Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы Опухолевая контаминация гемопоэтических продуктов — важная проблема аутотраисплантации и высокодозной химиотерапии у онкологических больных
1.1. Высокодозная химиотерапия 12
1.2 Аутотрансплантация стволовых клеток крови 15
1.3. Мобилизация стволовых гемопоэтических клеток 16
1.4. Особенности протоколов мобилизации СГК при ВХТ 19
1.5. Определение СГК с помощью экспрессии CD34 20
1.6. Резидуальные опухолевые клетки в костном мозге и периферической крови 22
1.7. Методы выявления резидуальных опухолевых клеток 23
1.8. Методы молекулярной биологии для выявления рсзидуальных опухолевых клеток 24
1.9. Иммунодиагностика опухолей человека 26
1.10. Характеристики МКАТ, предназначенных для очистки трансплантата 30
1.11. Очистка с помощью опосредованного комплементом лизиса 31
1.12. Очистка с помощью иммунотоксинов 33
1.13. Очистка с применением иммуномагнитных микросфер 34
1.14. Положительный отбор гемопоэтических клеток как альтернативный метод очистки 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Отбор пациенток для исследования 39
2.2. Сбор ПСК 39
2.3. Получение образцов КМ и ПСК от больных РМЖ 40
2.4. Получение образцов ПСК от доноров без онкопатологии 41
2.5. Проведение курсов ВХТ 41
2.6. Оценка реакции на проводимую терапию 42
2.7. Получение фракции мононуклеаров 42
2.8. Стандартный иммуноцитохимический анализ (ИЦА) 43
2.9. Селекция клеток, экспрессирующих CD34 45
2.10. Иммуноцитохимический анализ с иммунным обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ) 45
2.10.1. Построение стандартных кривых анализа 48
2.11. Исследование клоногенного роста резидуальных опухолевых клеток in vitro 48
2 1 1.1. Идентификация колоний опухолевых клеток 49
2.12. Статистический анализ 49
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3,1. Исследование факторов, влияющих їй контаминацию продуктов гемопоэтических стволовых клеток у больных метастатическим раком молочной железы.51
3.11 Частота контаминации образцов ПСК и костного мозга 52
3.12 Исследование ассоциации между контаминацией костного мозга и контаминацией образцов ПСК 52
3.13 Исследование влияния схемы мобилизационной терапии на контаминацию образцов ПСК 52
3.14 Исследование влияния количества процедур лейкафереза на частоту контаминации образцов ПСК 55
3.1.5 Исследование контаминации образцов ПСК в зависимости от типа мобилизации у больных РМЖ с частичной и полной ремиссией 57
3.2. Опухолевая контаминация ПСК как фактор прогноза выживаемости без прогрессирования болезни и полной выживаемости больных РМЖ 58
3.2.1. Мультивариантный анализ взаимозависимости факторов прогноза 60
3.3. Исследование клоно ген ного роста опухолевых клеток-контаминант 62
3.4. Характеристика нового метода детекции опухолевых клеток в образцах ПСК: имму но цитохимического анализа с этапом иммунного обогащения на магнитных микросферах 64
3.4.1. Отработка и характеристика метода ИЦА с обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ) 64
3.5. Исследование эффективности очистки продуктов ПСК от остаточных клеток рака молочной железы в результате позитивной селекции клеток на экспрессию CD34 61
3.5.1. Определение контаминации продуктов лейкафереза клетками РМЖ с помощью стандартного ИЦА 70
3.5.2. Определение контаминации продуктов лейкафереза клетками РМЖ с помощью ИЦА-ОММ 71
3.5.3. Количество опухолевых клеток в продуктах лейкафереза до селекции на CD34 как фактор прогноза контаминации СВ34-позитивных фракций 73
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 75
Выводы 86
Список литературы 87
- Высокодозная химиотерапия
- Иммунодиагностика опухолей человека
- Иммуноцитохимический анализ с иммунным обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ)
- Исследование влияния схемы мобилизационной терапии на контаминацию образцов ПСК
Введение к работе
Несмотря на некоторые позитивные сдвиги в ранней диагностике рака молочной железы (РМЖ) благодаря все более широкому применению маммографии, абсолютное число больных с запущенными формами заболевания (стадия HIb-IV) увеличивается как в России и странах СНГ, так и в большинстве государств Западной и Центральной Европы. В США удельный вес таких пациенток заметно снизился в связи с проведением широкомасштабного скрининга этого заболевания. Однако, и в этой стране абсолютное число больных РМЖ с поздними стадиями остается большим из-за высокой и неуклонно нарастающей заболеваемости, которая в 2.5 раза превышает российские показатели [Моисеенко с соавт., (стр.5)]. Хотя комбинированная химиотерапия пациенток на поздних стадиях РМЖ часто позволяет отсрочить прогрессию заболевания, в конечном итоге у них развиваются рецидивы, приводящие к летальному исходу. В связи с этим, весьма актуальна разработка новых, более эффективных методов лечения больных РМЖ на поздних стадиях заболевания. Одной из разработок в данном направлении является лечение высокими дозами химиопрспаратов (высокодозная химиотерапия, ВХТ). Применение ВХТ для лечения больных РМЖ не дало столь яркого эффекта, как при лечении гемобластозов и некоторых быстрорастущих солидных опухолей человека, в частности, нейробластомы [Моисеенко с соавт. (стр. 98), Stadmauer с соавт., Peters с соавт., Cramp с соавт., Hartmann с соавт., Stram с соавт.]. Однако, в целом ряде работ отмечается действенность ВХТ при лечении больных РМЖ с ограниченным метастатическим поражением и хорошим ответом на индукционную химиотерапию [Shpall с соавт., Rowlings РА с соавт., Berry DA с соавт,]. Кроме того, этот вид лечения иногда проводится даже с адъюваптной целью у больных РМЖ, имеющих высокий риск возникновения рецидива [Моисеенко с соавт. (стр. 128)].
