Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Стационарная спектроскопия биосистем обзор литера туры 12
1.1. Спектрально-флуоресцентные исследования биообъектов 13
1.2. Экспериментальные и теоретические аспекты оптических исследований биосред . 26
1.3. Микроскопические исследованиябиосистем.
ГЛАВА II. Материалы и методы 39
2.1. Материалы исследования и методика их приготовления. 40
2.2. Методика и техника эксперимента 45
2.2.1. Методика измерения спектров флуоресценции и диффузного отражения. 45
2.2.2. Методика спектрофотометрических измерений биотканей. 50
2.2.3. Методика и техника микроскопических исследований. 54
2.3. Методика определения оптических показателей биоктаней . 56
2.4. Анализ погрешнотиизмерений. 62
ГЛАВА III. Экспериментальные результаты исследования оптических и флуоресцентных свойств биообъектов 64
3.1. Стационарные спектры флуоресценции и диффузного отражения патологических биотканей... 65
3.2. Оптические спектры па тологических состояний биотканей. 74
3.3. Микроскопические исследования патологических состояний биотканей 84
ГЛАВА IV. Анализ экспериментальных результатов и их обсуждение 98
4.1. Влияния патологических процессов на диффузно-оптичекие свойства биообъектов
4.2. Влияние оптического поглощения и светорассеяния на формирование спектров лазерно-индуцированной флуоресценции биообъектов при различных патологическх состояниях . 114
4.2.1. Определение спектров аутофлуоресценциии квантового выхода биотканей 116
4.2.2. Контурный анализ флуоресцентных спектров биотканей. 129
Выводы 142
Заключение 145
Список литературы. 148
- Экспериментальные и теоретические аспекты оптических исследований биосред
- Методика определения оптических показателей биоктаней
- Микроскопические исследования патологических состояний биотканей
- Влияние оптического поглощения и светорассеяния на формирование спектров лазерно-индуцированной флуоресценции биообъектов при различных патологическх состояниях
Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Возросший в последние годы интерес к различным методам лазерной спектроскопии биообъектов и их патологических состояний, в значительной мере связан со стремительным развитием лучевых методов медицины, а именно лазерной хирургии, терапии и диагностики. В частности, среди множества экспериментальных методов диагностики, к числу которых можно отнести все виды оптической томографии, широкое распространение получили методы, основанные на измерении спектрального распределения и интенсивности диффузных характеристик рассеянного назад света (см., например, [1-3]).
С точки зрения информативности, простоты реализации, отсутствия сложного оборудования и анализа полученных результатов не меньший интерес представляют методы стационарной оптической и флуоресцентной спектроскопии. Данный подход основан на последовательном измерении и комплексном анализе спектров диффузного отражения и лазерно-индуцированной флуоресценции, что позволяет проводить неинвазивные исследования живых систем совместно с лапороскопическими операциями и диагностическими процедурами [1-3]. Известны работы (см., например, [1-4]), в которых спектрально-флуоресцентные исследования использовались для обнаружения различных заболеваний кожи, внутренних органов, сосудов и пр. Однако результаты подобных исследований часто являются неоднозначными, носят качественный характер и не позволяют достоверно дифференцировать степень и промежуточные стадии патологических процессов. К числу причин неоднозначности результатов могут быть отнесены низкий уровень квантового выхода флуоресценции и значительные искажения спектров, вносимые поглощением и объемным светорассеянием самой биоткани. Учесть факторы, искажающие спектры флуоресценции биосред и повысить информативность полученных результатов можно, рассматривая данные флуоресцентных исследований биообъектов в совокупности с их диффузно-оптическими характеристиками. Кроме того, знание оптических параметров биообъектов дает дополнительную информацию об анатомическом строении биоткани, а также их физиологических, морфологических и биохимических параметрах [1-3].
