картины в мазках - у 5% [71].
Интересно, что согласно Европейским рекомендациям, при отсутствии цитологических аномалий в мазках за посление 5 лет, у беременной исследование допустимо не повторять [196]. В Европе и США медицинским сообществом при аномалиях в мазках, CIN и МРШМ рекомендуется донашивание беременности [52,53,71,88,196,395,402]. При обнаружении в мазках ASCUS и LSIL и исключении кольпоскопически CIN2-3 больные во время беременности не наблюдаются, контрольное обследование проводят через 3-4 месяца после родов. При подозрении на CIN2-3 и HSIL в мазках показано наблюдение каждые 3 месяца, биопсию и лечение откладывают на послеродовый период. Во время беременности биопсию выполняют только при подозрении на инвазивный процесс [146,196]. Ограниченная биопсия не всегда позволяет исключить инвазию, поэтому предпочтительнее выполнить конусовидную биопсию в условиях специального учреждения [196, 331]. Большинство авторов единодушны в том, что донашивание беременности не влияет на прогноз заболевания и риск прогрессии СШЗ и МРШМ минимален [61,71,196,335,367]. СПЧ2-3, включая преинвазивный рак, не требуют немедленного лечения на фоне беременности, и конизация может быть отложена на послеродовый период [52,53,146,335]. Терапевтический результат конизации или петлевой эксцизии на фоне беременности не всегда полноценен, так как глубина данных манипуляций ограничена - примерно у половины больных имеются остаточные повреждения [317,333].
Полиморфность поражений при CIN и МРШМ — объективная причина ошибок в диагностике степени цервикальной неоплазии
Как видно из предложенного видеоряда по мере увеличения степени неоплазии увеличивается толщина АБЭ, картины, отражающие межсосочковое расстояние и сосудистую сеть внутри сосочков, становятся все причудливее и грубее. Реакция на уксусную кислоту представляет собой результат нарушения протеомного состава неоплазированных клеток - чем больше степень CIN, тем «толще» АБЭ, быстрее и длительнее реакция на уксусную кислоту, временно денатурирующую соответствующие белки. Нами обнаружено линейное увеличение частоты выявления толстого АБЭ при увеличении тяжести заболевания (р=0,00001) с 8,6% при CIN1 до 92,9% при МРШМ, и соответственное снижение частоты выявления тонкого АБЭ.
Нами обнаружена также прямая зависимость между площадью поражения и толщиной АБЭ при ЗТ I типа (р = 0,0001). Тонкий АБЭ, характерный для слабых повреждений (CIN1 и некоторых CIN2), как правило, ассоциирован с меньшей площадью поражения, средняя площадь АБЭ умеренной толщины и толстого увеличивается. Наибольшая площадь поражения характерна для АБЭ различной толщины. Участки АБЭ различной толщины, по-видимому, соответствуют наличию опухолевых клонов разной агрессивности, возникших в разное время и занимающих все большие территории. Это отражает естественное прогредиентное течение неопластического процесса, свидетельствует о его давности и сосуществовании CIN разной степени на одной шейке при наличии обширной эктопии на момент инфицирования.