Угнетение гемопоэза, обусловленное применением высоких доз цитостатиков, можно компенсировать инфузией аллогенных либо аутологичных клеток костного мозга (КМ) или стволовых клеток из периферической крови (периферических стволовых клеток, ПСК). Трансплантация аутологичных гемопоэтических клеток имеет несколько потенциальных преимуществ по сравнению с аллогеннои трансплантацией: нет необходимости в наличии гистосовместимого донора, отсутствует риск развития реакции «трансплантат против хозяина». Таким образом, использование аутотрансплантатов более безопасно. Главным препятствием к применению аутотрансплантатов с целью восстановления гемопоэза после ВХТ является их частая контаминация опухолевыми клетками. Реипфузия таких клеток потенциально способна привести к возникновению рецидива заболевания. Чтобы минимизировать этот эффект, костный мозг либо ПСК стараются забирать у пациентки на стадии полной ремиссии, когда доказательства контаминации костного мозга или стволовых клеток из периферической крови отсутствуют. Другим возможным решением этой проблемы является удаление из трансплантатов злокачественных клеток-контаминант без нарушения функции клеток-предшественниц гемопоэза, так называемая «очистка». Для того чтобы выявить опухолевые клетки в гемопоэтических продуктах, а также оценить эффективность очистки аутотрансплантатов, необходимо иметь в распоряжении достаточно чувствительные методы детекции таких опухолевых клеток-контаминант. В настоящее время существует несколько методов выявления остаточных опухолевых клеток, у каждого из которых есть свои преимущества и недостатки (более подробно это будет описано в литературном обзоре). Необходимо подчеркнуть, однако, что целесообразность применения того или иного метода обнаружения остаточных опухолевых клеток напрямую связана с клиническими, морфологическими и молекулярно-генетическими особенностями конкретного новообразования и требует проведения тщательных исследований.
7 Другой важной проблемой, связанной с проведением аутотрансплантации
гемопоэтических тканей онкоболышх, является выбор источника аутотрансплантата:
либо костный мозг, либо стволовые клетки из периферической крови (периферические
стволовые клетки, ГТСК). Если в начале 90-х годов прошлого века преимущество
отдавалось аутотрансплантации костного мозга (КМ), то к концу 90-х годов в
подавляющем большинстве случаев стали использовать только ПСК. Это обусловлено
целым рядом преимуществ, которые имеют ПСК как источник стволовых клеток по
сравнению с КМ. (Эти преимущества будут описаны в главе «Обзор литературы»).
Однако, концентрация ПСК в периферической крови чрезвычайно низка. Существенно
увеличить количество и качество ПСК в продуктах лейкафереза удалось благодаря
введению в практику мобилизационной терапии. В настоящее время используют две
принципиальные схемы мобилизации ПСК: или комбинацию миелосупрессивной
химиотерапии с воздействием факторов роста гемопоэтических клеток, или мобилизацию
только с помощью факторов роста. При этом ассоциация между применением той ипи
иной схемы мобилизации и контаминацией продуктов ПСК исследована недостаточно.
Таким образом, исследование характера контаминации продуктов КМ и ПСК на
разных этапах их подготовки к использованию в качестве аутотрансплантатов имеет
большое значение для оптимизации этой процедуры. Эта оптимизация связана с
необходимостью эффективного обнаружения опухолевых клеток и их последующего
удаления из состава трансплантата. Данная процедура направлена на снижение
возможного риска возникновения рецидива, обусловленного введением в организм
больного в составе трансплантата остаточных опухолевых клеток.
Цель работы: исследование факторов, влияющих на опухолевую контаминацию
аутотрансплантатов ПСК, а также клиническое значение этой контаминации при
проведении высокодозной химиотерапии у больных раком молочной железы.
8 Были поставлены следующие задачи:
Провести сравнительный анализ частоты и интенсивности контаминации опухолевыми клетками костного мозга и продуктов лейкафереза у больных РМЖ с помощью стандартного иммуноцитохимического анализа,
Выявить клинические и терапевтические факторы, способные влиять на контаминацию ПСК раковыми клетками.
3. Оценить жизнеспособность «остаточных» опухолевых клеток в составе образцов
костного мозга и ПСК с помощью теста на клоногенный рост клеток in vitro.