В связи с вышеизложенным, представляется актуальным комплексное исследование излучательных характеристик патологических состояний биотканей как in vivo, так и in vitro с использованием методов стационарной оптической и флуоресцентной спектроскопии, в сочетании с светооптической и флуоресцентной микроскопией.
Целью настоящей работы является исследование спектральных характеристик, а также выявление механизмов и закономерностей формирования стационарных диффузно-оптических и спектрально-флуоресцентных свойств биотканей in vivo в зависимости от вида и степени патологического поражения.
В рамках цели работы решались следующие задачи:
-
Проведение экспериментальных исследований спектров флуоресценции и диффузного отражения биотканей в норме и при различных формах и степени патологического процесса.
-
Проведение спектрофотометрических исследований коэффициентов полного пропускания, полного отражения и коллимированного пропускания биотканей в норме и с патологией в диапазоне длин волн 300-800 нм.
-
Исследование спектров оптических показателей поглощения – , рассеяния – и фактора анизотропии – в диапазоне длин волн 300-800 нм, а также некоторых физиологических и морфологических параметров, характеризующих степень функционального состояния исследуемых биотканей.
-
Исследование квантового выхода и степени искажения спектров аутофлуоресценции, а также проведение спектрального разложения данных флуоресцентных исследований для соответствующих биообъектов с целью количественного восстановления вкладов эндогенных флуорофоров в суммарные спектры свечения.
-
Выполнение гистоморфологических и микрофлуоресцентных исследований с целью изучения динамики структурной организации и пространственного распределения эндогенных флуорофоров в биотканях в процессе развития патологического поражения.
Научная новизна:
-
Характер изменений в экспериментальных спектрах флуоресценции и диффузного отражения биотканей обусловлен, как вкладами эндогенных флуорофоров, так и количественным содержанием в крови, степенью оксигенации и микроструктурой исследуемой среды. По мере развития патологии (от нормы до крайней степени поражения) происходит снижение интенсивности флуоресценции в 5-6 раз, а диффузного отражения до 3 раз во всем исследуемом спектральном интервале.
-
Механизмы и закономерности формирования спектров аутофлуоресценции исследуемых биотканей при различных формах патологического поражения во многом определяются уровнем эффектов их светорассеяния и оптического поглощения, приводящие, как к искажению формы спектрального контура, вследствие изменения вкладов эндогенных флуорофоров, так и к перераспределению интенсивности (до 13 раз) и глубины испускания (в 1.5 раза) спектров аутофлуоресценции.
-
Характер формирования спектральной зависимости аутофлуоресценции и квантового выхода идентичны. Типичное значение квантового выхода для нормальных биотканей составляет примерно 8.510-4 и уменьшается до 4 раз для высоких стадий поражения, а для крайней стадии – незначительно растет. Рост безызлучательной дезактивации флуоресценции происходит вследствие процессов тушения в патологически измененных биотканях.
-
Спектральный контур аутофлуоресценции исследуемых биотканей образован эмиссией семи групп флуорофоров, из которых основными являются молекулы NAD(P)H, структурные белки, а также производные флавиновых и порфириновых групп. По мере развития крайних форм поражения наблюдается снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада NAD(P)H, а также 4-х кратное возгорание коллагеновых и порфириновых групп в результирующем спектре аутофлуоресценции.
-
Оптические спектры поглощения , рассеяния и фактора анизотропии биотканей in vivo при исследуемых формах патологического поражения во многом определяются физиологическим и структурно-морфологическим состоянием последних. Относительно нормы по мере развития средней и высокой стадии поражения наблюдается уменьшение до 3 раз, снижение кровенаполнения и кислородного насыщения, а так же увеличение плотности оптических неоднородностей до 45%. При развитии крайних форм поражения происходит увеличение до значений, близких к здоровым биотканям, а – приблизительно до 2 раз выше нормы, а также увеличение кровенаполнения и размеров рассеивателей, и уменьшение кислородного насыщения и плотности неоднородностей до 5 раз.
