Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Противоопухолевые препараты, индуцирующие апоптоз опухолевых клеток 9
1.2. Молекулярные механизмы действия препаратов группы платина 11
1.2.1. Взаимодействие цисплатина с ДНК 11
1.2.2. Соединения платины и апоптоз 14
1.2.3. Лекарственная резистентность и соединения платины 29
1.2.4.Маркеры резистентности к цисплатину 32
1.2.5.Трансмембранный перенос соединений платины и их локализация в клетке 33
1.3. Характеристика методов регистрации апоптоза 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Материалы и реактивы 41
2.2. Клеточные линии 42
2.3. Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов МТТ-тестом 43
2.4. Проточно-цитофлуориметрический анализ 44
2.5. Определение апоптоза методом двойного окрашивания 45
2.6. Определение активной каспазы-3 46
2.7.Исследование апоптоза методом TUNEL с использованием набора 47
Глава 3. Оценка цитотоксической активности препаратов группы платина с использованием МТТ - теста 49
3.1. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии Jurkat (Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека) 50
3.2.Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии Raji (В-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека) 52
3.3. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии U 937(моноцитарная лимфома) 54
3.4. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии T47D (рак молочной железы) 56
3.5. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии меланомы человека mel Р 58
3.6. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии рака предстательной железы PC - 3 60
3.7. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии рака молочной железы MCF-7 62
3.8. Обобщение результатов полученных методом МТТ 64
Глава 4. Исследование лекарственно-индуцированного апоптоза методами проточной цитофлуориметрии 69
4.1. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3, Tunel на клеточной линии Jurkat 70
4.2. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3, Tunel на клеточной линии Raji 78
4.3. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/РІ, каспазы-3, Tunel на клеточной линии U937 87
4.4. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/РІ, каспазы-Зна клеточной линии mel Р 93
4.5. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3 на клеточной линии SKOV-3 98
4.6. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3-3, на клеточной линии MCF-7 103
4.7. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/РІ, каспазы-3 на клеточной линии T47D 108
4.8. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного
окрашиваниия Аннексин/РІ, каспазы-3 на клеточной линии РС-3 113
Глава 5. Заключение 116
Выводы 124
Список литературы 125
- Лекарственная резистентность и соединения платины
- Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов МТТ-тестом
- Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии Jurkat (Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека)
- Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3, Tunel на клеточной линии Jurkat
Введение к работе
В соответствии с современными представлениями, злокачественную опухоль можно рассматривать как заболевание клетки, в основе которого лежит повреждение ее генома, вследствие чего возникает нарушение четко сопряженных в нормальной клетке процессов пролиферации и дифференцировки в сторону усиления пролиферации, снижение способности к физиологическому механизму гибели клеток — апоптозу - программе самоликвидации, заложенной в геноме всех клеток. Исследования конца 20 века привели к формированию концепции, согласно которой в ответ на первичные повреждения внутриклеточных мишеней противоопухолевыми препаратами разного механизма действия в опухолевой, клетке происходит индукция апоптоза. Особое место в этом аспекте занимают препараты, относящиеся к группе комплексных соединений платины.
С момента открытия цисплатина Б. Розенбергом в 1960 году как соединения, обладающего противоопухолевой активностью, прошло около 45 лет; за это время интерес к поиску новых комплексных соединений платины возрос. В настоящее время, помимо цисплатина широко используются такие препараты как карбоплатин, оксалиплатин, а также проходят испытания ряд новых комплексных соединений платины третьего поколения: таких как сатраплатин, недаплатин, ZD0473 (JM 473), BBR3464 [74].
Среди комплексных соединений двухвалентной платины большой интерес представляет отечественный препарат циклоплатам - 8(-)-малатоамин (циклопентиламин) платино(П), который был синтезирован П.А. Чельцовым в лаборатории координационных соединений платиновых металлов Института общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН. Циклоплатам обладает хорошей растворимостью в воде, широким спектром и высокой противоопухолевой активностью, отсутствием нефротоксичности и перекрестной резистентности с известными платиновыми и некоторыми цитостатиками других групп [12]. Лиофилизированная форма циклоплатама,
разработанная в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН разрешена для медицинского применения при раке яичников, мезотелиоме плевры и множественной миеломе. Получены частичные ремиссии у больных плоскоклеточным раком легкого, желудка, яичников и шейки матки. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина при монотерапии рака яичников эффективность препарата достигала 54%. Циклоплатам применялся при лечении рака предстательной железы - в монотерапии и в комбинации с винбластином. У больных с гормонорезистентным раком предстательной железы при монотерапии объективный эффект достигнут в 7% случаев, в 30% -в комбинации с другими препаратами.