Исследовать, ассоциируется ли фактор контаминации продуктов ПСК с выживаемостью больных РМЖ.
Исследовать, повышается ли чувствительность традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) благодаря проведению этапа предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах.
6. ПрОВеСТИ Сравнительное Исследование эффеКТИВНОСТИ ОЧИСТКИ CD34-n03HTHBHbIX
фракций с помощью традиционного ИЦА и ИЦА с обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ) .
Научная новизна работы Оценка контаминации гемопоэтических трансплантатов опухолевыми клетками как фактора, потенциально влияющего на возникновение рецидивов и выживаемость больных РМЖ, ранее проводилась на выборках небольшого размера (в основном, менее 90 пациенток). Объединить данные этих исследований для совокупного анализа не представляется возможным из-за методологических различий [Weather с соавт., Cooper с соавт., Stadtmauer с соавт.]. Кроме того, далеко не все пациентки в процитированных работах адекватно реагировали па проведение ВХТ. В нашей работе эти недостатки были учтены. Впервые проведено крупномасштабное исследование (535 больных РМЖ) возможной корреляции между контаминацией КМ и ПСК опухолевыми клетками и
длительностью выживаемости больных на поздних стадиях РМЖ, адекватно
реагирующих на проведение В XT. Было установлено, что пациентки с контаминацией КМ характеризуются менее длительной выживаемостью без прогрессирования болезни, чем пациентки без нее. Контаминация ПСК является фактором, ассоциирующимся с снижением выживаемости только у пациенток, проходивших мобилизацию по комбинированной схеме и находящихся в состоянии частичной (но не полной) ремиссии на момент проведения лейкафереза. Были впервые подробно исследованы клинические и терапевтические факторы, влияющие на частоту контаминации в ПСК. Так, контаминация опухолевыми клетками КМ пациентки с высокой вероятностью позволяет предположить и контаминацию ими продуктов ПСК. Снижение частоты контаминации ПСК раковыми клетками наблюдалось при проведении комбинированной мобилизации и уменьшении количества лейкаферезов.
В данной работе был апробирован новый высокочувствительный метод обнаружения опухолевых клеток - иммуноцитохимический анализ с предварительным этапом иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах. Благодаря использованию этого метода удалось установить, что частота контаминации трансплантируемого материала гораздо выше, чем считалось ранее. Применение более чувствительного метода детекции остаточных опухолевых клеток для анализа фракций ПСК после селекции на С034-позитивные клетки позволило определить, что такая селекция является достаточно эффективным методом очистки продуктов лейкафереза от остаточных клеток РМЖ.
Научно-практическая значимость
В ходе работы показано, что опухолевая контаминация гемопоэтических тканей, предназначенных для аутотрансплалтации у больных РМЖ, является неблагоприятным прогностическим фактором. Кроме того, жизнеспособность опухолевых клеток-
контаминант была нами показана в исследовании их клоногенного роста in vitro. В целом,
полученные данные свидетельствуют о возможном участии содержащихся в трансплантате опухолевых клеток в возникновении рецидива заболевания. Таким образом, перед проведением трансплантации необходимо осуществить очистку гемопоэтических продуктов от злокачественных клеток-контаминаит. Нами также выявлен ряд клинических и терапевтических факторов, которые позволяют спрогнозировать вероятность контаминации ПСК у конкретной пациентки. Благодаря учету некоторых из этих факторов, например, при проведении мобилизации, можно снизить вероятность контаминации ПСК еще до процедуры «очистки». Так, у больных без метастазов в КМ проведение мобилизации по комбинированной схеме позволяет снизить частоту контаминации ПСК опухолевыми клетками. Кроме того, благодаря комбинированной мобилизации удается собрать необходимое количество ПСК с помощью меньшего количества процедур лейкафереза. Эти данные позволяют рекомендовать комбинированную схему мобилизации как оптимальную в сравнении с мобилизацией только цитокипами.