Практическая значимость работы:
-
Предложенный в работе научно-методический подход, основанный на комплексном анализе результатов спектрально-флуоресцентных и диффузно-оптических исследований, позволяет в широком интервале длин волн (300-800 нм) с заданной точностью определить спектры оптических показателей, аутофлуоресценцию и степень ее искажения, а также квантовый выход флуоресценции для биотканей in vivo. Полученные результаты могут быть использованы в качестве метода диагностики и мониторинга патологических состояний различных биообъектов в режиме реального времени.
-
Результаты комплексных исследований с использованием диффузно-оптической и флуоресцентной спектроскопии и микроскопии, позволяют существенно повысить качество и уровень диагностируемого процесса различных стадий развития патологических состояний биотканей.
-
Спектры оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии, рассчитанные с использованием предложенного в работе методического подхода, могут быть использованы в медицине в дозиметрических целях при планировании лазерно-терапевтических и диагностических процедур.
Положения, выносимые на защиту:
-
Особенности спектров флуоресценции биотканей желудка с патологией обусловлены как вкладами эндогенных флуорофоров, так и количественным содержанием крови, степенью оксигенации и микроструктурой исследуемых сред.
-
Спектральный контур аутофлуоресценции исследуемых биотканей образован эмиссией семи групп флуорофоров, из которых основными являются молекулы NAD(P)H, структурные белки, а также производные флавиновых и порфириновых групп. Формирование спектров аутофлуоресценции определяются уровнем эффектов их светорассеяния и оптического поглощения, приводящих к искажению формы спектрального контура, вследствие изменения вкладов эндогенных флуорофоров.
-
Патологические изменения в биотканях приводят к росту безызлучательной дезактивации эмиссии аутофлуоресценции, что обусловливает снижение эффективности излучательных процессов.
-
По мере развития патологических процессов наблюдается снижение кровенаполнения и кислородного насыщения, а так же увеличение плотности оптических неоднородностей до 45%, что находит изменение в спектрах диффузного отражения и других оптических характеристиках исследуемых биообъектов.
-
Экспериментальная корреляционная зависимость между спектрально-флуоресцентными и диффузно-оптическими характеристиками биотканей in vivo и степенью их поражения, в том числе процессы малигнизации позволяет ускорить и упростить проведение инвазивных анализов на выявление патологических образований желудка.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях: «Falk Symposium». Basel, 1999; Съезд VIII Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001». Москва; VII Всероссийской конференции «ВНКСФ-7». С.-Петербург, 2001; II Всероссийской конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2001; II, III, IV, V Всероссийские конференции «Физическая электроника». Махачкала; Второй Международный конгресс студентов, молодых ученных и специалистов «Молодежь и наука – третье тысячелетие»/YSTM’02. Москва; XI; Международная конференция «Фазовые переходы, критические и нелинейные явления в конденсированных средах». Махачкала, 2007.
Достоверность полученных результатов проведением исследований по апробированным методикам, на аттестованных исследовательских установках, а также согласием полученных результатов с результатами независимых клинических исследований и экспериментами, которые опубликованы в отечественной и зарубежной научной литературе.
Личный вклад. Все экспериментальные результаты их обработка и анализ выполнен лично автором. Обсуждение моделей наблюдаемых процессов проводилось совместно с научным руководителем, проф. Ашурбековым Н.А. и консультантом Расуловым М.Т.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе в зарубежных журналах – 3 статьи и в журналах, рекомендованных ВАК – 4 статьи, в других журналах – 3 статьи; тезисов докладов в материалах конференций – 12.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав и заключения. Общий объем диссертации 161 страниц (39 рисунков и 5 таблиц). Список цитируемой литературы содержит 138 наименований.
