Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Роль пептидов в живых организмах 8
1.1.1. Коммуникативные пептиды 9
1.1.2. Мембраноактивные пептиды 9
1.1.2.1. Строение мембраноактивных пептидов 9
1.1.2.2. Механизм действия мембраноактивных пептидов 10
1.1.2.3. Ингибиторы синтеза N0 13
1.2. Пептиды из кожных секретов амфибий семейства anura 14
1.2.1. Синтез пептидов в организме амфибий 15
1.2.2. Амфибии рода Rana и Hyla 16
1.2.3. Кожные пептиды ранидных лягушек 17
1.2.3.1. Мембраноактивные пептиды 17
1.2.3.1.1. Активность дисульфидсодержащих пептидов 19
1.2.3.1.2. Пептиды, несодержащие дисульфидной связи 2F
1.2.3.2. Нейропептиды ранидных лягушек 23
1.2.3.2.1. Тахикинины 23
1.2.3.2.2. Ранатензины ибомбезины 24
1.2.3.2.3. Брадикинины 25
1.2.4. Пептиды хилидных лягушек 27
1.2.4.1. Мембраноактивные пептиды 27
1.2.4.1.1. Семейство дермасептина 27
1.2.4.1.2. Пептиды-антибиотики австралийских квакш 29
1.2.4.2. Нейропептиды 31
1.2.4.2.1.Каерулиньї 31
1.2.4.2.2. Опиоидные пептиды 31
1.2.4.2.3. Триптофиллины 32
1.3. Секвенирование пептидов 33
1.3.1. Химические методы 33
1.3.1.1. Метод Эдмана 33
1.3.1.2. Леддерное секвенирование 34
1.3.2. Методы генной инженерии 35
1.3.3. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов и белков 36
1.3.3.1. Применяемые для секвенирования пептидов методы ионизации 37
1.3.3.1.1. Ионизация электрораспылением (ЭР) 38
1.3.3.1.2. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ) 39
1.3.3.2. Тандемная масс-спектрометрия 39
1.3.3.2.1. Диссоциация, активированная соударениями (ДАС) 41
1.3.3.2.2. Диссоциация при захвате (ДЭЗ) или переносе электрона (ДПЭ) 44
1.3.3.2.3. Фрагментация в МАЛДИ 48
1.3.3.3. Комплементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей 50
1.3.3.4. Сложности масс-спектрометрического секвенирования 51
1.3.3.4.1. Изомерные и изобарные аминокислоты 51
1.3.3.4.2. Внутримолекулярная дисульфидная связь 54
1.3.3.4.3. Масс-спектрометрические методы разрушения S-S связей 58
1.3.3.4.4. Газофазная циклизация Ъ- и я-ионов коротких пептидов 58
1.3.3.5. Модификация N-концевой аминогруппы 63
1.3.3.5.1. Введение незаряженной группы на N-конец пептида 63
1.3.3.5.2. Введение отрицательно заряженной группы на N-конец пептида 64
1.3.3.5.3. Введение положительно заряженной группы на N-конец пептида 66
2. Обсуждение результатов 69
2.1. Оптимизация процедуры получения кожных секретов 70
2.2. Оптимизация вэжх разделения кожных секретов 70
2.3. Детальное масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек 71
2.3.1. Комплементарность результатов de novo секвенирования полученных в режимах ДАС и ДЭЗ 71
2.3.2. Ранидные лягушки 73
2.3.2.1. Комплементарность процедур карбоксамидометилирования и окисления дисульфидных связей ранидных пептидов 74
2.3.2.2. Побочные реакции, зафиксированные при карбоксамидометилировании и окислении дисульфидных связей 80
2.3.2.3. Кожный пептидом озерной лягушки, Rana ridibimda 83
2.3.2.4. Кожный пептидом прудовой лягушки, Rana lessonae 87
2.3.2.5. Кожный пептидом съедобной лягушки, Rana esculenta 92
2.3.2.6. Кожный пептидом травяной лягушки, Rana temporaria 97
2.3.2.7. Кожный пептидом остромордой лягушки, Rana arvalis 102
2.3.3. Хилидные лягушки 107
2.3.3.1. Газофазная циклизация Ъ- и я-ионов коротких пептидов 107
2.3.3.2. Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов 110
2.3.3.3. Кожный пептидом квакши обыкновенной, Hyla arborea 114
2.4. Экспресс-профилирование кожных секретов ранидных лягушек 118
3. Экспериментальная часть 126
Выводы 130
Список литературы 131
- Механизм действия мембраноактивных пептидов
- Комплементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей
- Комплементарность результатов de novo секвенирования полученных в режимах ДАС и ДЭЗ
- Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов
Введение к работе