Был разработан и апробирован новый высокочувствительный метод детекции остаточных опухолевых клеток, представляющий собой сочетание традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) с этапом предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах. Чувствительность этого усовершенствованного метода в 20 - 50 раз выше традиционного ИЦА. Применение нового метода позволило установить, что уровень контаминации образцов гематопоэтической ткани у больных РМЖ гораздо выше, чем это считалось ранее: если стандартный ИЦА позволяет выявить контаминацию ПСК у 7% больных РМЖ на II - IV стадиях заболевания, то новый метод - у 86% пациенток. Повышение чувствительности метода детекции остаточных опухолевых клеток в трансплантате может иметь большое значение для оценки эффективности его очистки. Примерам могут служить полученные
нами данные по оценке уровня контаминации ПСК после проведения позитивной селекции на клетки, экспрессирующие CD34. Если стандартный ИЦА не позволил выявить опухолевые клетки ни в одном из 36 образцов CD34-no3HTHBHbrx фракций, то в ИЦА-ОММ опухолевые клетки обнаружены в 49% С034-позитивных фракций. Одновременно с этим у 8 пациенток (24%) при анализе с помощью ИЦА-ОММ опухолевые клетки были обнаружены только в С034-негативных фракциях, и не обнаруживались в СВ34-позитивных фракциях, то есть у этих пациенток благодаря позитивной селекции на CD34 удалось полностью очистить трансплантаты в пределах чувствительности ИЦА-ОМШ. Таким образом, благодаря более чувствительному методу детекции остаточных опухолевых клеток можно лучше оптимизировать процедуру очистки трансплантата. Другим возможным приложением высокочувствительного метода обнаружения опухолевых клеток может являться мониторинг за ходом лечения пациенток. Возникновение рецидива, по-видимому, должно сопровождаться повышением количества опухолевых клеток в периферической крови, и, вероятно, может быть зафиксировано с помощью этого метода. Возможность применения ИЦА-ОММ для мониторинга за возникновением рецидива РМЖ необходимо исследовать дополнительно,
Высокодозная химиотерапия
Несмотря на успешное применение комбинированной химиотерапии для лечения онкологических больных на поздних стадиях заболевания, у большинства таких пациентов развиваются рецидивы и они погибают. В связи с этим, повышенный интерес проявляется к лечению высокими дозами химиопрепаратов. Полагают, что в случаях, когда традиционные режимы химиотерапии оказываются неэффективными (например, при лечении резистентных форм опухолей, повторных рецидивах, не купирующиеся химиопрепаратами второй линии), высокодозная химиотерапия позволит достигнуть значимого эффекта.
При использовании термина «высокодозная химиотерапия?) имеются в виду следующие проказатели: доза, которая вводится в определенный момент; кумулятивная доза препарата; интенсивность дозы. Интенсивность дозы обычно определяется как общее количество препарата, которое было введено больному иа квадратный метр поверхности тела за единицу времени (мг I и21 неделю) [Hryniuk & Levine],
Первые результаты по применению ВХТ опубликованы в 80-х - начале 90-х годов прошлого века. При лечении лимфогранулематоза (ЛГМ) у 30 больных с резистентным течением заболевания в 50% случаев была достигнута полная ремиссия [Jagannath с соавт.]. Идентичные показатели выживаемости без прогрессирования болезни при резистентных формах ЛГМ после ВХТ представлены и в более поздних публикациях [Mahendra с соавт.]. Помимо высокого противоопухолевого эффекта показана удовлетворительная переносимость ВХТ [Птушкин с соавт.]. В последнее время предпочтение отдается проведению ВХТ в качестве консолидации первой полной ремиссии, В результате такого подхода достигнута пятилетняя выживаемость без прогрессирования болезни для 87% больных с лимфосаркомами и для более чем 70%больных с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Показана эффективность ВХТ при лечении опухолей мозга [Dunkel], ретшюбластомы [Hertzberg с соавт,, Dunkel с соавт.], рака яичника [Stiff с соавт.], саркомы мягких тканей [Blay с соавт.] ми ел омы [Vesole с соавт,]. Этот подход весьма успешно применяется также для лечения больных нейробластомой. Так, после проведения II фазы клинических исследований эффекты были получены у 81% больных нейробластомой на IV стадии заболевания [Hartmann с соавт.]. При лечении стандартными дозами химиопрепаратов 3-5 летняя выживаемость таких больных составляет не более 10%. Однако, если на этапе консолидации подключается высокодозная химиотерапия, 5-летняя выживаемость без прогрессирования болезни возрастает до 40%. В настоящее время интенсивно исследуется эффективность высокодознои химиотерапии для лечения метастатического рака молочной железы (РМЖ). Эти исследования были начаты после публикации Bonadonna с соавт., описывающей результаты комбинированной химиотерапии метастатического РМЖ. Bonadonna с соавт. провели ретроспективное сопоставление эффективности схемы CMF (циклофосфамид / метотрексат / 5-фторурацил) в зависимости от суммарной фактической и ожидаемой дозы препарата, которую получали больные. С этой целью все пациентки были разделены на три группы в зависимости от кумулятивной дозы препарата: 1) более 85% планируемой дозы; 2) 66 - 84% дозы; 3) менее 65% дозы. Самая высокая частота объективных эффектов (67%) оказалась в группе больных, которые получили наибольшую дозу и, наоборот, наименьшая (35%) среди больных, получивших менее 65% планируемой дозы. При этом зависимость доза-эффект в виде различий показателей и выживаемости без прогрессирования болезни и полной выживаемости как для пост- так и для пременопаузалышх больных также прослеживалась через 5 и 10 лет наблюдений [Bonadonna с соавт.]