Молекулярные механизмы действия циклоплатама мало изучены. Как и у других препаратов комплексных соединений платины, мишенью цитотоксического действия циклоплатама является суперспиральная ДНК. При сравнительном изучении в опытах in vitro циклоплатам в терапевтической концентрации оказался более эффективным при действии на ДНК, чем цисплатин [9]. При этом воздействие циклоплатама на ДНК клеток лейкоза in vivo может быть обнаружено уже через 24 час. В механизмах действия-циклоплатама показано, что он модулирует р-адренорецепторную активность плазматической мембраны [8]. Имеются данные об ингибирующем влиянии циклоплатама на протеинкиназу С [18].
Несмотря на такой большой интерес к циклоплатаму в клинике in vitro этот препарат был изучен мало.
Цель работы - изучить индукцию апоптоза отечественным противоопухолевым препаратом циклоплатамом в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином.
Задачи исследования.
Оценить цитотоксическую активность противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина на клеточные линии с применением МТТ - теста.
Сравнить цитотоксическую активность циклоплатама с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатином.
Оптимизировать условия индукции и регистрации апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами in vitro.
Оценить лекаретвешю-индуїпфованньш апоптоз на клеточных линиях с применением современных методов регистрации апоптоза.
Изучить влияние на апоптоз циклоплатама в сравнении с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатином.
Научная новизна исследования. Показана цитотоксическая активность циклоплатама в сравнении с цисплатином, карбоплатином, оксалиплатином на клеточных линиях лимфобластоидного, моноцитарного, меланоцитарного и эпидермального происхождения. Впервые показана способность отечественного противоопухолевого препарата платины второго поколения — циклоплатама - индуцировать апоптоз клеток линий Raji, U937, MelP, MCF-7, T47D, SKOV-3. Проведена оценка действия циклоплатама на апоптоз в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином. Применено три принципиально различных методических приема для определения популяционного анализа лекарственно-индуцированного апоптоза с использованием проточной цитофлуориметрии.
Практическая значимость исследования. Сочетание методов определения лекарственно - индуцированного апоптоза in vitro может найти применение для скрининга новых соединений и веществ с потенциальной противоопухолевой активностью и изучения их механизмов действия.
Лекарственная резистентность и соединения платины
Как следует из анализа накопленных экспериментальных данных, причиной быстрой гибели клеток при химиотерапии с применением ДНК-повреждающих агентов является в основном апоптоз, а нарушение апоптотической программы ведет к снижению лекарственной чувствительности опухолей. Основные компоненты апоптотической системы в норме конститутивно присутствуют в клетке и предназначены исключительно для исполнения программы клеточной гибели. Эти компоненты находятся в латентном состоянии и могут быть приведены в действие в результате смещения баланса про- и антиапоптических сигналов. Испытав потенциально опасное для жизни воздействие — генотоксический стресс, клетка отвечает на него активацией адаптационных систем выживания, направленных на преодоление возможных последствий вызвавшего его опасного воздействия. Первой реакцией клетки на возникшие повреждения ДНК является попытка их репарации. При безуспешности этого процесса активируется каскад сигнальных реакций, приводящих к апоптозу. Белок р53 традиционно считается опухолевым супрессором. Активация р53 происходит в ответ на различные типы стресса, включая повреждения ДНК химическими агентами [70]. Активация р53 приводит либо к остановке клеточного цикла в одном из «сверочных точек», либо к индукции апоптоза. Выбор между этими возможностями зависит от характера стресс-сигнала и типа клеток. Противоопухолевая активность р53 включает несколько независимых сценариев: 1. Индукция гена Waf-l/p21, который, являясь ингибитором циклин-зависимых киназ, вызывает арест клеточного цикла в G1/S. Даун-регуляция гена Waf-1 увеличивает чувствительность клеток к цисплатин-индуцированному апоптозу. Кроме того, р53 инактивирует белок -PCNA, входящий в состав ДНК полимеразы. Отсутствие этого белка в ДНК-полимеразном комплексе приводит к аресту ДНК синтеза в репликативной вилке; 2. Индукции проапоптического гена семейства Вс1-2 - Вах приводит к элиминированию клеток, трансформированных онкогеном, через апоптоз, индуцированньш митохондриями; 3. Связывание р53 непосредственно с точкой инициации репликации ДНК останавливает синтез ДНК; 4. р53 останавливает G2/M арест путем активации Bad; 5. р53 специфическое взаимодействие с вирусными белками Т антигена SV40 или Е6 папиломавируса ингибирует функцию