Экспериментальные и теоретические аспекты оптических исследований биосред
Значительный интерес, вызванный в последнее время к оптическим методам исследования мутных случайно-неоднородных сред, каковыми являются многие биоткани, вызван, прежде всего, стремительным развитием лучевых методов медицины, а именно лазерной хирургии [71,72], терапии [72,73] и диагностики [1-3,74,75]. В частности, для корректного определения параметров дозиметрии при проведении процедур лазерно-индуцированной (ЛИТ) или фотодинамической (ФДТ) терапии онкозаболеваний необходимы сведения об особенностях распространения света в биотканях, что определяется оптическими свойствами последних. Необходимость знания оптических параметров (jua, /J.S и g) приобретает первостепенное значение, так же и при ЛИФ-диагностики патологических состояний живых биотканей, что продиктовано сложностью в практическом осуществлении методик исследования, часто требующих модельных апробаций, а так же низким уровнем квантового выхода флуоресценции и влиянием, оказываемым геометрией самих биотканей на эмиссию сигнала. В связи с этим, определению оптических показателей биотканей посвящено огромное количество работ, из числа которых обстоятельные обзоры данного направления содержаться в работах [1-3,75]. В настоящее время для теоретического описания распространения света в биосредах развиты два фундаментальных подхода: теория многократного рассеяния, исходящая из уравнений Максвелла и описывающая волновые свойства рассеянных световых полей в случайно-неоднородной среде (см., например, [1,65,77,78]) и теория переноса излучения (ТПИ), рассматривающая эволюцию потока энергии излучения в аналогичных средах (см., например, [1-3,65,66,75]). Наиболее популярным инструментом при решении практически-важных задач биомедицинских исследований является ТПИ, основу которой составляет уравнение переноса излучения (УПИ) для лучевой интенсивности, распространяющейся в среде с большей долей светорассеяния.
Описание переноса излучения в рамках ТПИ, основано на оптических макропараметрах среды — показателе поглощения (jua), показателе рассеяния (/JS ) и факторе анизотропии (g), которые входят в УПИ как феноменологические параметры. Согласно ТПИ, лучевая интенсивность света L(r,s) в точке F, в отсутствии источников внутри среды, должна ослабляться за счет поглощения и рассеяния на единицу длины вдоль направления s, и усиливаться на единицу длины в направлении s вследствие рассеяния вдоль направлении s : где pt ={/ла + /лs) — показатель экстинкции; p{s,s ) — фазовая функция рассеяния, определяющая вероятность рассеяния света из направления s в направление s \ dQ! — единичный телесный угол в направлении s . На практике фазовую функцию рассеяния принято аппроксимировать аналитической формулой, в качестве которой используют двухпараметрическую функцию Гегенбауэра [1,78], функцию Ми [1,76] или функцию 8-Эддингтона [79]. Однако с точки зрения простоты и практического удобства более предпочтительной является обобщенный вариант функции Гегенбауэра - функция Хени-Гринштейна (см., например, [1-3,65,66,75,80]): \p{cose)cos9sm.9d6, средний косинус угла рассеяния в или о фактор анизотропии. В общем случае УПИ с произвольными граничными условиями аналитического решения не имеет, и поэтому на практике особую важность приобретают методы упрощения УПИ при дополнительных предположениях. В частности, при выполнении условий /ла « (і - g)jus, что для большинства биотканей справедливо в области терапевтического окна и удаленности источников излучения и приемников на расстояние p 21tr (llr = 1/(м, + (і-g)/0 - длина пробега фотона в среде, необходимая для его изотропизации) УПИ может быть преобразовано в диффузионное уравнение [1,65,66]: где и(г) - средняя интенсивность света в точке F среды, определяемая как U(r) = JL(r,s)dQ.; q(r) - функция источника; jueff = j3jua(jua+ s) - коэффициент 4л эффеКТИВНОГО ОСЛаблеНИЯ В Приближении ДиффуЗИОННОЙ Теории, /J, s =(l-g)jus - транспортного показатель рассеяния; D = [з(//а + ju s)\l — коэффициент диффузии фотонов. При этом средняя интенсивность и(г) может быть связана с потоком излучения F(F) соотношением непрерывности:
