Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1. Физиологические и патофизиологические функции активных форм кислорода и свободных радикалов 8
2. Система детоксикации организма ...9
3. Перспективность использования антиоксидантов в онкологии 16
4. Биологически активные вещества лекарственных растений, обладающие антиоксидантной активностью 19
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 33
ГЛАВА III. Собственные результаты и их обсуждение
1. Скрининг средств растительного происхождения для разработки биологически активной добавки 48
2. Доклиническое изучение БАД «Антиоксифит» антиоксидантного действия 54
2.1. Изучение безвредности (общетоксического действия) БАД «Антиоксифит» 54
2.2. Изучение влияния БАД «Антиоксифит» на рост перевиваемых опухолей у животных 57
2.3. Оценка антиканцерогенного действия БАД «Антиоксифит» 64
2.4. Изучение биологических свойств БАД «Антиоксифит» 71
2.4.1. Изучение антиоксидантной активности БАД «Антиоксифит» и ее общеукрепляющего действия 71
2.4.2. Оценка детоксицирующего действия БАД «Антиоксифит» 73
2.43. Оценка влияния БАД «Антиоксифит» на лечебный эффект цитостатиков 89
5. Апробация БАД «Антиоксифит» в качестве общеукрепляющего и детоксицирующего средства у больных злокачественными новообразованиями 92
5.1. Применение БАД «Антиоксифит» у больных, находящихся на химиотерапевтическом лечении 92
5.2. Применение БАД «Антиоксифит» у больных, находящихся на химио-лучевом лечении 102
5.3. Применение БАД «Антиоксифит» у больных с генерализованным опухолевым процессом 114
Заключение 122
Выводы 136
Список литературы 138
- Система детоксикации организма
- Перспективность использования антиоксидантов в онкологии
- Скрининг средств растительного происхождения для разработки биологически активной добавки
- Оценка антиканцерогенного действия БАД «Антиоксифит»
Введение к работе
Актуальность темы.
В последнее время во всех странах мира отмечается неуклонный рост заболеваемости злокачественными новообразованиями [13]. К настоящему моменту доказано, что одним из инициирующих моментов канцерогенеза является длительное воздействие химических и физических факторов, в результате которого в организме усиливаются процессы радикалоообразования [16]. Органические и кислородные радикалы, взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, повреждают генетический аппарат клеток, активируют процессы перекисного окисления липидов клеточных мембран, что приводит к нарушению структурного гомеостаза клеток, инактивации мембрано-связанных ферментов. В результате нарушается сбалансированное протекание биохимических процессов жизнедеятельности клеток, что в свою очередь способствует их неопластической трансформации [50]. Наряду с этим, избыточное радикалообразование и нарушение процессов клеточного метаболизма приводит к серьезным нарушениям в организме: снижаются белоксинтетические процессы, изменяется процесс фибринолиза-свертывания, активность гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток [43, 46]. Ослабление иммунологического контроля организма в совокупности с другими нарушениями создает условия для прогрессирования злокачественного новообразования [119]. Поэтому актуальной является разработка средств, способных предотвращать избыточное радикалообразование в организме либо путем активизации эндогенной антиоксидантной системы, либо путем прямого восполнения антиоксидантов. Поскольку эти средства должны быть рассчитаны на длительное применение, они должны быть биосовместимыми, хорошо переноситься, не проявлять токсического действия, то идеально для этого подходят биологически активные добавки (БАД) на основе растительного лекарственного сырья с высокой антиоксидантной активностью (АОА).
Онкологическое заболевание, особенно при распространенном злокачественном опухолевом процессе, сопровождается нарушениями деятельности основных регуляторных систем гомеостаза, что обуславливает развитие опухолевого токсикоза [95]. Консервативное противоопухолевое лечение злокачественных новообразований - химиотерапия, лучевая терапия характеризуются высокой агрессивностью не только в отношении опухолевых, но и нормальных клеток и тканей организма. Повреждение опухолевых клеток и в определенной степени нормальных тканей приводит к накоплению в организме токсичных метаболитов, оказывающих нагрузку на систему детоксикации. Развитие сочетанного токсикоза, обусловленного злокачественным процессом и противоопухолевым лечением неблагоприятно отражается на качестве жизни пациентов, приводит к нежелательным перерывам в противоопухолевом лечении и как следствие к снижению его эффективности.