Актуальность темы. Бесхвостые амфибии представляют собой группу некрупных, достаточно медленно передвигающихся животных. Их тела лишены защитных панцирей, клыков, когтей, покрыты легко проницаемой кожей, что делает их уязвимыми для хищников и паразитов. В процессе длительной эволюции для защиты от них амфибии выработали высокосложный химический арсенал. Секрет, выделяемый спинными кожными железами в стрессовых ситуациях, помогает эффективно противостоять внешней агрессии. В его составе присутствуют соединения с высокой биологической активностью, большая их часть относится к классу пептидов. Изученные к настоящему моменту пептиды амфибий проявляют антимикробные, противовирусные, противоопухолевые свойства, могут противодействовать паразитическим грибам и простейшим. Некоторые из них обладают нейроактивностью и выполняют регуляторные функции в организме продуцирующих их амфибий. Высокая степень схожести многих пептидов земноводных с пептидами млекопитающих и человека делает изучение их структур и механизма действия актуальным для понимания физиологии самого человека.
Постоянная эволюция патогенных микроорганизмов способствует появлению резистентных к существующим антибиотикам штаммов и, тем самым, вынуждает расширять поиск новых веществ, позволяющих эффективно противостоять бактериям. Преимуществом антимикробных пептидов, в том числе кожных пептидов амфибий, в сравнении с традиционными антибиотиками является то, что их механизм действия исключает привыкание к ним со стороны патогенных микроорганизмов.
Классические биохимические методы определения структур белков и пептидов в настоящее время практически полностью вытеснены масс-спектрометрическим секвенированием. Оно оказалось более быстрым, простым и чувствительным методом, что резко уменьшило необходимое для анализа количество образца без ущерба надежности его результатов. Основной и наиболее трудоемкой задачей масс-спектрометрического секвенирования является так называемое de novo секвенирование, т.е. установление структуры абсолютно неизвестного пептида. Повышение эффективности этой процедуры тем или иным способом крайне важно для развития самого метода, поскольку расширяет границы его применения.
Таким образом, изучение состава кожных секретов амфибий, содержащих поистине уникальные биоактивные вещества, разработка и развитие новых подходов к анализу многокомпонентых смесей природных пептидов неизвестной структуры, а также повышение эффективности их de novo секвенирования являются актуальными задачами современной науки.
Цель работы. Целью данной работы являлось определение пептидных профилей кожных секретов пяти видов ранидных лягушек (R. ridibunda, R. lessonae, R. esculenta, R. temporaria и R. arvalis) и одного вида квакш {Hyla arborea) комплексом масс-спектрометрических методов с
применением простых химических модификаций неразделенного кожного секрета, а также изучение возможности проведения видовой идентификации ранидных лягушек на основе состава их кожных субстратов.
Научная новизна и практическая значимость. Установлены составы кожных секретов шести видов лягушек. Сведения о пептидомах трех видов лягушек (R. lessonae, R. esculenta и Hyla arborea) публикуются впервые. Уточнены составы кожных выделений трех других видов: R. ridibunda, R. arvalis и R. temporaria (обитающей на территории России). В ходе выполнения работы установлены структуры 153 пептидов, из них ранее не описанных - 39.
Предложен и практически применен новый подход к de novo секвенированию неизвестных компонентов в составе природных пептидных смесей (кожных секретов ранидных и хилидных лягушек). Он включает совокупный анализ исходных и модифицированных кожных субстратов при суммарном использовании двух методов активации диссоциации пептидных связей: соударениями (ДАС) и захватом электронов (ДЭЗ). Для изучения секрета ранидных лягушек предложено параллельное использование двух способов модифицирования внутримолекулярных дисульфидных связей: восстановление с последующим карбоксамидометилированием и окисление надмуравьиной кислотой. При определении пептидного профиля квакши Hyla arborea применена процедура ацетилирования. Такое совместное использование двух способов фрагментации с простыми химическими модификациями позволяет повысить надежность и эффективность масс-спектрометрического de novo секвенирования компонентов кожных пептидомов ранидных и хилидных лягушек.