Определение функций и(г) и F(r) представляет большой практический интерес с точки зрения оптического зондирования или расчета дозы облучения при ЛИТ- и ФДТ-терапии. Для получения воспроизводимых по ним результатов, необходимы достоверные сведения об оптических параметрах исследуемого объекта - jua, jus и g, что является весьма трудоемкой задачей из-за сложной структуры самих биосред и многообразия процессов взаимодействия фотонов с ними. В этой связи, задача по разделению их вкладов в ослабление интенсивности света сопряжена со значительными трудностями. Современные методы определения оптических показателей биотканей предполагают решение обратной задачи УПИ, для чего в стационарной спектроскопии биотканей развиты два подхода — метод пространственной рефлектометрии и классической спектрофотометрии. Первый из них заключается в измерении коэффициента диффузного отражения Rd{p) для объемных биотканей на различных расстояниях р между приемником и источником излучения. Этот метод может быть реализован как при помощи набора световодов малой числовой апертуры, находящиеся в контакте с
Методика определения оптических показателей биоктаней
Определение оптических свойств биотканей, а именно показателей поглощения jua, рассеяния //, и фактора анизотропии g в настоящей работе основано на решении обратной задачи для 3-потоковой модели переноса излучения в рассеивающей среде. Данный метод впервые был предложен в работе [96] и, впоследствии, детально развит в работах [97-99]. Как будет показано ниже, оптические параметры, полученные с использованием 3-потоковой модели, показывают хорошую сходимость с результатами расчетов по методам добавления-удвоения (ДУ) [92,100] и диффузионного приближения (ДП) [65,75,109,110], а в сравнении с данными последнего метода являются более предпочтительными. Описание распространения оптического излучения в рамках 3-потоковой модели заключается в решении системы из трех дифференциальных уравнений, которые связывают между собой три световых потока мигрирующие в рассеивающей среде - одного коллимированного, распространяющегося вперед - Fc(z) и двух диффузных, распространяющихся вперед - F+(z) и назад - F_(г): где F+0 - падающий световой поток; F0_ — диффузный поток, отраженный от верхней границы объекта; Fd+ - диффузный поток, у нижней границы объекта; d - толщина биоткани; rld - коэффициент внутреннего отражения от обеих границ биоткани, определяемый как rld « -1.44л-2 +0.7Ш"1 +0.668 + 0.0636« [66,75], п - относительный показатель преломления исследуемой среды; rspd - коэффициент зеркально-диффузного отражения, определяемый, согласно работе [96], как удвоенное значение коэффициента rspc.
Предполагая, что F+0 = F+(z = 0+) и F0_=F_(z = 0 ), с учетом граничных условий (3) можно записать решение (2) в матричном виде: где анализируемые потоки связаны между собой следующими соотношениями - 0 z d) - коэффициенты, указывающие на величину изменения световых потоков при переходе из одной среды в другую вследствие различия показателей преломления на границе раздела двух сред и являются функциями оптических показателей ца, / и g, а также коэффициентов rspc, rs d и rld. Аналитические выражения для коэффициентов Av(z) даются как: Таким образом, зная необходимые световые потоки при входе в биоткань и при выходе из нее, могут быть определены искомые параметры (/га, jus и g) путем решения обратной задачи для системы уравнений (2.1)-(2.4). Все расчеты по определению оптических показателей биотканей проводились на базе программного пакета MathCad (MathSoft, Inc., США) с использованием численного метода Ньютона-Кортеса. Для ускорения процедуры расчетов в качестве начального приближения использовались данные оптических показателей, полученные методом 2-потоковой модели Кубелки-Мунка [65,94,95]. В целях получения адекватной информации о критериях применимости 3-потоковой модели к задачам определения оптических показателей, в работе рассчитывались значения juai jus и g также в рамках теории диффузионного приближения [65,75,109,110] и метода добавления-удвоения [91,100]. При этом, задача по определению оптических показателей для плоскопараллельных сред в рамках диффузионного приближения (ДП) УПИ сводилась к решению следующей системы уравнений: Mir Mtr где jueff = V3A,l"o + (1-g)i«J - коэффициент эффективного ослабления в приближении диффузионной теории; к0, кг и к2 — соответственно, коэффициенты частного и общего решения диффузионного уравнения, которые являются функциями оптических показателей и определяются из граничных условий для уравнения ДП [65,75].