Многочисленные данные литературы и наши исследования свидетельствуют, что еще до начала противоопухолевого лечения у больных злокачественными новообразованиями отмечаются нарушения в различных звеньях гомеостаза, и особенно выраженные в окислительно-антиокислительной и иммунной системах [54, 55, 56, 62, 65, 94, 115]. Так, у подавляющего большинства пациентов (88±10%) повышена интенсивность пероксидации липидов на 20-30% при разнонаправленном изменении относительно нормы уровня и активности эндогенных антиоксидантов: концентрация лактоферрина повышена в 1,5-2 раза у 47+11% больных, активность каталазы снижена в 1,5-2 раза у 58+9% больных, активность церулоплазмина снижена у 35+7%, повышена - у 47±9% пациентов. У большинства больных отмечается иммуносупрессия: у 74+11% угнетение лимфоцитарного звена иммунитета, у 80±7% выявлены изменения в функциональной активности нейтрофилов.
Совокупность этих нарушений может являться причиной угнетения естественных защитных механизмов, что обуславливает повышенную восприимчивость больного к бактериальным и вирусным инфекциям, возникновению асептических воспалений, дисбактериозов кишечника, нарушениям гемопоэза и других осложнений при последующем проведении противоопухолевого лечения.
В связи с этим, перспективным является проведение поддерживающей терапии с использованием БАД, обладающих АОА, которые способствуют нормализации окислительной-антиоксилительной системы, снижают токсичность химиопрепаратов и побочные эффекты лучевой терапии.
Таким образом, актуальным является поиск и разработка БАД с высокой АОА, которые будут использоваться не только для профилактики заболеваний, обусловленных «окислительным стрессом», но также в качестве детоксицирующих и общеукрепляющих средств у больных с развившимися заболеваниями в процессе подготовки к специфическому лечению и для реабилитации после него.
Перспективным для разработки БАД является лекарственное растительное сырье. Лекарственные растения интересны как объекты для производства БАД за счет содержания в них обширной гаммы биологически активных веществ, которые обеспечивают многогранные физиологические эффекты. Поскольку в настоящее время в фармакогнозии наибольшее признание получило составление сложных лекарственных сборов, то рациональным является создание комплексного средства на основе многокомпонентного суммарного экстракта из лекарственных растений.
2. Цель исследования.
Разработка новой БАД с высокой АОА на основе лекарственных растений, изучение ее эффективности в экспериментальных исследованиях и апробация в клинике.
3. Задачи исследования. 1. Разработка программы предклинического изучения БАД, предназначенных для онкологической практики.
2. Разработка оригинальной Б АД антиоксидантного действия и изучение ее эффективности в экспериментальных исследованиях .
3. Оценка влияния корригирующей антиоксидантной терапии на показатели гомеостаза у онкологических больных при использовании новой БАД в клинике.
4. Научная новизна темы.
Разработана новая БАД - антиоксифит с высокой АОА, которая представляет собой сухой экстракт лекарственных растений Сибирского региона РФ.
Впервые научно обоснована, разработана и апробирована схема предклинического изучения БАД, предназначенной для использования в онкологической практике.
Впервые в процессе доклинических исследований установлено, что БАД «Антиоксифит»:
1) обладает общеукрепляющим действием;
2) оказывает детоксицирующее действие в отношении гепатотропного яда (CCU) и химиопрепаратов - доксорубицина, 5-фторурацила, циклофосфана и цисплатина;
3) не оказывает стимулирующего действия в отношении роста экспериментальных опухолей различного гистогенеза;
4) обладает антиканцерогенным действием в отношении химически индуцированной 20-метилхолантреном опухолей;
5) не оказывает токсического действия на организм интактных животных.
5. Научно-практическая значимость. Экспериментальные исследования показали целесообразность использования в клинической практике новой БАД, которая может быть рекомендована для применения в схемах поддерживающей терапии у онкологических больных.
Клинические испытания подтвердили эффективность применения разработанной ВАД в качестве детоксицирующего и общеукрепляющего средств у больных с распространенным опухолевым процессом (IV стадии), раком молочной железы (T3-4N0-1M0).
6. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на IV Международном симпозиуме по биологически активным добавкам (2000г); на V Международном симпозиуме «Биологически активные добавки и проблемы здоровья семьи» (2001 г); на III Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (2001г.); на Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (2002г); на I Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы патогенеза и терапии иммунных расстройств» (2002г); на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2003г); на медико-фармацевтическом форуме (2003г); на конференции с международным участием «Активные формы кислорода и оксид азота» (2003г).
7. Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, получен 1 патент на изобретение.
8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 129 источника. Работа иллюстрирована 28 рисунками и 25 таблицами.
Система детоксикации организма
Биохимические процессы, обуславливающие в значительной степени поддержание гомеостаза, а также защиту от повреждающего воздействия ксенобиотиков и активных окислителей осуществляет система детоксикации. Она представляет собой сложную систему и состоит из трех звеньев: -окислительного (I фаза детоксикации); -конъюгации, в котором происходит выведение окисленных соединений в виде конъюгатов с глюкуроновои кислотой, глутатионом, аминокислотами и др. (II фаза детоксикации); -антиоксидантного, которое осуществляет обезвреживание и элиминацию свободнорадикальных и перекисных соединений (III фаза детоксикации). Краткая схема системы детоксикации организма представлена на рисунке 1. Центральную роль в первом звене системы детоксикации -окислительном, занимает микросомальная монооксигеназная система. Она представляет собой мультиферментный комплекс, локализующийся на мембранах гладкого эндоплазматического ретикулума клеток. Наиболее развитая микросомальная монооксигеназная система обнаружена в клетках печени, что обуславливает ее функции в организме как основного органа детоксикации.
Микросомальная монооксигеназная система представлена двумя взаимосвязанными электроннотранспортными цепями: 1) цитохром Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазой, 2) цитохром Ь5 и НАДН-цитохром Ь5 редуктазой. Общим принципом действия микросомальной монооксигеназной системы является последовательный перенос 2-х электронов от пиридиннуклеотидов (НАДФ и НАД) каталитического фрагмента цитохром-редуктаз к цитохрому Р-450.
Микросомальная монооксигеназная система способна катализировать окисление различных по своей химической природе гидрофобных токсических соединений, катализировать процессы гидроксилирования, дезаминирования, десульфирования, восстановительного дегалогенирования, восстановления нитро- и азосоединений. В результате неполярные соединения приобретают реактивные группы (-ОН, -NH2, -СООН, -SH), что обеспечивает их способность вступать в реакции конъюгации (рисунок 1).
Конъюгация окисленных продуктов (II фаза системы детоксикации) характеризуется участием в реакциях биосинтеза макроэргических соединений. Наиболее распространенными реакциями конъюгации в организме человека являются глюкуронидная, сульфатная, глутатионовая, конъюгация с аминокислотами, метилирование, ацетилирование.
Образующиеся в результате этих реакций соединения малотоксичны и легко выводятся из организма. Таким образом, I и II фазы системы детоксикации обеспечивают окисление и выведение токсических продуктов как экзогенного (ксенобиотиков) так и эндогенного происхождения, предотвращая их накопление в организме. Однако при биотрансформации токсических соединений под действием микросомальной монооксигеназной системы за счет восстановления феррокомплекса цитохрома Р-450 происходит образование активированного кислородного метаболита - супероксид-анион радикала (02"), способного в присутствии ионов железа инициировать образование других более активных кислородных метаболитов и перекисных соединений, которые способны взаимодействовать с различными биологическими субстратами, вызывая деструктивные нарушения в клетках, а также блокировать работу цитохрома Р-450, приводя к уменьшению эффективности детоксикационных процессов в организме [87].
Образование АФК в организме человека происходит не только при функционировании микросомальной монооксигеназной системы, но также при переносе электронов в электронотранспортной цепи митохондрий и при окислительно- восстановительных реакциях, протекающих с участием молекулярого кислорода, который активируется оксидазами посредством переноса на него одного, двух или четырех электронов.
Таким образом, окислительно-восстановительные процессы, сопровождающиеся образованием побочных токсических АФК, органических свободных радикалов, органических и неорганических перекисных соединений являются необходимой частью функционирования живого организма. Однако избыточное количество АФК и других активных окислителей требует элиминации. Обезвреживание избыточного количества АФК и других активных окислителей, образующихся в организме, обеспечивает III фаза системы детоксикации - антиокислительная [16, 17, 59, 85] (рисунки 1, 2).