Изучены три способа модифицирования N-концевой аминогруппы коротких пептидов для предотвращения газофазной циклизации их Ь- и а-ионов. Оказавшаяся в результате наиболее эффективной процедура ацетилирования N-аминогруппы пептидов была применена при масс-спектрометрическом изучении состава кожного секрета Hyla arborea.
Продемонстрирована возможность использования составов кожных пептидомов для межвидовой идентификации ранидных лягушек. Показано, что она может проводиться как путем детального масс-спектрометрического профилирования кожных секретов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения, так и экспресс-профилированием методами ВЭЖХ и МАЛДИ-МС.
Первичные структуры пяти новых пептидов были подтверждены методом деградации по Эдману. Один из пептидов, выделенный из секрета Hyla arborea, был протестирован на антимикробную активность и способность ингибировать NO-синтазу: оба теста показали отрицательный результат.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 статей в ведущих отечественных и зарубежных научных журналах. Результаты работы представлены на
десяти российских и международных конференциях: XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007); 2-ой и 3-ей Всероссийских конференциях с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы" (Москва, 2007; Москва, 2009); 55-ой, 57-ой и 58-ой конференциях Американского масс-спектрометр ического общества (Индианаполис, 2007; Филадельфия, 2009; Солт Лейк Сити, 2010); IV Всероссийском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, 2009); 22-ой масс-спектрометрической конференции в Австралии и Новой Зеландии (Сидней, 2009); 6-ом Международном симпозиуме по эндокринологии и нейробиологии амфибий (Берлин, 2009) и 9-ом Европейском семинаре по МСФП (Лозанна, 2010).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 167 страницах, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов. Иллюстративный материал содержит 16 таблиц, 61 рисунок. Список процитированной литературы состоит из 451 наименования.
Механизм действия мембраноактивных пептидов
Вместе с тем существует некоторое количество микроорганизмов, невосприимчивых к пептидным антибиотикам. Так, например, мембрана бактерий родов Morganella и Serratia содержит слишком мало анионных липидов, что снижает притяжение пептидов к ней, а бактерия рода Porphyromonas gingivalis выделяет протеазы, дезактивирующие пептиды [26]. Однако и в этом случае не происходит развития приобретенных механизмов устойчивости. Некоторые виды грамотрицательных. бактерий; способны изменять состав внешней мембраны, вводя в нее положительно заряженные молекулы этанол амина и 4-аминоарабинозы [39, 40] нейтрализующие отрицательный заряд мембраны и снижающие тем самым активность антимикробных пептидов. Этот процесс запускается: PhoP/PhoQ регулоном [40]. Таким образом, изначально- нерезистентный і вид может пробрести устойчивость к пептидным антибиотикам.
Для многих пептидов свойственно выполнение нескольких функций одновременно. Так, например, антимикробные дефенсины и кателицидины, могут выступать как хемокины, привлекая к очагу заражения Т-лимфоциты и нейтрофилы [41, 42]. Показано также, что некоторые нейропептиды способны проявлять антимикробную активность [43].
Молекула N0 является одним из самых распространенных меж- и внутриклеточных передатчиков сигнала, задействованным во множестве: ключевых биологических процессов [44]. Практически каждый тип клеток, известных к настоящему времени, способен производить N0 с помощью хотя бы одной из форм NO-синтаз. Выделяют нейрональную, индуцибельную и эндотелиальную NO-синтазы. Нейрональная NO-синтаза находится в нервных клетках и некоторых скелетных мышцах. Она отвечает за передачу нервного импульса [45]. Индуцибельная NO-синтаза локализована в клетках иммунной и сердечно-сосудистой системы: ее функцией является обеспечение защиты от патогенов [46; 47]. Эндотелиальная NO-синтаза расположена в эндотелии сосудов и. ответственна за тонус сосудов [48]. Учитывая все многообразие функций N0 в клетках, можно быть уверенным, что ингибирование синтеза NO существенным образом повлияет на жизнедеятельность организма [49, 50]. Такой тип активности в отношении нейрональной NO-синтазы был обнаружен для некоторых пептидов амфибий [51].