АБЭ умеренной толщины может встречаться как при CIN тяжелой степени, так и при CIN1 и незрелой метаплазии. Для дифференциальной кольпоскопической диагностики этих повреждений принципиально наличие йод-позитивных «вкраплений» на йод-негативном фоне, являющихся благоприятным прогностическим фактором (рис.21). Этот признак встречается при CIN1, кондиломах шейки и незрелой метаплазии и свидетельствует о «вызревании» эпителия. При АБЭ умеренной толщины с отсутствием йод-позитивных участков и положительном НС2-тесте во избежание гиподиагностики тяжелых повреждений следует предпочесть ограниченной биопсии петлевую эксцизию измененного эпителия. Рисунок 21 — Йод-позитивные вкрапления, определяемые при пробе
Шиллера, при АБЭ умеренной толщины с пунктуацией у больной CIN1 Комплексы размножившихся неоплазированных клеток, расположенные между акантотическими сосочками дермы, раздвигают сосочки, увеличивая межсосочковые расстояния, нарушают регулярность расположения сосочков и понуждают к образованию новой сосудистой сети в виде горизонтальных сосудов в сосочковом слое, необходимых для питания растущей массы неоплазированного эпителия. Именно горизонтальные сосуды формируют мозаику, а видимые в верхушках сосочков сосудистые петли - пунктуацию. Описанные процессы отражаются в кольпоскопических характеристиках - чем выше степень неоплазии, тем больше и нерегулярней межсосочковые расстояния, грубее мозаика и пунктуация. Частота обнаружения пунктуации оказалась не связанной с площадью поражения (р=0,3), однако коррелировала с толщиной АБЭ (при толстом АБЭ грубую пунктуацию обнаруживали в 38%, тогда как при тонком АБЭ только в 6,4% случаев, р=0,00001) и с тяжестью заболевания (частота обнаружения возрастала с 7,8% при CIN1 до 35-47% при CIN3 и преинвазивном раке, р = 0.0001). Частота выявления мозаики (как нежной, так и грубой) росла с 40% до 62,5% от CIN1 к МРШМ. Грубая мозаика выявлялась значимо чаще по мере усилении тяжести заболевания (с 17% до 106 62,5%, р=0,0001). При МРШМ грубая мозаика встречалась у всех больных. Частота выявления грубой мозаики при наличии сосочков была выше в 14,9 раза (р=0,007). Оба признака являются неблагоприятными прогностическими факторами, предсказывающими повреждения тяжелой степени.
Частота выявления пластов, гребней и сосочков толстого АБЭ, формирующихся при наибольшей пролиферативной активности иммортализованного эпителия, возрастает при увеличении тяжести заболевания от СШ1 к МРШМ - с 25% до 67% (р=0,0006). Эти признаки, таким образом, являются неблагоприятным прогностическим фактором и чаще всего встречаются при СІЮ/СІБ и более, их необходимо указывать отдельным пунктом в кольпоскопическом протоколе.
С увеличением степени неоплазии возрастает частота кольпоскопических признаков вовлечения эктоцервикальных крипт в неопластический процесс. Максимальная выраженность этого симптома на эктоцервиксе представляет собой множество крипт с «погружающимся» в них АБЭ на фоне пластов толстого АБЭ - картина напоминает «дрожжевой блин» (рис. 22). Частота этого симптома увеличивалась практически в три раза от СІШ к инвазивному раку (от 2,59 до 8,39%, р=0,03). Возможность кольпоскопической оценки состояния крипт у женщин старше 50 лет из-за ограничения видимости ЗТ практически отсутствовала, в то время как гистологически поражение крипт определялось у абсолютного большинства больных (81,4%) этой возрастной группы.
Кроме обычных кольпоскопических протоколов, для 503 больных у нас имелся видеоряд кольпоскопических картин при разном увеличении, дающий возможность измерить относительную площадь поражения на зафиксированных снимках (с помощью ПО Ьеіьесар), вплоть до изъятия из общей площади поражения площади участков банальной эктопии. Таким образом, мы могли ретроспективно сравнить информативность кольпоскопии при разных размерах поражения эктоцервикса и видимости ЗТ, исходя из известного окончательного морфологического диагноза.
Целесообразность предэксцизионной терапии иммуномодуляторами в комбинированном лечении тяжелых CIN, оцененная по изменению вирусной нагрузки НС2
В случае обнаружения у беременной HSIL, клеток рака или подозрении на них в мазках с шейки матки при отсутствии видимой опухоли не следует настаивать на прерывании беременности даже в первом триместре. При исследовании мазков и кольпоскопии у беременных возможна гипердиагностика предполагаемой степени эпителиальной неоплазии. Окончательная степень повреждений может быть определена только по результатам гистологического исследования, которое при отсутствии подозрении на микроинвазию, может быть выполнено и после родов. Ограниченные биопсии под кольпоскопическим контролем наиболее просты в исполнении и не сопровождаются осложнениями, а лишь незначительной скоропреходящей кровоточивостью, могут применяться при уточнении степени CIN. При подозрении на микроинвазию ее с наибольшей долей вероятности можно исключить с помощью LLETZ. Неглубокая, с осторожностью выполненная LLETZ хорошо переносится в первом триместре беременности, безопасна, и может иметь полный терапевтический эффект, вероятность которого увеличивается из-за гравидарной эктопии и сопряженного с ней обнажения невидимой части ЗТ с очагами CIN.