Антиоксидантная система организма представляет собой разветвленную, многокомпонентную сеть физиологически активных соединений, объединяющих ферментные, белковые, витаминные и структурные соединения (рисунок 2). Это супероксиддисмутаза, катализирующая диспропорционирование суп ероксид-анион радикала - предшественника образования различных видов АФК [47, 121]; каталаза и глутатионпероксидаза, обеспечивающие инактивацию перекисных соединений в организме [42, 103]; металлсвязывающие белки (ферритин, церулоштазмин, лактоферрин), антиоксидантное действие которых осуществляется за счет связывания или окисления ионов Fe2+, обладающих способностью инициировать образование АФК по реакции Габер-вейса [78,96].
Активными антиоксидантами являются витаминные (3-каротин, витамины А, Е, С) [14, 72, 98, 101] и низкомолекулярные (мочевая кислота, билирубин) легкоокисляющиеся соединения, а также транспортный белок альбумин, которые осуществляют антиокислительное действие посредством захвата радикала, обеспечивая выведение из реакционной среды организма свободнорадикальных продуктов, прерывая таким образом цепные реакции. Наряду с соединениями, инактивирующими свободные радикалы, в организме человека существуют механизмы, обеспечивающие восстановление повреждений биомолекул (ферменты, восстанавливающие ДНК, метионинсульфоксид-редуктаза и др.) [102], а также биологически активные соединения, участвующие в регуляции окислительно восстановительных реакций, протекающих в электроннотранспортных цепях микросом и митохондрий (коэнзим Q, убихинон и др.) [85].
В условиях нормального функционирования организма существует равновесие, обеспечивающее функционирование антиоксидантной системы и генерацию АФК в физиологических концентрациях. Однако в патологических условиях, при действии внешних прооксидантов (радиация, УФ-свет, загрязнение воздуха токсичными соединениями и т.д.) и избыточной активации эндогенных механизмов образования АФК (воспалительные, онкологические заболевания, нервный стресс и др.) этот баланс нарушается в сторону неконтролируемой генерации АФК, что приводит к формированию «окислительного стресса», который можно предупредить усилением антиоксидантных возможностей организма.
Усиление антиоксидантной защиты организма может быть достигнуто как заместительной антиоксидантной терапией, то есть экзогенным введением антиокислительных препаратов, так и назначением лекарственных средств, обеспечивающих активацию эндогенных антиоксидантов [6].
Перспективность использования антиоксидантов в онкологии
Фармакологические свойства лекарственных растений обусловлены наличием в их составе БАВ, которые по химическому составу весьма разнообразны. Это алкалоиды, гликозиды, фенольные соединения (простые фенолы, фенолоспирты, фенолокислоты, лигнаны, кумарины, флавоноиды, дубильные вещества), эфирные масла (терпеноиды), сапонины, смолы, органические кислоты [40].
Особое место среди БАВ растительного происхождения занимают фенольные соединения, которые по данным ряда авторов в экспериментальных и биологических системах проявляют антирадикальное и антиокислительное действие. [2, 15]. Это соединения, в которых одна или несколько гидроксильных групп (ОН") соединены с ароматическим кольцом.
Вследствие значительного многообразия структур и свойств фенольных антиоксидантов до настоящего времени не было предложено универсального варианта классификации, поэтому их делят на несколько классов родственных по структуре соединений. Один из существующих вариантов классификации фенольных соединений, предложенная Запрометовым М.Н [15], приведена на схеме (рисунок 2). Самый многочисленный класс природных фенольных соединений составляют флавоноиды- соединения с двумя ароматическими кольцами.
Базовая химическая структура флавоноидов С6 СуСб представляет собой конденсированную систему бензольного (А) и гетероциклического (С) колец, содержащую боковой фенильный заместитель (В) (рисунок 3). В зависимости от нахождения этого заместителя у атома углерода (С-2 или С-3) различаются собственно флавоноиды и их структурные изомеры -изофлавоноиды.
Основным признаком классификации, по которому флавоноиды подразделяютя на флавонолы, флавоны, флаванононы, катехины, антоцианидины, изофлавоны, дигидрофлавонолы и халконы внутри своего семейства служит строение центрального кольца.