. Полученные данные стимулировали и других исследователей к ретроспективному анализу соотношения доза-эффект при химиотерапии метастатического РМЖ. Однако, приблизительно в половине работ подобной зависимости доза-эффект не выявлено [Henderson], Начиная с середины 80-х годов прошлого века и до настоящего времени поведен целый ряд исследований, посвященных применению ВХТ для лечения метастатического РМЖ (IV стадия) и РМЖ II - Ш стадии с высоким риском прогрессии заболевания (пораженке 4 и более аксиллярпых лимфоузлов). В б из 7 рандомизированных исследований по ВХТ метастатического РМЖ отмечено увеличение выживаемости без прогрессирования болезни в результате применения ВХТ [Nieto]. Однако, необходимо продолжение этих исследований с тем чтобы определить, ассоциируется ли повышение выживаемости без прогрессирования болезни с увеличением полной выживаемости пациенток. В большинстве рандомизированных исследований ВХТ у больных II - III стадии РМЖ с высоким риском прогрессии заболевания также отмечается снижение частоты возникновения рецидивов [Peters с соавт.]. Однако, это не повлияло на повышение полной выживаемости в группе ВХТ вследствие роста смертности, обусловленной токсичностью терапии. Наиболее крупным и хорошо спланированным рандомизированным исследованием ВХТ ІІ-Ш стадии РМЖ с высоким риском прогрессии является работа Rodenhuis с соавторами (Дания). Этими авторами исследовались 885 пациенток (у 570 - от 4 до 9 пораженных лимфоузлов, и у 315 - 10 и более пораженных лимфоузлов). Проведение контрольного анализа через 3.5 года после ВХТ и аутотрансплантации позволило выявить снижение частоты рецидивов, но не повышение полной выживаемости в группе ВХТ. Однако, через 4,5 года показано достоверное увеличение как выживаемости без прогрессирования болезни (77% против 62%, р = 0.009), так и полной выживаемости (89% против 79%, р = 0.04). Описываемое исследование является иллюстрацией того, что позитивные результаты от применения ВХТ при лечении РМЖ могут проявиться на более длительных сроках наблюдения за больными. Целый ряд рандомизированных исследований, направленных на изучение эффективности ВХТ при лечении больных РМЖ, еще не закончены [Nieto]. Более длительные сроки наблюдений за результатами ВХТ, тщательный и объективный подбор и анализ данных, а также использование новых препаратов и схем ВХТ безусловно позволит окончательно ответить на вопрос об эффективности ее применения для лечения больных РМЖ. Основным фактором, лимитирующим проведение ВХТ, является миелодепрессин. С целью защиты гемопоэза может быть использована аутологичная трансплантация костного мозга (КМ) или стволовых клеток периферической крови (ПСК). Забор кроветворных клеток производится до проведения ВХТ и затем, после элиминации цитостатиков из крови больной, эти клетки реинфузируются обратно пациентке. Такой подход позволяет сократить продолжительность миелодепрессин, снизить частоту опасных для жизни инфекционных осложнений и значительно увеличить дозы вводимых химиопрепаратов.
Иммунодиагностика опухолей человека
Иммунодиагностика опухолей человека основана на одном из фундаментальных свойств опухоли - сохранении ею направления и уровня дифференцировки клетки-предшественницы. Все антигены, используемые в иммунодиагностике опухолей - это дифференцировочные антигены соответствующей нормальной ткани, характеризующие определенный этап ее созревания. Особенно ярко данный феномен проявляется в иммунофенотипировании гемобластозов, каждая из форм которых в точности соответствует по антигенам клеточной мембраны как бы «замороженной» стадии дифференцировки той или иной ветви кроветворения [Абелев]. Обнаружение альфафетопротеина (АФП) при гепатоцеллюлярном раке положило начало открытию ряда серологических маркеров солидных опухолей. АФП представляет собой так называемый «онкофетальный» дифференцировочный антиген, который экспрессируется в нормальном развитии только в эмбриональном периоде, но вновь появляется только в опухолях. К онкофетальным маркерам относится также раково-эмбриональный антиген (РЭА), продуцируемый опухолями толстой кишки, СА-125, избыточно продуцируемый клетками рака яичника, хорионический гонадотропин (р-цепь), вырабатываемый терминальными опухолями. Серологический маркер рака молочной железы человека - Нег2/пеи представляет собой растворимый рецептор одного из эпидермальных факторов роста. Его присутствие в крови является плохим прогностическим признаком. Особую популярность получил серологический маркер рака простаты - простат-специфический антиген (ПСА), применяемый не только для дифференциальной диагностики и мониторинга, но и для скрипиигового выявления клинически не проявляющихся опухолей. Необходимо отметить, что названные маркеры могут также использоваться при проведении иммуногистохимических исследований с целью диагностики и построения тактики лечения.