При выявлении в первом триместре беременности тяжелых эпителиальных повреждений, в том числе не позволяющих исключить РШМ, многие практические врачи неадекватно и безальтернативно настаивают на прерывании беременности. Решение о судьбе беременности пациентка должна принимать при условии информированности об отсутствии негативного влиянии донашивания беременности на исход заболевания и плод. Нами рекомендован следующий алгоритм беседы с беременными больными с подозрением на CIN2-3/CIS и МРШМ, который может быть использован практическими врачами в достижении согласия с больной и принятия правильного решения о донашивании беременности. Эти данные следует включить в протокол информированного согласия.
Абсолютное большинство пациенток, информированное подобным образом, принимают решение о донашивании беременности, что видно по результатам нашего исследования. Глава 7. Изучение молекулярно-биологических маркеров пролиферации, апоптоза, неоангиогенеза и межклеточных связей (Ki-67, тимидинфосфорилазы, PTEN, VEGF, СОХ2, е- кадгерина, ламинина-5у2-цепей, коллагена IV типа, Вс1-2, Вах, pAkt, ММР-2, ММР-9) при CIN и МРШМ для оценки эффективности их использования в иммуногистохимической панели с целью прогнозирования течения CIN и обнаружения скрытой инвазии
Переход продуктивной ВПЧ-инфекции в трансформирующую сопровождается нарушением процессов пролиферации, апоптоза, нарушением межклеточных связей, иммортализацией клеток, активацией неоангиогенеза в эпителии ЗТ, что находит свое отражение в иммуногистохимически изменениях выработки белковых продуктов сигнальных путей, задействованных в этих нарушениях.
С целью определения эффективности и целесообразности использования этих продуктов в иммуногистохимической панели для оценки степени повреждений, прогноза течения и предсказания скрытой инвазии нами исследована экспрессия 13 молекулярно-биологических маркеров в образцах CIN разной степени, МРШМ и «нормального эпителия» с признаками ВПЧ-инфекции. Результаты экспрессии по степеням повреждений представлены в таблице 27. Таблица — 27 Экспрессия молекулярно-биологических маркеров в образцах СЕЧ, МРШМ и «нормального эпителия» с ВПЧ
СтепеньповрежденияМаркер Случаи с экспрессией, п (%) Общий характер изменений Перемещение в вышележащие слои Е-кадгерин играет важную роль в поддержании межклеточных связей, нормальной адгезии эпителиальных клеток и подавляет инвазию опухолей. Нами экспрессия Е-кадгерина наблюдалась на мембране эпителиальных клеток. На рисунке 41 показаны типичные примеры экспрессии Е-кадгерина в «нормальном эпителии» и при CIN различной степени. В таблицах 28 и 29 представлены обобщенные данные об экспрессии Е-кадгерина в исследованных образцах CIN, МРШМ и «нормального эпителия» с признаками ВПЧ-инфекции. обнаружена во всех образцах. Е-кадгерин положительные клетки локализовались преимущественно в базальном и парабазальном слоях эпителия, окрашивание в основном высокой интенсивности, за исключением двух случаев CIN1. Средний балл по Hscore составил 186±90 в нормальном эпителии и 120±68 при CIN1. Рисунок 41 Микрофотографии (хЮО) срезов условно нормальной ткани шейки матки (А) и CIN 1-3 (Б-Г). ИГХ окрашивание антителами к е-кадгерину, докрашивание гематоксилином.
![Улчшение результатов комплексного лечения местнораспространенного рака шейки матки [Электронный ресурс]](/i/i/4414/200428.png "Улчшение результатов комплексного лечения местнораспространенного рака шейки матки [Электронный ресурс] Югай Константин Викторович")