Решение данной системы было получено, также с использованием программы Mathcad и метода Левенберга-Маркардта. За начальное приближение были взяты оптические показатели, рассчитанные по 2-потоковой модели Кубелки-Мунка. Результаты тестовых расчетов оптических показателей биоткани на некоторых длинах волн, приводятся в таблице №2.1. Как видно из таблицы, оптические показатели, полученные по 3-потоковой модели более близки к данным расчетов метода ДУ. В частности, в интервале длин волн -300-500 нм показатель ца, полученный по ДП, имеет несколько завышенные значения по сравнению с результатами 3-потоковой модели и модели ДУ. Причиной этому, по видимому, является свойство диффузионной теории хорошо описывать излучательные процессы, являющиеся результатом рассеяния высоких порядков (при условии /4,«(l-g)/Oj что ДЛЯ большинства биотканей справедливо в красной и ближней ИК областях спектра. Кроме того, следует отметить, что 3-потоковая модель учитывает коэффициенты зеркального отражения (rsp,c), зеркально-диффузного отражения [г d) и внутреннего отражения от обеих границ биоткани (гш), тогда как в диффузионной теории учитываются два из них - rspc и гш [96].
Микроскопические исследования патологических состояний биотканей
Как известно, достижения современной медицинской диагностики, включающие различные методы визуальной и лазерной эндоскопии, а так же рентгеновской и ультразвуковой интроскопии, позволяют диагностировать различные заболевания, в том числе онкологические новообразования с высоким пространственным разрешением. Однако на практике давно укрепилось правило, что результаты, полученные при помощи указанных выше методов, должны найти свое подтверждение путем гистоморфологических исследований материалов, взятых из диагностируемого патологического очага. Необходимость проведения гистоморфологических исследований тем более обоснована при изучении лазерно-спектроскопических характеристик патологических состояний биотканей, поскольку, как было показано в главе 1 диссертационной работы, оптические свойства последних определяются особенностями их структурной организации и строения. Изучение динамики микроскопических параметров структуры и строения тканей слизистой оболочки желудка в норме и по мере развития патологических процессов в настоящей работе проводилась на основе методов светооптической и флуоресцентной микроскопии, используя анализ темнопольного изображения в проходящем свете для биологических микроструктур при их окрашивании специальными красителями в комплексе с наблюдением их нативной формы в свете собственной флуоресценции. При этом, для количественной оценки результатов гистоморфологических исследований динамики структуры биотканей вводились следующие морфологические параметры: d - толщина слизистой оболочки желудка (внутреннего покрова) равная сумме толщин эпителия и собственной пластинки, Snuc - площадь клеточных ядер, S , - площадь цитоплазмы клеток и /с, = Scyt/Smc - ядерно-цитоплазматический индекс. Кроме того, возможность цифрового rg/э-разложения данных микрофлуориметрии позволила провести спектральный анализ и определить ряд биохимических показателей, характеризующих физиологическое состояние биотканей в процессе развития патологии.