Важным событием для иммунодиагностики рака стало введение в практику в конце 70-х начале 80-х годов прошлого века монокловальных антител (МКАТ). МКАТ широко применяются для иммунофенотипирования гемобластозов. Столь же эффективно МКАТ используются и в им мунодиагн ости кумах на серологические маркеры опухолей, а также в иммуногисто- и цитохимических исследованиях. Другим применением моноклональных антител является установление локализации опухоли и метастазов. Для этого МКАТ или их Fab - фрагменты метят радиоактивными изотопами. Данный подход позволяет локализовать небольшие метастазы в организме, а в некоторых случаях - накопить терапевтические дозы радиоизотопа в опухоли или метастазах. В качестве примера приведем выявление клеток рака толстой кишки, щитовидной железы с помощью МКАТ к раково-эмбриональному антигену [Juweid с соавт.]. Успешность использования моноклональных антител в значительной степени определяется их более высокой специфичностью по сравнению с лоликлоналышми антителами. Важной характеристикой МКАТ к антигенам опухолевых клеток является отсутствие их реактивности к антигенам нормальных клеток. Помимо высокой специфичности, иммунологические методы детекции опухолевых клеток с использованием МКАТ характеризуются высокой чувствительностью. Так, прямой иммуноцитохимический анализ с использованием МКАТ позволяет обнаружить одну клетку опухоли среди ста тысяч - 1 миллиона нормальных клеток [Shpall с соавт., Ross с соавт. (1993)]. Этот метод анализа предусматривает визуализацию комплекса антиген-антитело в результате химической реакции (антитело конъюгировано с ферментом, способным перерабатывать субстрат с образованием цветного продукта реакции). Наиболее распространен метод исследования с использованием щелочной фосфатазы. Его чувствительность находится в пределах детекции одной опухолевой клетки на 10s - Ю6 нормальных клеток. В настоящее время активно разрабатываются методы, обладающие более высокой чувствительностью. К ним, в частности, относится метод иммуноцитохимического анализа с предварительным этапом иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах. Разработка такого более чувствительного метода выявления клеток рака молочной железы является одной из задач данной диссертационной работы. Наряду с высокой чувствительностью, ценность иммунологических методов заключается еще и в том, что с их помощью раковые клетки могут быть не только обнаружены, но и удалены из образцов костного мозга или клеток периферической крови, предназначенных для трансплантации. Благодаря своей специфичности, МКАТ представляют собой идеальные агенты для идентификации и направленного действия на такие злокачественные клетки [Гриббен и Нэдлер]. Принцип селективного отделения контаминантных злокачественных клеток от клеток-предшественниц в костном мозге проиллюстрирован на рисунке I.
Иммуноцитохимический анализ с иммунным обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ)
С целью обогащения пула опухолевых клеток, мононуклеарные клетки из CD34 негативной клеточной фракции помещались в содержащий 10% фетальную сыворотку раствор PBS и промывались в этом растворе, после чего проводилось центрифугирование на клеточной центрифуге при 1000 об./мин. в течение 10 минут (эту процедуру делали 2 раза). После промывки, образцы, содержащие ] х 108 - 2 х 109 клеток, инкубировались в том же буфере с добавлением 10% иммуноглобулина гамма человека (Gammagard S/D, Baxter Healthcare Corp., Hyland ImmunoDivision, Glendale, CA) при комнатной температуре в течение 15 минут. В случае анализа неизвестных образцов, использовались только аликвоты, содержащие 2 х 109 клеток. Клетки затем инкубировались с коктейлем из первичных моноклональных антител 9184, 9187 и 9189 (описание антител дается в таблице 3} в присутствии 10% иммунного гамма-глобулина человека при 4С в течение 30 минут. Для аликвот, содержащих изначально 1x10 или 2 х 10 клеток, использовали соответственно 2.5 или 25 мкг каждого из указанных выше антител. Несвязавшиеся с поверхностью клеток антитела были отмыты буфером PBS, содержащим 10% фетальную сыворотку (2 раза). Образовавшиеся комплексы между первичными антителами и клетками были прецигштированы в результате инкубации с овечьим анти-мышиным igG, иммобилизованным на магнитных микросферах (Dynal, Oslo, Norway) при соотношении I частица на 100 клеток (4С, 30 мин., с осторожным перемешиванием на роторе). Отделение преципитированных клеток от непровзаимодействовавших с антителами проводилось с помощью магнитной платформы Dynal МРС-1, помещенной рядом с образцом в пробирке на 2 минуты при комнатной температуре. Комплексы клеток с мапштными частицами были промыты два раза буфером PBS с сывороткой с целью удаления свободных клеток. После этого преципитаты были осторожно ресуспендированы в среде L-15. Восстановленная таким образом после действия магнитного поля суспензия магнитных частиц с преципитированными на них клетками наносилась на предметные стекла с помощью клеточной центрифуги Hettich cytospin (Andreas Hettich GmbH &Co„ KG, Tuttlingen, Germany). При этом на каждое стекло наносилось 1 - 2 х 106 микросфер. Полученные препараты хранились при 4 С до