Все типы NO-синтаз имеют в общих чертах похожее строение. Они состоят из окислительного и восстановительного доменов, а также домена связывания Са2+-кальмодулина, который обеспечивает взаимодействие между этими двумя доменами [52]. Пептидные ингибиторы нарушают коммуникацию между Са2+-кальмодулином и N0-синтазой. Это подтверждается тем, что активность ингибированного фермента частично восстанавливается при добавлении Са2+-кальмодулина [51, 53]. Комплекс, образующийся между пептидом и Са +-кальмодулином, может быть зарегистрирован с помощью двумерного ЯМР и масс-спектрометрии [54]. При связывании с пептидом Са2+-кальмодулин меняет свою форму, и в следствие этого ухудшается взаимодействие с соответствующим доменом NO-синтазы [55, 56]. Са2+-кальмодулин участвует также в регулировании кальциневрина [51] (киназы, фосфорилирующей белки и аденилат-циклазу [57]); функционировании цитоскелета эукариот [57] и движении ресничек некоторых простейших [58]. Известно, что бактериальные NO-синтазы задействованы в противостоянии антибиотикам, окислительному стрессу и атакам иммунной системы организма-хозяина [59, 60]. Таким образом, можно заключить, что пептидные ингибиторы NO-синтазы призваны нанести максимальный вред потенциальному хищнику или паразиту, хотя, возможно, их цель - регуляция функций организма амфибии. Данный вопрос не до конца ясен и требует дальнейшего исследования.
Бесхвостые амфибии представляют собой группу обычно некрупных, сравнительно медленно передвигающихся и мягкокожих животных, что делает их удобной добычей для хищников из числа рыб, пресмыкающихся, млекопитающих и птиц. Их тела лишены защитных покровов: панцирей, клыков, когтей и т.п. Однако в их распоряжении имеется высокосложный химический защитный арсенал, выделяемый спинными кожными железами в стрессовых ситуациях и моменты агрессии для борьбы с хищниками и паразитами [61-64].
Фармакологические свойства кожи амфибий известны с незапамятных времен и восходят к древней традиционной медицине, использованию в охоте и при изготовлении различных снадобий. Даже сейчас шкурки амфибий и вытяжки из их желез продолжают активно применяться жителями Азии и Южной Америки [64-68].
Кожные выделения амфибий содержат вещества с колоссальной биологической активностью [62, 69]. Так, например, у лягушек из семейства Dendrobatidae кожные железы выделяют высокотоксичные алкалоиды, которые, как считается, передаются им от ядовитых насекомых и других беспозвоночных, составляющих основной рацион этих лягушек [62, 70]. В коже большинства жаб также присутствуют низкомолекулярные алкалоиды, например, буфотоксины, буфодиенолиды и другие биогенные амины. В отличие от представителей семейства Dendrobatidae, эти вещества синтезируются в организме самих животных, а не накапливаются из пищи [62, 71]. Кроме того, лягушки и жабы в стрессовой ситуации выделяют на кожу очень сложную смесь различных биоактивных пептидов, а также побочные продукты их биосинтеза [61, 63, 64].
Комплементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей
Из австралийских квакш родов Litoria, Uperolia и Crinia выделены мембраноактивные пептиды семейств ауреинов, каеринов, цитропинов, далеинов, макулатинов, сигниферинов и уперинов.
Ауреины 1-3, цитропины 1-2, сигниферины-2 и уперины 2-4 являются антибиотиками широкого спектра действия (МИК этих пептидов лежат в области концентраций 10 мкМ). Метод двумерного ЯМР показал, что в модельных мембранах они принимают форму амфипатической а-спирали [54].