р53. Инактивация р53, наблюдаемая в большинстве опухолей, рассматривается как нежелательное и опасное событие. Потеря клетками функционально активного р53 повышает чувствительность к апоптозу. Роль р53 в регуляции ответа клетки на повреждающие ДНК воздействия настолько важна, что клетки с дефектным р53 становятся чувствительными даже к трансплатину, препарату со значительно меньшей цитотоксичностыо, чем цисплатин [2,3,24,50]. Пристальное исследование апоптического действия цисплатина позволило выявить и р53-независимый путь клеточной гибели. р53-независимый путь индукции апоптоза реализуется в клетках с нерепарабельными повреждениями ДНК: апоптический сигнал исходит от белков, осуществляющих контроль решшкационной стабильности, в частности от hMLHl, который узнает двухнитевую сшивку ДНК-платина. В этом случае апоптоз включается через активацию с-АЫ и р73 [52]. Таким образом, MMR белки являются «детекторами» чувствительности к нерепарабельным повреждениям ДНК: клетки с инактивированными hMLHl hMSH3 генами, как правило, резистентны к цисплатину. Некоторые авторы связывают цисплатин-индуцированньїй апоптоз с аутокринной активацией рецепторно-лигандного сигнального пути: применение цисплатина вызывает транскрипционную активацию гена, кодирующего CD95, и экспрессию на поверхности клетки-мишени соответствующего белкового продукта. Экспрессия CD95 в ответ на цисплатин не удивительна, поскольку CD95 является одним из проявлений адаптационного синдрома. Существует прямая корреляция между уровнем экспрессии опухолевыми клетками CD95 и эффективностью противоопухолевой химиотерапии. Наблюдаемый синергизм в действии цисплатина и агонистических анти-Fas антител в индукции апоптоза был продемонстрирован на нескольких линиях клеток [89]. Гиперэкспрессия антиапоптического белка Вс1-2, вовлекающегося в митохондриальный путь индукции апоптоза, является одной из реальных причин становления резистентности опухолевых клеток к химиотерапии. И потому несколько неожиданными оказались результаты по трансфекции эпителиальных клеток Всі-2. Вместо ожидаемого ингибирования апоптоза повышенный уровень Вс1-2 увеличивает чувствительность клеток к цисплатин индуцированному апоптозу. Параллельно имело место даун-регуляция другого антиапоптического белка - Bcl-XL [199]. Возможно вклад Bcl-XL в преодоление возможных последствий, вызванных цисплатином, является более весомым, чем гиперэкспрессия Вс1-2. Апоптоз, как известно, протекает по одному из двух путей - каспаз-зависимому и каспаз-независимому[71]. Исследования вопроса, какой из двух возможных сценариев индукции апоптоза реализуется в клетке в ответ на воздействие цисплатина, привели к заключению, что принятие клеткой решения на самоликвидацию лимитируется тем, является ли клетка цисплатин-чувствительной или цисплатин резистентной. Анализ данных, полученных на нескольких линиях клеток, указывает на включение каспазо-3-независимого апоптоза в цисплатин чувствительных клетках, в то время как цисплатин-резистентные клетки уходят в апоптоз по каспаз-3-зависимому пути индукции апоптоза [61]. В некоторых типах опухолевых клеток цисплатин активирует и митохондриальный путь включения апоптоза, и рецептор-индуцированньїй апоптоз. В этом случае, оба пути передачи сигнала смерти пересекаются на стадии активации каспаз. Ингибиторы каспаз, как и следовало ожидать, предохраняют клетки (более 80%) от цисплатин-индуцированной гибели [84]. В передачу сигнала смерти цисплатином вовлекаются и ряд внутриклеточных сенсоров, иншшируїоших активацию каспаз от стимулов, происходящих внутри самой клетки. Протеинкиназа С (РКС), или Са , фосфолипид-зависимая протеинкиназа, занимает ключевое место в системе внутриклеточной коммуникации. РКС модулирует многие клеточные функции, в том числе и апоптоз. В последнее время РКС становится объектом исследований и в области противоопухолевой химиотерапии из-за возможного участия в реализации цитотоксического эффекта противоопухолевых препаратов. Как обсуждалось ранее, комплексные соединения платины, кроме ДНК, имеют также цитоплазматические и мембранные мишени, и прежде всего, среди белков, утилизирующих ионы Са в клетке. Недавно было показано, что цисплатин вызывает временное и дозо-зависимое увеличение экспрессии каталитической субъединицы протеин киназы С дельта [21]. Протеинкиназа С делта (РК 3) контролирует целостность цитоскелета клетки, а также активно вовлекается в апоптоз. Являясь одним из первых субстратов активированной каспазы-3, молекула протеинкиназы разрезается на два фрагмента при этом С-концевой фрагмент (47 кДа) сохраняет киназную активность и является сильным апоптогеном. Наблюдаемый синергизм в действии цисплатина и активаторов РКС в увеличении активности каспазы-3 указывает на существование в клетке нескольких путей включения программы самоликвидации, активируемых цисплатином.
Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов МТТ-тестом
Как следует из анализа накопленных экспериментальных данных, причиной быстрой гибели клеток при химиотерапии с применением ДНК-повреждающих агентов является в основном апоптоз, а нарушение апоптотической программы ведет к снижению лекарственной чувствительности опухолей. Основные компоненты апоптотической системы в норме конститутивно присутствуют в клетке и предназначены исключительно для исполнения программы клеточной гибели. Эти компоненты находятся в латентном состоянии и могут быть приведены в действие в результате смещения баланса про- и антиапоптических сигналов. Испытав потенциально опасное для жизни воздействие — генотоксический стресс, клетка отвечает на него активацией адаптационных систем выживания, направленных на преодоление возможных последствий вызвавшего его опасного воздействия. Первой реакцией клетки на возникшие повреждения ДНК является попытка их репарации. При безуспешности этого процесса активируется каскад сигнальных реакций, приводящих к апоптозу. Белок р53 традиционно считается опухолевым супрессором. Активация р53 происходит в ответ на различные типы стресса, включая повреждения ДНК химическими агентами [70]. Активация р53 приводит либо к остановке клеточного цикла в одном из «сверочных точек», либо к индукции апоптоза. Выбор между этими возможностями зависит от характера стресс-сигнала и типа клеток. Противоопухолевая активность р53 включает несколько независимых сценариев: 1. Индукция гена Waf-l/p21, который, являясь ингибитором циклин-зависимых киназ, вызывает арест клеточного цикла в G1/S. Даун-регуляция гена Waf-1 увеличивает чувствительность клеток к цисплатин-индуцированному апоптозу. Кроме того, р53 инактивирует белок -PCNA, входящий в состав ДНК полимеразы. Отсутствие этого белка в ДНК-полимеразном комплексе приводит к аресту ДНК синтеза в репликативной вилке; 2. Индукции проапоптического гена семейства Вс1-2 - Вах приводит к элиминированию клеток, трансформированных онкогеном, через апоптоз, индуцированньш митохондриями; 3. Связывание р53 непосредственно с точкой инициации репликации ДНК останавливает синтез ДНК; 4. р53 останавливает G2/M арест путем активации Bad; 5. р53 специфическое взаимодействие с вирусными белками Т антигена SV40 или Е6 папиломавируса ингибирует функцию р53. Инактивация р53, наблюдаемая в большинстве опухолей, рассматривается как нежелательное и опасное событие. Потеря клетками функционально активного р53 повышает чувствительность к апоптозу. Роль р53 в регуляции ответа клетки на повреждающие ДНК воздействия настолько важна, что клетки с дефектным р53 становятся чувствительными даже к трансплатину, препарату со значительно меньшей цитотоксичностыо, чем цисплатин [2,3,24,50]. Пристальное исследование апоптического действия цисплатина позволило выявить и р53-независимый путь клеточной гибели. р53-независимый путь индукции апоптоза реализуется в клетках с нерепарабельными повреждениями ДНК: апоптический сигнал исходит от белков, осуществляющих контроль решшкационной стабильности, в частности от hMLHl, который узнает двухнитевую сшивку ДНК-платина. В этом случае апоптоз включается через активацию с-АЫ и р73 [52]. Таким образом, MMR белки являются «детекторами» чувствительности к нерепарабельным повреждениям ДНК: клетки с инактивированными hMLHl hMSH3 генами, как правило, резистентны к цисплатину. Некоторые авторы связывают цисплатин-индуцированньїй апоптоз с аутокринной активацией рецепторно-лигандного сигнального пути: применение цисплатина вызывает транскрипционную активацию гена, кодирующего CD95, и экспрессию на поверхности клетки-мишени соответствующего белкового продукта. Экспрессия CD95 в ответ на цисплатин не удивительна, поскольку CD95 является одним из проявлений адаптационного синдрома. Существует прямая корреляция между уровнем экспрессии опухолевыми