процедуры иммунного окрашивания. В случае низкой концентрации магнитных частиц, осаждение проводилось с использованием клеточной центрифуги Shandon Cytospin (Shandon Inc., Pittsburgh, PA): на предметное стекло наносилось 1 - 2 х 105 клеток. Для каждого исследуемого образца с изначальной концентрацией клеток 1 х 108 или 2 х 109, было соответственно приготовлено 5 или 10 предметных стекол для анализа. Затем цитологические препараты были зафиксированы в 4% параформальдегиде, и тщательно промыты в фосфатном буфере PBS (GIBCO BRL, Life Technologies, Inc.), содержащем Тритон Х-100 (1%). Иммунное окрашивание клеток было проведено с использованием автоматического иммуноокрашивателя (TechMate, Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA) также как это было описано для стандартного ИЦА. Схема проведения ИЦА ОМШ показана на рисунке 3. Инкубация с МКАТ 2х отмывка несвязавшихся МКАТ Инкубация с магнитными шариками, связанными с вторичными AT Отделение шариков в магнитном поле Удаление несвязавшихся клеток Сбор клеток РМЖ, связанных с шариками Фиксация, иммунное окрашивание, Рисунок 3. Схема проведения ИЦА-ОММ. 2.10.1. Построение стандартных кривых анализа С целью построения стандартных кривых для анализа результатов традиционного иммуноцитохимического анализа и ИЦА с обогащением на магнитных частицах, различное количество культивированных in vitro клеток РМЖ САМА-1 добавлялось к клеткам С034-негативпых фракций, полученным от доноров без онкопатологии. Клетки САМА-1 были извлечены из культуралыюго флакона, промыты два раза средой L-15 без сыворотки и ресуспендированы в этой же среде, содержащей 15% FBS. Образцы для анализа, содержащие различное количество клеток САМА-1, были приготовлены разведением стоковой суспензии 1 к 10 клетокв миллилитре. 2.11. Исследование юіоногенного роста резидуальных опухолевых клеток in vitro Объектом исследования служили свежесобранные или бысторазмороженные после криоконсервации фракции моконуклеаров КМ или ПСК. В случае проведения нескольких лейкаферезов продукты ПСК пулировались и для анализа отбиралась необходимая часть клеток. Клетки в концентрации 5.0 х 10і - 1 х 10 на миллилитр среды были рассажены в агаризованнуго среду в тройном повторе на 35 мм чашки Петри с разметкой на дне для подсчета клеток (Nunc, Inc., Naperville, IL). Агаризованная среда состояла из 30% модифицированной Iscov среды Dulbecco (IMDM, Sigma, St. Louis, МО), 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma), 50% раствора 0.6% агара (Sigma). В среду были также добавлены следующие ростовые факторы: рекомбинантпый эпидермальный фактор роста человека - 5 мкг / мл (Collaborative Research, Bedford, MA), рекомбинантпый ГМ-КСФ человека - 50 ед / мл (Collaborative Research, Bedford, MA), рекомбинантный инсулиноподобный ростовой фактор I (Collaborative Research, Bedford, MA). Чашки с образцами, предназначенными для негативного контроля, не содержали в среде упомянутые выше ростовые факторы. Все чашки инкубировались в СО2- инкубаторе при 37С и содержании СОг- 7.5% в течение 14 дней.
Исследование влияния схемы мобилизационной терапии на контаминацию образцов ПСК
Повышение частоты контаминации сбора ПСК с увеличением количества процедур лейкафереза может быть следствием большего количества анализируемых проб. Для того, чтобы проверить эту возможность, мы троекратно провели ИЦА образцов лейкафереза 53 из 149 пациенток, у которых эта процедура осуществлялась однократно и сравнили с результатами ИЦА продуктов лейкафереза 58 пациенток, которым проводили 3 процедуры лейкафереза. Пациентки, у которых лейкаферез осуществляли однократно и в случае проведения трех независимых иммуноцитохимических исследований демонстрировали меньшую частоту контаминации по сравнению с теми больными, у которых проводили три лейкафереза (6 из 53 (11.3%) по сравнению с 19 из 58 (32.7%) соответственно; р = 0.007). Частота контаминации сборов ПСК у пациенток, которым проводили три процедуры лейкафереза, после первой из таких процедур была примерно такой же, как у пациенток, которым проводили одну процедуру и осуществляли иммуноцитохимическое исследование троекратно (15.5% по сравнению с 11.3% соответственно). Таким образом, повышение частоты контаминации сборов ПСК ассоциируется именно с увеличением количества процедур лейкафереза и не зависит от числа проанализированных образцов. Необходимо отметить, что у пациенток с одинаковым количеством проведенных лейкаферезов схема мобилизационной терапии не влияла на частоту контаминации сборов ПСК. Так у пациенток, которым проводили одну процедуру лейкафереза, отмечалась низкая частота контаминации его продуктов вне зависимости от того, была ли проведена мобилизация только цитокином (2 из 42, 5.8% ) или цитокин использовался в комбинации с химиопрепаратом (3 из 80, 3.8%; р - 0.83). Аналогичное соотношение уровня контаминации ПСК при проведении только цитокиновой и комбинированной мобилизации прослеживалось для пациенток, которым делали две процедуры лейкафереза (цитокин - 25%, комбинированная терапия - 10.6%, p = 0,17), три процедуры (27.2% против 33.3% соответственно, р = 0.75), а также 4 и более процедур (43.3% против 36.5%, р = 0.59). Данные