Наиболее изученный из этой группы - цитропин-1.1 (GLFDVIKKVASVIGGL-NH2) в микромолярных концентрациях ингибирует рост бактерий. Дополнительные исследования были направлены на выяснение механизма действия этого пептида. Было показано, что L-цитропин и D-цитропин проявляют практически одинаковую активность [160]. При замене двух основных аминокислот Lys7 и Lys8 или концевого Leul6 на аланин амфипатичность и активность теряется, а при увеличении общего заряда пептида с сохранением амфипатичности (замена Asp4-Ala, Glyl4—Lys) — возрастает [53]. Эксперименты ЯМР в твердом теле показали, что цитропин-1.1 внедряется в мембрану под углом 50 к ее плоскости [161, 162]. Поскольку его длина недостаточна для преодоления всей толщи мембраны, было предположено, что он действует по ковровому механизму. Это предположение было подтверждено результатами, полученными с применением конфокальной флуоресцентной спектроскопии [163].
Помимо этого, цитропин-1.1 (GLFDVIKKVASVIGGb-NH2) оказался сильным ингибитором нейрональной NO-синтазы (IC50 8.2 мкМ). Стоит отметить, что D-цитропин-1.1 имеет почти в четыре раза меньшую активность (30.7 мкМ), тогда как синтетический аналог с увеличенным зарядом молекулы (замена Glyl4,15-Lys) на порядок активнее (0.9 мкМ) [53]. Ауреинам-2 также свойственно проявлять этот тип активности (ICso 2 мкМ) [54].
Каерины-1 и макулатины-1, также как и пептиды описанные ранее, являются антибиотиками широкого спектра действия. Вторичная структура пептидов этого класса представляет собой два спиральных региона, соединенных подвижной петлей [54]. Активность природного L-каерина-І.І (GLLSVLGSVAKHVLPHWPVIAEHL-NH2) и D-каерина-1.1 примерно одинаковы [160]. Наличие петли в центре - существенный фактор для проявления пептидами этого класса активности. Например, [А1а15,А1а19]-каерин-1.1 (замена Pro на Ala), у которого нет центральной подвижной пролинсодержащей петли, показывает существенно меньшую антимикробную активность [164]. Снижение общего заряда молекулы уменьшает активность в отношении грамположительных бактерий и повышает в отношении грамотрицательных. Длина макулатинов-1 и каеринов-1 достаточна для преодоления всей толщи мембраны. ИК и флуоресцентная спектроскопия показывают, что макулатин-1.1 действует по механизму образования пор [163, 165], тогда как механизм действия каерина-1 остается спорным.
И цитропины-1, и макулатины-1, и каерины-1, являясь антибиотиками широкого спектра действия, проявляют также противоопухолевую активность в отношении большинства типов человеческих опухолей: лейкемии, легкого, прямой кишки, меланомы (ECso составляет 10 5, 10"6 М) [81, 166]. При этом наибольшую противоопухолевую активность демонстрируют цитропин-1.1 и каерин-1.1 [160]. Помимо противоопухолевой, у каерина-1.1 обнаружена также антивирусная активность в отношении ВИЧ (МИК 7.8 мкМ) [15] и вируса герпеса (МИК 9.2 мкМ) [160]. Кроме того, в отношении ВИЧ показали активность каерин-1.9 (GLFGVLGSIAKHVLPHWPVIAEKb-NH2) и- макулатин-1.1 (GLFGVLAKVAAHWPAIAEHF-NH2): их МИК равны соответственно 1.2 и 11.3 мкМ. Пептид из семейства магаининов - магаинин-2 (GIGKPLHSAKKFGKAFVGEIMNS-OH) активности в отношении ВИЧ не обнаружил [15]. В указанных концентрациях каерин-1.1, каерин-1.9 и макулатин-1.1 не наносят вреда клеткам носителя вируса. Они подавляют инфекцию ВИЧ в Т-клетках в течение минут и препятствуют передаче вируса от дендритных клеток к Т-клеткам. Вероятнее всего, в основе действия этих пептидов лежит взаимодействие с оболочкой вируса, поскольку они неактивны в отношении безоболочечного реовируса [15]. В настоящее время одной из опасностей, грозящей амфибиям в Северной Америке и Австралии, являются хитридиевые грибы {Batrachochytium dendrobatidis). Они поражают многие виды амфибий, серьезно сокращая популяцию этих животных и являясь угрозой их выживанию [167, 168]. Каерины-1, макулатины-1 и некоторые темпорины (описаны