Такими показателями являются индекс оценки степени энергетического обмена - кг и содержания порфиринов - къ. Согласно работам [38-41], показатель кг может быть определен как отношение интенсивности флуоресценции флавиновиновых производных - Fjjavms и NAD(P) H - FNAD{P)H, а следовательно, как отношение площадей «зеленой» Sff и «синей» S" составляющих спектрального разложения флуоресцентных микроснимков: ic2 = F/!avim/FNAD(p H =S ;en/s e, где ij _ соответственно, продольная и поперечная координата микроснимков. По аналогии с этим, показатель к3 может быть определен как отношение интенсивности флуоресценции производных порфириновых групп - Fporphmns и NAD(P)"H - FNAD(P)H: кг = FporphmnsfFNAD{P).H = S /s»;% где s - площадь «красной» компоненты разложения. Типичная гистоморфологическая и микрофлуоресцентная картина слизистой оболочки желудка в норме показана, соответственно, на рис. 3.9-3.10, при хроническом атрофическом гастрите (средняя стадия поражения) — на рис. 3.11-3.12, при каллезном язвенном дефекте и полипе (высокая стадия поражения) - соответственно на рис. 3.13-3.14 и рис.3.15-3.16, а при раковой опухоли желудка (аденокарцинома, крайняя стадия поражения) — на рис. 3.17-3.18. Систематизация результатов гистоморф о логических и микрофлуоресцентных исследований и их обобщение позволили отметить, что по мере развития патологических процессов в биотканях наблюдаются однотипные дегенеративные изменения, хотя существуют определенные морфологические и излучательные особенности, которые, по-видимому, связаны со своеобразием структурной организации исследуемых биосред. Более отчетливо эти различия видны также из таблицы №3.1, где приведены численные значения показателей микроскопических исследований нормальных и патологических биотканей. В ходе проведения гистоморф о логических исследований было обнаружено (см. рис. 3.9, 3.11, 3.13, 3.15 и 3.17), что развитие патологических процессов в тканях слизистой оболочки желудка сопровождается прогрессированием атипичных изменений, затрагивающих структуру и строение биоткани на всех уровнях светооптической микроскопии. В частности, по сравнению с нормальным состоянием в биотканях при средней и высокой стадии поражения происходит рост полиморфизма клеток и клеточных ядер с уменьшением их размеров до 2 раз и некоторым снижением ядерно-цитоплазматического индекса (рис. 3.11(b) и 3.15(b)). Кроме того, в поле зрения наблюдается увеличение плотности атипичных клеток на условную единицу с образованием очагов их скопления (рис. 3.11(a) и 3.15(a)).
Однако дальнейшее развитие процессов патологического поражения (раковая опухоль) на фоне еще более выраженного полиморфизма клеточных структур приводит к увеличению их размеров в 1.5-2 раза при снижении индекса к{ до 1.5 раз относительно нормы (рис. 3.17(b)). При этом вследствие активной пролиферации эпителия концентрация атипичных клеток может до 2 раза превосходить нормальные показатели, а их пространственное распределение приобретает плотноупакованный кластерный характер (см. рис.3.17(a)). В то же время, обращает внимание общий, для всех исследуемых стадий поражения, эффект хронического продуктивного воспаления, результатом которого является диффузная инфильтрация биотканей воспалительными клетками, размеры клеточных структур которых в 3-4 раза меньше нормальных, а так же активное разрастание соединительной ткани. Причем наибольшее развитие эти эффекты получили при каллезном язвенном дефекте (средняя стадия
Влияние оптического поглощения и светорассеяния на формирование спектров лазерно-индуцированной флуоресценции биообъектов при различных патологическх состояниях