о дате последнего проведения химиотерапии и количестве проведенных лейкаферезов были известны для 224 из 447 пациенток с определенной схемой мобилизационного режима. При этом у 68 из 224 пациенток мобилизационную терапию проводили только цитокином и 156 пациенткам мобилизацию проводили по комбинированной схеме. Количество дней с момента проведения последней процедуры химиотерапии до последнего лейкафереза было значительно больше у пациенток, проходивших мобилизацию только цитокином (медиана - 34 дня, среднее значение - 42.3 дня) по сравнению с теми, кто проходил комбинированную мобилизацию (медиана 11 дней, среднее значение- 12.9 дня) (р 0.001), Сходным образом, количество процедур лейкафереза было выше у пациенток, получавших мобилизацию только цитокином (медиана — 3, среднее 3.31) по сравнению с пациентками, получавшими комбинированную мобилизацию (медиана -2, среднее -2.58) (р , 0.001). Таким образом, проведение мобилизации по комбинированной схеме позволяло собрать необходимое количество ПСК за более короткое время и с помощью меньшего количества процедур лейкаферезов. 3.1.5. Исследование контаминации образцов ПСК в зависимости от типа мобилизации у больных РМЖ с частичной и полной ремиссией Данные о характере ремиссии на момент проведения лейкафереза были получены для 285 пациенток. У 10 из 74 пациенток (13.5%) с полной ремиссией выявлена контаминация продуктов ПСК. В группе пациенток с частичной ремиссией контаминация продуктов ПСК обнаружена у 51 из 211 пациенток (24.2%). Значение этого параметра в последней группе было в 1.8 раза выше, чем в группе больных с полной ремиссией. Это различие хотя и не было статистически значимым, достаточно близко к границе статистической достоверности (р = 0.069 при уровне значимости р 0.05). Таким образом, можно говорить о тенденции к повышенной частоте контаминации сборов ПСК у больных с частичной ремиссией по сравнению с пациентками на стадии полной ремиссии. У пациенток с полной ремиссией частота контаминации сборов ПСК не зависела от типа мобилизационной терапии (мобилизация только цитокином - 5 из 34, 14.7%, комбинированная схема мобилизации - 5 из 40, 12.5%). В тоже время у пациенток с частичной ремиссией при проведении комбинированной мобилизации отмечалась меньшая частота контаминации сборов ПСК по сравнению аналогичным показателем в группе пациенток с мобилизацией только цитокином (24 из 126, 19.0%, по сравнению с 27 из 85, 31.7%, соответственно р = 0.049). Полученные данные свидетельствуют о том, что комбинированный режим мобилизации ассоциируется со снижением частоты контаминации ПСК у больных РМЖ, находящихся в состоянии частичной ремиссии. 3.2. Опухолевая контаминация КМ и ПСК как фактор прогноза выживаемости без прогрессирования болезни и полной выживаемости РМЖ Пациентки без иммуноцигохимически-детектируемых метастазов в костном мозге имели значительно более высокую выживаемость без прогрессирования болезни (медиана - 458 дней) по сравнению с пациентками, у которых такие метастазы были выявлены (медиана 146 дней, р = 1 х 10 ). Медиана выживаемости без прогрессирования болезни была выше в группе из 168 пациенток, у которых опухолевые клетки не обнаруживались ни в костном мозге, ни в продуктах ПСК (471 день, р = 7 х 10 3). К сожалению, данные по полной выживаемости для этой группы пациенток не были доступны для анализа. Данные по выживаемости были доступны для 403 из 447 пациенток с известным режимом мобилизационной терапии. У пациенток без контаминации сборов ПСК выживаемость без прогрессирования болезни и полная выживаемость были определены для 125 пациенток с мобилизацией только цитокином и для 191 пациентки с комбинированной схемой мобилизации. Аналогичные параметры были исследованы у пациенток с контаминацией ПСК, при этом 46 из них проходили мобилизацию только цитокином и 41 - комбинированную мобилизацию, В целом, пациентки без контаминации ПСК характеризовались более длительной выживаемостью без прогрессирования болезни по сравнению с пациентками, у которых контаминация ПСК была выявлена (медиана составляет 401 день против 291 дня соответственно, р = 7 х Ш 3). Аналогичное соотношение было показано для названных выше групп пациенток при анализе общей выживаемости (медиана- 1060 дней против 697 дня, р = 9 х 10 ). Сопоставление данных по выживаемости и характеру мобилизационного режима представлено в таблице Таблице 7. Из этих данных видно, что среди пациенток с комбинированной схемой мобилизации более длительная выживаемость без прогрессирования болезни и полная выживаемость отмечается в группе больных без контаминации ПСК (медиана составляет 455 и 1054 дня по сравнению с 243 и 525 днями соответственно, р = 1 х 10"3). В противоположность этому, при мобилизации только цитокином факт контаминации ПСК не ассоциируется с величиной выживаемости без прогрессирования болезни или полной выживаемости. Так, в группе пациенток без контаминации ПСК медиана выживаемости без прогрессирования болезни составляет 352 дня по сравнению с 295 днями в группе пациенток с такой контаминацией, р = 0.3). Медиана полной выживаемости в вышеназванных группах составляет 1060 и 985 дней соответственно, р = 0.34).