Отличительными элементами являются наличие или отсутствие:
1. оксогруппы в положении С-4 ( -О-);
2. гидроксильной группы в положении С-3 (-ОН);
3. двойной связи между атомами углерода С-2 и С-3.
В литературе обсуждается вопрос об основополагающей роли химического строения флавоноидов с учетом электронных и стереохимических факторов в проявлении ими биологической активности, в частности антиоксидантной [41]. Особого внимания заслуживает структурный признак, определяемый характером связывания атомов углерода С-2 и С-3 в центральном кольце.
Если эти атомы углерода связаны двойной связью, то есть находятся в состоянии -гибридизации, то это обуславливает плоское расположение всей молекулы и единое электронное сопряжение всех колец. Это обстоятельство играет существенную роль в способности флавонов и флавонолов выступать в роли антиоксидантов, поскольку наличие сопряженной системы обеспечивает высокую стабильность образующегося флавоксильного радикала.
Если между атомами углерода С-2 и С-3 имеется одинарная связь, то есть они находятся в s/Агибридизации, то следствием такого электронного строения является возникновение в молекуле одного (флаваноны) или двух (флаванонолы) центров хиральности и нарушения плоскостного расположения молекулы, что предопределяет возникновение оптически активных стереоизомерных форм.
Впервые способность фенольных соединений ингибировать термическое окисление жиров была продемонстрирована Mehta и Seshadri в 1958г. Последующие многочисленные исследования показали, что в экспериментальных и биологических системах флавоноиды проявляют антирадикальное и антиоксидантное действие. При этом было выявлено, что они активны в отношении радикалов, образовавшихся как в липидной, так и в водной среде, и ингибируют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ).
АФК и, прежде всего, НО и Ог, играют ключевую роль в развитии каскада свободнорадикальных реакций ПОЛ. Радикальные реакции ПОЛ включают 3 фазы: инициация цепей, развитие цепных реакций, обрыв цепей [17]. На начальной стадии зарождения цепей происходит образование жирнокислотного органического радикала (R ), которые быстро взаимодействуют с молекулярным кислородом, в результате чего образуется пероксирадикал (RO2"), который в свою очередь атакует ненасыщенные липиды: R + 02 - ROi"
R02 + RH - ROOH + R .
Возникновение в результате последней реакции наряду с органической перекисью нового радикала R способствует продолжению окислительной цепи ПОЛ. В присутствии металлов переменной валентности органические перекиси разлагаются с образованием высоко реакционного алкоксильного радикала: ROOH + Меп+ —» RO" + НО" + Ме(п+1 ", чем также поддерживается цепной характер процесса, то есть продолжение второй фазы ПОЛ.
Как ранее было сказано, флавоноиды ингибируют процессы ПОЛ как на стадии анициации, взаимодействуя с АФК (0"2 , ОН , 202, НОСІ, Н202), так и на стадии продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для липидных радикалов LO и LOO. В этих реакциях молекула флавоноида (F1-OH) выступает в роли восстановителя (донора электрона) по отношению к радикальному субстрату (R ), переходя при этом в радикальную форму (Fl-O ):
Fl-OH + R» - Fl-O» +RH [].
Далее флавоксильный радикал не участвует в развитии цепных реакций. Это обусловлено его термодинамической устойчивостью и связана с рассредоточением электронной плотности по всей системе молекулы, что наиболее возможно при наличии в центральном кольце (С) двойной связи . Структурный анализ и экспериментальные данные свидетельствуют о прямой взаимосвязи между антиоксидантной эффективностью фенольных соединений и количеством фенольных ОН-групп в их молекулах.
Исследование разных по структуре флавоноидов показало, что соединения без ОН-заместителей или с одной гидроксильной группой не проявляют сколько-нибудь значимой активности в отношении перекисных радикалов, возникающих при разложении 2,2 -азобис(2 амидинопропан)дигидрохлорида [66]. Флавонолы и флавоны, такие как кемпферол, лютеолин, кверцетин, мирицетин, содержащие от двух до шести фенольных ОН-групп, в 2-4 раза превосходили по способности ингибировать перекисные радикалы по сравнению с известным синтетическим антиоксидантом - тролоксом [58].