клетками CD95 и эффективностью противоопухолевой химиотерапии. Наблюдаемый синергизм в действии цисплатина и агонистических анти-Fas антител в индукции апоптоза был продемонстрирован на нескольких линиях клеток [89]. Гиперэкспрессия антиапоптического белка Вс1-2, вовлекающегося в митохондриальный путь индукции апоптоза, является одной из реальных причин становления резистентности опухолевых клеток к химиотерапии. И потому несколько неожиданными оказались результаты по трансфекции эпителиальных клеток Всі-2. Вместо ожидаемого ингибирования апоптоза повышенный уровень Вс1-2 увеличивает чувствительность клеток к цисплатин индуцированному апоптозу. Параллельно имело место даун-регуляция другого антиапоптического белка - Bcl-XL [199]. Возможно вклад Bcl-XL в преодоление возможных последствий, вызванных цисплатином, является более весомым, чем гиперэкспрессия Вс1-2. Апоптоз, как известно, протекает по одному из двух путей - каспаз-зависимому и каспаз-независимому[71]. Исследования вопроса, какой из двух возможных сценариев индукции апоптоза реализуется в клетке в ответ на воздействие цисплатина, привели к заключению, что принятие клеткой решения на самоликвидацию лимитируется тем, является ли клетка цисплатин-чувствительной или цисплатин резистентной. Анализ данных, полученных на нескольких линиях клеток, указывает на включение каспазо-3-независимого апоптоза в цисплатин чувствительных клетках, в то время как цисплатин-резистентные клетки уходят в апоптоз по каспаз-3-зависимому пути индукции апоптоза [61]. В некоторых типах опухолевых клеток цисплатин активирует и митохондриальный путь включения апоптоза, и рецептор-индуцированньїй апоптоз. В этом случае, оба пути передачи сигнала смерти пересекаются на стадии активации каспаз. Ингибиторы каспаз, как и следовало ожидать, предохраняют клетки (более 80%) от цисплатин-индуцированной гибели [84]. В передачу сигнала смерти цисплатином вовлекаются и ряд внутриклеточных сенсоров, иншшируїоших активацию каспаз от стимулов, происходящих внутри самой клетки. Протеинкиназа С (РКС), или Са , фосфолипид-зависимая протеинкиназа, занимает ключевое место в системе внутриклеточной коммуникации. РКС модулирует многие клеточные функции, в том числе и апоптоз. В последнее время РКС становится объектом исследований и в области противоопухолевой химиотерапии из-за возможного участия в реализации цитотоксического эффекта противоопухолевых препаратов. Как обсуждалось ранее, комплексные соединения платины, кроме ДНК, имеют также цитоплазматические и мембранные мишени, и прежде всего, среди белков, утилизирующих ионы Са в клетке. Недавно было показано, что цисплатин вызывает временное и дозо-зависимое увеличение экспрессии каталитической субъединицы протеин киназы С дельта [21]. Протеинкиназа С делта (РК 3) контролирует целостность цитоскелета клетки, а также активно вовлекается в апоптоз. Являясь одним из первых субстратов активированной каспазы-3, молекула протеинкиназы разрезается на два фрагмента при этом С-концевой фрагмент (47 кДа) сохраняет киназную активность и является сильным апоптогеном. Наблюдаемый синергизм в действии цисплатина и активаторов РКС в увеличении активности каспазы-3 указывает на существование в клетке нескольких путей включения программы самоликвидации, активируемых цисплатином.
Исследование механизмов запуска апоптоза цисплатином позволило предположить возможность индукции клеточной гибели без дополнительной активации транскрипции генов апоптической системы (ядерно-независимый путь включения апоптоза) [81]. Показана индукция цисплатином апоптоза в цитопластах - клетках, где нет ядра. Инициация апоптоза связана с цисплатин-индущгоованными повреждениями эндоплазматического ретикулума (ER), которые с одной стороны активируют каспазу-12, ответственную за целостность ER, с другой стороны - включают кальпаин-зависимую активацию каспазы-3 [104].
Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии Jurkat (Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека)
При увеличении концентрации цитостатиков до 0,5 10"5М выживаемость опухолевых клеток для циклоплатама снизилась и составила 46,3%, для цисплатина практически не изменилась - 97,7% (р 0,01), для оксалиплатина снизилась на 13,9% и составила 53,0% (р 0,01), для карбоплатина процент выживаемости не изменился и составил 100% (р 0,01).При концентрации 1хЮ"5М выживаемость клеток для циклоплатама составила 22,3%, для цисплатина 77,9% (р 0,01), для оксалиплатина процент выживаемости снизился на 16,8% и составил 36,2%, для карбоплатина 93% (р 0,01), соответственно. При концентрации О хЮ М выживаемость для циклоплатама составила 18,7%, для цисплатина 53,9% (р 0,01), для оксалиплатина 26,8% (р 0,01), для карбоплатина 84,6% (р 0,01) соответственно.
При увеличении концентрации цитостатиков до ІхЮ М выживаемость опухолевых клеток для циклоплатама составила 14% для цисплатина 20,6% (р 0,01), для оксалиплатина 18,2% (р 0,01), для карбоплатина 65,7% (р 0,01) соответственно.
На основе полученных данных были построены кривые «доза-эффект» и было определено значение ИК50 (концентрация, при которой погибало 50% клеток). ИК5о для циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина составило 0,4 10"5М, 5,5хЮ"5М, 0,6хЮ"5М соответственно. Для карбоплатина значение ИК50 получено не было.
Таким образом, из полученных данных, можно сделать следующие выводы: все препараты обладают цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам линии Jurkat. Выживаемость опухолевых клеток зависит от используемого препарата и концентрации цитостатика. При увеличении концентрации препаратов уменьшается процент живых клеток и наоборот.
При сравнении циклоплатама с оксалиплатином в концентрации 1x10" достоверных различий между действием этих препаратов на выживаемость опухолевых клеток не выявлено (р 0,05). Выживаемость опухолевых клеток под действием циклоплатама в сравнении с цисплатином и карбоплатином ниже, так, при использовании концентрации 0,5х10-5М процент живых клеток для циклоплатама составил 46,3%, тогда как для цисплатина и карбоплатина 37,7% и 100% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью по сравнению с цисплатином, карбоплатином.
Циклоплатам имеет схожий эффект с оксалиплатином, о чем свидетельствуют значения ИК50 (0,4х10 5М и 0,6х10"5М соответственно).
Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии Raji (В-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека).
При исследовании цитотоксической активности химиопрепаратов группы платина в отношении клеточной линии Raji, были получены следующие результаты (табл. 3): под действием препаратов в концентрации lxlO"6 процент живых клеток для циклоплатама составил 61,4%, для цисплатина 79,9% (р 0,05), для оксалиплатина 52,5% (р 0,01), для карбоплатина 97,5 % (р 0,01). При увеличении концентрации цитостатиков до 0,5хЮ"5М выживаемость опухолевых клеток для циклоплатама незначительно снизилась и составила 55,1%, для цисплатина снизилась на 21,7% и составила 58,2% (р 0,05), для оксалиплатина снизилась на 16,2% и составила 36,3% (р 0,01), для карбоплатина процент выживаемости практически не изменился и составил 93,4% (р 0,01). При концентрации 1хЮ"5М выживаемость клеток для циклоплатама уменьшилась на 22,1% и составила 33%, для цисплатина 42,2% (р 0,01), для оксалиплатина процент выживаемости практически не изменился и составил 29,6%, что является статистически недостоверным по сравнению с циклоплатамом (р 0,05), для карбоплатина процент живых клеток составил 93% (р 0,01).При концентрации О хКҐ М процент живых клеток для циклоплатама составил 11,5%, для цисплатина 27,1% (р 0,05), для оксалиплатина 25,3% (р 0,01), для карбоплатина 77,6% (р 0,01), соответственно. При увеличении концентрации цитостатиков до ІхЮ М выживаемость опухолевых клеток для циклоплатама составила 6,4% для цисплатина 9,7% что в сравнении с циклоплатамом не является статистически достоверным (р 0,05), для оксалиплатина 12,5% (р 0,01), для карбоплатина 59,7% (р 0,01) соответственно.