Существенный прогресс в разработке и совершенствовании малоинвазивных методов диагностики различных заболеваний на основе стационарных методов оптической и флуоресцентной спектроскопии во многом связан с интенсивным развитием лазерных, оптоэлектронных и цифровых технологий. В настоящее время спектрально-оптические методы диагностики нашли широкое применение при обнаружении локализации процессов малигнизации в тканях кожного покрова, нервной системы, органов грудной клетки и брюшной полости (см., например, [4-28]). Однако анализ результатов этих исследований часто является неоднозначным, поскольку биологические ткани представляют собой чрезвычайно сложные объекты. Как было показано ранее, биоткани являются поглощающими и рассеивающими средами с высокой степенью анизотропии физических свойств и обладают нерегулярной формой, негомогенны и часто многослойны. Распространение света в таких объектах носит сложный характер, что обусловлено оптической неоднородностью самих биотканей (структурные тканевые и клеточные элементы, надмолекулярные комплексы и агрегаты), вызывающей сильное рассеяние излучения видимого и ближнего ИК спектральных диапазонов. В свою очередь, это значительно ограничивает пространственное разрешение и глубину зондирования оптических методов диагностики [1-3,82-84]. При флуоресцентных исследованиях, особенность структурно-морфологической организации биообъектов приводит к тому, что поток фотонов, испущенных флуорофорами, на пути выхода из биоткани подвергается множественному светорассеянию на центрах оптической неоднородности, приводя к перераспределению по угловым координатам, в результате чего существенно изменяется направление распространения фотонов флуоресценции в положение поглощающей молекулы. Кроме того, известно [1-5,34,35], что флуоресцентные свойства биотканей образованы свечением большого числа эндогенных флуорофоров и хромофоров, причем часто с близкими или перекрывающимися спектральными областями поглощения и флуоресценции. В такой ситуации вероятность реабсорбции фотонов флуоресценции нефлуоресцирующими комплексами сильно возрастает, что приводит к значительному ослаблению и спектральному сдвигу флуоресцентного потока, в силу чего суммарный спектр свечения эндогенных флуорофоров будет заметно отличаться от экспериментально-полученных спектров флуоресценции самих биотканей. Резюмируя вышеизложенное, следует, что ключевым моментом при решении проблем связанных с определением степени искажения спектров флуоресценции биотканей является учет факторов рассеяния и поглощения самих биотканей, что, в свою очередь, является следствием их физиологического и структурно-морфологического состояния. В то же время, как было показано ранее, экспериментальные спектры флуоресценции сами по себе несут информацию о морфо-функциональном состоянии исследуемых биотканей.
Таким образом, в целях проведения диагностических исследований патологических состояния биотканей представляется обоснованным привлечение как измеренных, так и исправленных (истинных) спектров флуоресценции. В настоящее время существует ряд методик, позволяющих выявить спектральное распределение истиной флуоресценции (аутофлуоресценции), основанных на различных экспериментальных и теоретических моделях, использующих, например, приближение теории переноса излучения [51,52], электромагнитную теорию [53,54] и другие модели [55-57] (описание этих методик приведено в главе 1 диссертации). В данной работе в целях восстановления спектров аутофлуоресценции биотканей использовалась экспериментальная модель, основанная на теории миграции фотонов в мутной среде, предложенная в работе [58] ив последствии детально развитая в [59-61]. Модель базируется на предположении, что механизмы формирования спектров диффузного отражения Rd{X) и флуоресценции F(X), а так же характер выхода их эмиссии на поверхность биоткани определяются одними и теми же поглощающими и рассеивающими свойствами среды. Согласно этому предположению, определение фактора коррекции и учет искажений в спектральном контуре аутофлуоресценции Af(X) могут быть выполнены при совместном анализе данных Rd{&) и F{X), измеренных в едином спектральном интервале возбуждения (Яы) и эмиссии (Лст), при одинаковой геометрии их возбуждения и регистрации с привлечением простого аналитического выражения: где ri(?Lcm) = lfl{&em)llr{Km) — коэффициент пропорциональности, определяющий длину пробега рассеянных и не рассеянных фотонов, формирующих флуоресценцию и величину диффузного отражения; 1л{ т) и 1г{Кт) эффективная глубина оптического проникновения фотонов, формирующих, соответственно, спектры флуоресценции и диффузного отражения. Параметр