Структура флавоноидов обеспечивает их способность образовывать хелатные соединения с ионами металлов переменной валентности (Fe и Си ), в результате чего снижается их концентрация в среде. Поскольку восстановленные формы ионов металлов потенциируют образование наиболее реакционноспособного гидроксильного радикала (ОН») по реакции
Габера-Вейса Fe2++ Н2О2 - Fe3 ОН" + ОН или органических свободных радикалов при разложении органических перекисей, уменьшение их концентрации в среде приводит к снижению интенсивности свободнорадикальных процессов [128].
Механизм антиоксидантного действия флавоноидов также обусловлен их способностью выступать в роли структурных антиоксидантов [57]. Так, подобно холестерину и а-токоферолу, флавоноиды встраиваются в гидрофобный слой мембран и сильно снижают текучесть мембранных липидов в области встраивания. Такая локализация в сочетании с повышенной микровязкостью может создать пространственные затруднения для диффузии свободных радикалов и, как следствие, приводить к замедлению процессов перекисного окисления липидов.
Антиоксидантные свойства флавоноидов растительного происхождения были продемонстрированы в различных экспериментальных окислительных системах: окисление липопротеинов низкой плотности, индуцированное Си2+ [123], 2,2-азобис(4-метокси-2,4 диметилвалеронитролом) [80], метмиоглобином [114], ПОЛ в мембранах эритроцитов [69], индуцированное арахидоновой кислотой ПОЛ в мембранах клеток печени [77], индуцированное Н202 повреждение ДНК в культурах клеток [52], ПОЛ в гомогенатах печени [69, 70], ПОЛ в микросомах печени [113], ССЦ- индуцированное ПОЛ в микросомах печени [68] и т.д.
Таким образом, вследствие сочетания особенностей электронного и стереохимического строения углеродного скелета и расположения в нем кислородсодержащих заместителей, флавоноиды обладают антиоксидантной активностью и поэтому могут занять ведущее место среди экзогенных природных антиоксидантов, предотвращающих неконтролируемую генерацию АФК и свободных радикалов [99].
Скрининг средств растительного происхождения для разработки биологически активной добавки
При разработке БАД с высокой антиоксидантной активностью для применения у онкологических больных нами было изучено 24 образца суммарных экстрактов сборов лекарственных растений Сибирского региона РФ, полученных водной экстракцией действующих веществ.
Предпосылками к выбору этих экстрактов служили:
1. данные литературы об использовании ряда лекарственных растений в онкологической практике в качестве вспомогательных средств;
2. данные, полученные в Новосибирском институте органической химии, о том, что основными действующими биологически активными веществами этих экстрактов являлись фенольные соединения, которые необходимы для обеспечения желаемого фармакотерапевтического эффекта, в частности, антиоксидантного.
В настоящее время существует целый ряд модельных систем, позволяющих оценивать антиоксидантную активность различных соединений. В основу этих методов положены реакции окисления органических субстратов, искусственно сформированных фосфолипидных липосом, микросомальной клеточной фракции [39,109]. Все эти системы могут быть использованы для оценки антиоксидантной активности экстрактов лекарственных растений
В наших исследованиях по изучению антиоксидантной активности экстрактов мы использовали тест-систему, основанную на способности исследуемого образца ингибировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате печени мышей [39].
В таблице 3 представлены данные по изучению АОА экстрактов лекарственных растений. Результаты оценки антиоксидантного действия экстрактов сборов лекарственного растительного сырья свидетельствуют о том, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают экстракты более богатых по составу сборов, а следовательно, и более богатых по содержанию биологически активных веществ, прежде всего фенольных соединений, которые являются наиболее активными антиоксидантами растительного происхождения. Флавоноиды в силу своей химической природы играют детерминирующую роль в антирадикальном действии, предотвращая образование АФК и свободных радикалов различной природы.
При разработке БАД, предназначенной для онкологических больных в качестве средства детоксицирующего и общеукрепляющего действия, нами было проведено изучение влияния ряда экстрактов, различающихся по АОА на рост экспериментальных опухолей у животных и влияния на терапевтическое действие широко используемого в онкологической практике противоопухолевого препарата - ДЦП.