Из полученных результатов можно сделать следующие выводы: статистически достоверных различий не выявлено при сравнении циклоплатама с цисплатином в концентрации 0,5 10"5M, lxlO M, а также циклоплатама с оксалиплатином в концентрации 1 10"5М. При сравнении циклоплатама с оксалиплатином последний обладает большей цитотоксической активностью в концентрациях lxlO M, 0,5xlO M. Так, при использовании концентрации 1 10" процент живых клеток для циклоплатама составил 61,4% для оксалиплатина 52,5%, при концентрации 0,5х10 5М - 55,1% и 36,3% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток линии Raji в сравнении с цисплатином и карбоплатином.
На основании полученных данных были определены значения ИК5о для циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина и составили 0,55хЮ"5М, 0,73х10"5М, 0,15х1(Г5М соответственно.
Определение цитотоксической активности противоопухолевых . препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии U 937 (моноцитарная лимфома).
При изучении действия препаратов платины на клеточную популяцию линии U937 мы получили следующие данные (табл. 5): под действием препаратов в минимальной концентрации ІхКУ М, выживаемость клеток для циклоплатама составила 17,2%, для цисплатина 76,9% (р 0,01), для оксалиплатина 85,5% (р 0,01), для карбоплатина 100% (р 0,01).
При увеличении концентрации цитостатиков до 0,5хЮ"5М выживаемость опухолевых клеток снизилась: для циклоплатама на 3,2% и-составила 14%, для цисплатина на 40,4% и составила 36,5% (р 0,01), для оксалиплатина 40,8% и составила 44,7% (р 0,01), для карбоплатина процент выживаемости состави 2% (р 0,01). При концентрации 1 10"5М выживаемость клеток для циклоплатама составила 9,2%, для цисплатина 15,1% (р 0,05), для оксалиплатина процент выживаемости снизился, составил 24%, для карбоплатина 78,2% (р 0,01), соответственно. При концентрации О хЮ М выживаемость для циклоплатама практически не изменилась и составила 8,4%, для цисплатина 14,5% (р 0,05), для оксалиплатина 10,3% (р 0,05), для карбоплатина 60% (р 0,05) соответственно.
Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3, Tunel на клеточной линии Jurkat
В нормальных клетках фосфатидилсерин расположен на внутренней поверхности липидного бислоя плазматической мембраны. На ранних стадиях апоптоза происходит перемещение фосфатидилсерина с внутренней поверхности на внешнюю. Этот процесс можно зафиксировать с помощью антикоагулянтного белка Аннексина V, который специфически связывается с фосфатидилсерином [19].
В связи с тем, что транслокация фосфатидилсерина происходит и в. некротических клетках Аннексии V используют в сочетании с витальным красителем PI. Апоптотические клетки начинают взаимодействовать с. Аннексином V после того, как произошла конденсация хроматина, но до утраты плазматической и ядерной мембранами способности ограничивать проникновение PL В результате живые клетки не сязывают ни Аннексии V, ни. PL Апоптотические клетки с неповрежденной мембраной окрашиваются только Аннексином V, а поздние апоптотические или некротические клетки — и Аннексином V, и PL
Таким образом, окрашивание апоптотических клеток Аннексином V в комбинации с PI позволяет одновременно определить интактные клетки (отрицательные и по Аннексину, и по PI), клетки, находящиеся в апоптозе (положительные по Аннексину V, но отрицательные по PI), и клетки, находящиеся в позднем апоптозе или некрозе (положительные и по Аннексину, и по PI).
Определение активной каспазы-3 после действия препаратов группы платина на клеточные линии различного происхождения. Семейство каспазы - это цистеиновые протеазы, которые играют важную роль в процессе апоптоза. В каспазном каскаде каспаза-3 играет основную роль в дезагрегации ядра во время апоптоза, вызывает фрагментацию ДНК и конденсацию хроматина [57], активирует фактор фрагментации ДНК (DFF) путем его расщепления и тем самым индуцирует образование лестницы ДНК [110]. Таким образом, активная каспаза-3 является маркером ранней стадии апоптоза [55,97]. Определение внутринитевых разрывов ДНК методом TUNEL Как указывалось выше, в процессе апоптоза под действием эндонуклеаз образуются многочисленные разрывы нитей ДНК и, соответственно, большое число свободных 3 концов. Для дальнейшего исследования лекарственно-индуцированного апоптоза был использован метод TUNEL: под действием фермента терминальной дезоксинуклеотид-трансферазы (TdT) к 3 -концу нити ДНК ковалентно присоединяется дезоксиуридинтрифосфат (dUTP), меченый флуоресцентным красителем (F1TC). Таким образом, количество присоединившейся метки пропорционально количеству свободных 3 -концов, т.е. количеству внутринитевых разрывов ДНК. Определение апоптоза методом двойного окрашивания проводили после инкубации клеток линии Jurkat с ииклоплатамом, иисплатином. оксалиплатином, карбоплатином в течение 24, 48, 72 часов (таблица 10). Через 24 часа инкубации с циклоплатамом в концентрациях 0,5х10 5М, 1х10"5М, ІхЮ М количество клеток в раннем апоптозе (AnV PI") составило 14,6%, 34%, 37%, для цисплатина - 2,5%, 12%, 18%, для оксалиплатина - 4% ( р 0,05), 6%, 19% для карбоплатина - 2%, 7,8%, 15,5% соответственно. Количество клеток, положительных по AnV и РҐ" (предположительно поздние апототические или некротические клетки) для циклоплатама составило 3% ( р 0,05), 4%, 36%, для цисплатина 2%, 9,8%, 29,2%, для оксалиплатина 2% ( р 0,05), 2%( р 0 05), 4% ( р 0,05), для карбоплатина 3,9%, 6,0%, 11% соответственно. Через 48 часов под действием циклоплатама количество клеток в раннем апоптозе (Ап\Л PI") увеличилось и составило 25%, 38%, 32%, для цисплатина 6,7%, 14,3%, 24,8%, для оксалиплатина 10%, 13%, 30% (р 0,05), для карбоплатина 4,0%, 11,8%, 18,3% соответственно. Популяция клеток положительных по AnV H РҐ" для циклоплатама составила 22%, 38%, 50%, для цисплатина - 20,8%, 28,6%, 38%, для оксалиплатина - 5% ( р 0,05), 6% ( р 0,05), 20%, для карбоплатина - 8,3%, 15%, 25%. Через 72 часа количество ранних апоптотических клеток (AnV PI") при использовании концентрации 0,5 10 5М для циклоплатама, оксалиплатина, цисплатина увеличилось и составило 60%, 17% и 13,6% соответственно, для карбоплатина не изменилось, и составило 3,6%. Количество поздних апоптотических или некротических клеток (AnV PI ) для циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина незначительно уменьшилось. При использовании дозы 1хЮ"5М ранних апоптотических клеток (AnV PI") для всех препаратов увеличилось и составило для циклоплатама - 62%, для цисплатина - 29,2% для оксалиплатина - 25%, для карбоплатина 14%. Количество поздних апоптотических или некротических клеток (AnV PI") для циклоплатама и цисплатина уменьшилось и составило 24% и 24,7% соответственно, для оксалиплатина и карбоплатина значения практически не изменились и составили 7% ( р 0,05) и 13,2% соответственно. При увеличении дозы (lxlO M) популяция клеток положительных по AnV PI увеличилась для всех препаратов: циклоплатам - 77%, цисплатин -30,4%, оксалиплатин - 39%, карбоплатин — 29,2%. Количество клеток положительных по Ап\Л и РҐ для циклоплатама и оксалиплатина уменьшилось и составило 15% и 14% (р 0,05) соответственно, тогда как для цисплатина и карбоплатина увеличилось и составило 49,9% и 50,6% соответственно. Распределения популяций клеток (AnV/РГ, AnVVPI", АПУТРҐ), В зависимости от времени инкубации и используемой дозы препарата представлены на рисунках 16,17. Таким образом, под действием циклоплатама при инкубации 24 часа количество клеток в раннем апоптозе (AnV PI") и предположительно позднем апоптозе или некрозе (AnV РҐ) увеличивается пропорционально увеличению дозы цитостатика. При увеличении времени инкубации до 48 часов процент клеток в раннем апоптозе и позднем апоптозе или некрозе увеличивается. При инкубации 72 часа процент клеток в раннем апоптозе увеличивается, а в позднем апоптозе или некрозе уменьшается. Для оксалиплатина прослеживается аналогичная тенденция только в сравнении с циклоплатамом количество апоптотических клеток меньше. Под действием цисплатина и карбоплатина прослеживается аналогичная тенденция исключение составляет концентрация ІхЮ М где после инкубации 72 часах % клеток положительных по АпЛЛРҐ увеличивается.