Были выбраны 4 экстракта сборов с разной АОА: №20 (18,6±1,8 ед.акт7мг) №2 (13,8±2,7 ед.акт./мг) №19 (9,0±1,5 ед.акт./мг) №24 (3,0+0,8 ед.акт./мг). Эксперименты проводили на 350 мышах-гибридах BDF1 самках с карциномой легких Льюис (LLC) и лимфоидной лейкемией L1210, привитой подкожно. Экстракты вводили перорально животным с LLC в разовых дозах - 0,05; 0,25; 0,50 и 1,0г/кг в течение 28 суток (курсовые дозы - 1,4; 7,0; 14,0 и 28,0г/кг, соответственно) и с L1210 в тех же дозах в течение 8 суток (курсовые дозы -0,4; 2,0; 4,0 и 8,0г/кг, соответственно).
Исследования по изучению влияния экстрактов №2, №19, №20 и №24 на рост опухолей LLC и L1210 показали, что многократное введение экстрактов в диапазоне используемых доз не оказывало стимулирующего действия в отношении экспериментальных опухолей. Применение экстрактов у животных с опухолью не вызывало видимых токсических реакций: изменения внешнего вида, двигательной активности, гибели от острой токсичности.
При этом введение экстракта №20 в разовой дозе 0,5 г/кг в течение 28 дней (курсовая доза 14г/кг) приводило к непродолжительному (в течение 7 дней) торможению роста LLC и к 17 дню ТРО составляло 25+6%, а также способствовало увеличению продолжительности жизни животных на 8+1%. Использование этого же экстракта в разовой дозе 0,5г/кг в течение 8 дней (курсовая доза 4г/кг) у животных с лимфолейкозом L1210 также вызывало биологически незначимое торможение роста опухоли, которое на 4-ый и 7-ой дни роста опухоли составляло 38+4% и 29±3%, соответственно. Продолжительность жизни животных с L1210 в контрольной группе животных не отличалась от таковой в группе с использованием экстракта №20.
Таким образом, выбранные нами экстракты, различающиеся по АОА не стимулируют опухолевый рост, напротив, экстракт №20, имеющий высокую антиоксидантную активность проявляет слабое противоопухолевое действие. Это связано, по мнению авторов, с наличием БАВ, в том числе, фенольных соединений, способных оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки и опосредованное, обусловленное детоксицирующими и иммуномодулирующими свойствами.
Эксперименты по изучению влияния экстрактов на терапевтическое и токсическое действие ДДП проводили на 400 мышах-гибридах линии BDF1 самцах с LLC. ДДП вводили однократно в/б в разовых дозах 8мг/кг и ЮмгУкг. Экстракты вводили на следующие сутки после ДДП перорально многократно в разовых дозах 0,25 и 0,5 г/кг в течение 28 суток (курсовые дозы — 7 и 14г/кг, соответственно).
Показали, что многократное введение экстрактов в диапазоне используемых доз не приводило к уменьшению цитотоксического действия ДЦП в отношении LLC при ее однократном введении в дозе 8мг/кг: показатели торможения роста опухоли у животных, получавших экстракты, на все сроки наблюдения были сравнимы с ТРО животных, которым вводили только цитостатик. При этом отмечено слабое потенциирование противоопухолевого эффекта ДДП при ее сочетанном использовании с экстрактом №20 в разовой дозе 0,5г/кг в течение 28 суток (курсовая - 14г/кг): продолжительность жизни животных увеличилась на 12±2%, по сравнению с группой животных, получавших только цитостатик.
Использование ДДП в разовой дозе 10мг/кг животным с LLC приводило к гибели животных от острой токсичности (33±6%), развитию видимых токсических реакций: острой диареи (у 22+7% животных), потере массы тела животных относительно исходной на 15±4%.
Применение животным с опухолью экстрактов №2, №19, №20 и №24 в разовых дозах 0,25 и 0,5г/кг (курсовые - 7 и 14г/кг, соответственно) на фоне введения ДДП в разовой дозе 10мг/кг оказывало протективное действие относительно токсических эффектов цитостатика: уменьшалось количество случаев острой диареи и потери массы тела животных относительно исходной. При этом в группе животных, получавших ДДП и экстракт№20, не отмечено гибели от острой токсичности, вызванной введением ДДП в дозе 10мг/кг.
Оценка антиканцерогенного действия БАД «Антиоксифит»
Успехи современных методов лечения опухолевых заболеваний привели к значительному увеличению продолжительности жизни больных. Это, в свою очередь, обусловило рост метахронных опухолей, что может быть связано как с реализацией «молчащих» опухолевых очагов, которые успели реализоваться с годами, так и с индукцией неопластических изменений предыдущим использованием методов консервативной противоопухолевой терапии. Помимо роста вторых опухолей наблюдается неуклонный рост первичной заболеваемости злокачественными новообразованиями. Эти процессы обуславливают все большую актуальность проблемы профилактики онкологических заболеваний, то есть проблемы разработки и применения средств, препятствующих неопластической трансформации клеток и дальнейшему развитию опухолей.
Известно, что одним из инициирующих моментов канцерогенеза является активация окислительных процессов. Избыточные свободные радикалы могут оказывать прямое действие на генетический аппарат клеток, вызывая поломки в геноме (точковые мутации, генные делеции и др.), нарушающие нормальную функцию генов и кодируемых ими белков. С другой стороны, избыточные органические и кислородные радикалы приводят к напряжению окислительно-антиокислительного баланса в клетках, повышению перекисного окисления липидов мембран, в результате чего инактивируются мембрано-связанные ферментные системы, нарушаются межклеточные контакты. В результате нарушается сбалансированное протекание биохимических процессов жизнедеятельности клеток: гликолиза, окислительного фосфорилирования, синтеза белков, нуклеиновых кислот и др., что способствует еще большей изоляции клетки, искажению генетического аппарата и в конечном итоге приводит к неопластической трансформации. Учитывая вышеизложенное, представляется перспективным использование в качестве профилактических средств антиоксидантов, обеспечивающих инактивацию свободных радикалов.
Высокая антиоксидантная активность БАД «Антиоксифит» позволила предположить наличие у нее антиканцерогенных свойств.
Изучение антиканцерогенных свойств этой БАД проведено на модели химически индуцированной фибросаркомы мягких тканей у мышей. В качестве индуктора опухоли использовали канцероген - 20-метилхолантрен. Исследования, проведенные нами на мышах с индуцированными 20-МХ опухолями показали, что первые признаки внешних изменений у животных: облысение в области бедра, пигментация и образование олеом, характеризующих реактивное состояние ткани в месте введения масляного раствора канцерогена, появляются на 30-40 день после введения канцерогена.
При оценке эффективности БАД «Антиоксифит» в отношении частоты возникновения олеом отмечено, что в группе животных, получавших БАД «Антиоксифит» в режиме Аф -» 20-МХ - Аф, на 60 день после введения 20-МХ частота образования олеом была в 2,7 раз меньше, чем в контрольной группе.
Макроскопически все опухоли, представленные на фотографии, выглядели как четко контурированные узлы с выраженным инфильтративным ростом, располагающиеся в толще мышечной ткани. Микроскопически все опухоли, удаленные на 80-90 сутки после введения 20-МХ, представлены фибробластоподобными клетками и имеют полиморфную организацию, сочетая в себе признаки дифференцированной и низкодифференцированной фибросаркомы. Так, в структуре опухолей наблюдаются как участки, в которых паренхима преобладает над волокнистой стромой, так и области с преобладанием стромьг над паренхимой опухоли. В ряде случаев отмечен выраженный ядерный полиморфизм. Как правило, в структуре опухолей располагается множество кровеносных сосудов различной степени зрелости. В краевых участках наблюдается повышенная митотическая активность клеток, аномальные митозы, В некоторых опухолях обнаружены гигантские многоядерные клетки. Лейкоцитарная инфильтрация выражена слабо или отсутствует. Во всех изученных случаях опухоли активно инвазируют в окружающую мышечную ткань. Таким образом, новообразования в области введения 20-МХ имеют злокачественную природу и по морфологическим признакам относятся к фибросаркомам - опухолям мезенхимального происхождения.
В таблице 8 представлены данные о частоте образования истинных опухолей у животных. Как видно из представленных данных, пероральное введение БАД «Антиоксифит» во всех исследованных режимах способствует уменьшению частоты образования истинных опухолей у животных.
Наиболее выраженное химиопрофилактическое действие БАД проявляется при ее введении до и после канцерогена. На рисунке 10 представлены данные о влиянии БАД «Антиоксифит» на индуцированную 20-МХ фибросаркому мягких тканей.