ранее) активны против этих паразитов в микромолярных концентрациях [169]. Численность тех видов амфибий, которые не имеют в кожном секрете подобных пептидов, сокращается особенно быстро. Однако и те виды, которые вырабатывают антигрибковые пептиды, также подвержены заражению. Причина этого на первый взгляд парадоксального явления может заключаться в том, что не все участки кожи животного в равной степени защищаются кожными выделениями [54]. Каерины-1 ингибируют синтез N0: наиболее активные из них каерин-1.8 (GLFKVLGSVAKHLLPHWPVIAEKb-NH2) и каерин-1.19 (GLFKVLGSVAKHLLPHVAPnAEKL-NH2) имеют IC50 1.7 мкМ и 4.1 мкМ, соответственно [160]. Причем укороченный на 6 аминокислот с N-конца каерин-1.19 такой активности не проявляет. Каерины-2, -3 и -4, выделенные из представителей рода Litoria, показывают узкую антимикробную активность. Например, каерин-2.5 в концентрации 1 мкг/мл убивает Micrococcus hiteus, но малоактивен в отношении других бактерий, а каерин-4.1 высоко активен в отношении Pastearella multocida ( 1 мкг/мл). Вероятно, их физиологическая роль заключается в другом. Так, каерины-2 ингибируют синтез N0 в нейрональной N0-синтазе [54]. Половинная ингибирующая концентрация для каерина-2.6 (GLVSSIGKLLGGLLADWKSKGQPA-OH) составляет 6.6 мкМ. Эти семейства пептидов не проявляют противоопухолевой активности.
Недавно обнаружена удивительная активность пептида псевдин-2 (GLNALKXVFQGIHEAIKLINNHVQ-OH), выделенного из квакши Pseudis paradoxa. Он стимулирует вьщеление инсулина и может применяться для лечения сахарного диабета второго типа [170].
Нейропептид каерулин (pEQDY(S03)TGWMDF-NH2) является одним из самых изученных пептидов амфибий. В своей структуре он содержит экзотические аминокислоты: пироглутамат и тирозинсульфат. Этот пептид является основным компонентом кожных секретов квакш рода Litoria, Xenopus laevis и др. По структуре он близок к холецестокину-8 (DY(S03)MGWMDF-NH2) - нейропептиду млекопитающих [63] и может связываться с холецестокиновыми рецепторами в мышцах (ССК-1) и мозгу (ССК-2). Существенными для- его активности является остаток сульфированного тирозина: при десульфировании активность пептида значительно уменьшается. В субнаномолярных концентрациях (10"10 М) он вызывает сокращение гладкой мускулатуры, влияет на кровообращение и терморегуляцию. Обезболивающее действие каерулина в тысячи раз сильнее морфина [171, 172]. Он был применен при операции на желчном пузыре [160].
Комплементарность результатов de novo секвенирования полученных в режимах ДАС и ДЭЗ
Масс-спектрометрия в настоящее время является основным инструментом протеомики [9, 11, 217]. Для определения первичной" структуры белков и пептидов методами масс-спектрометрии существуют два подхода: так называемые «bottom-up» и «top-down». Первый подразумевает специфическое расщепление исходных белков с помощью ферментов (трипсина, эластазы, протеазы V8 и др.) с последующим масс-спектрометрическим изучением смеси образующихся пептидов. В зависимости от приборных возможностей и конкретной задачи смесь может анализироваться целиком или после хроматографического разделения на компоненты. Существующие алгоритмы поиска по базам данных последовательностей белков и генов позволяют автоматически провести идентификацию анализируемых белков, используя в качестве исходных данные о массах пептидов в смеси, и/или, что надежнее, спектры их фрагментации. Наиболее известные и часто использующиеся алгоритмы - это Mascot [218], SEQUEST [219], XITandem [220]. В том случае, когда исходный белок не содержится в базе данных, выполняют с/е novo секвенирование каждого пептидного фрагмента, а затем по сумме их последовательностей восстанавливают структуру белка.
Подход top-down подразумевает установление последовательности аминокислот исключительно масс-спектрометрическими методами без использования ферментативного расщепления молекулы белка [221, 222]. По сути, этот подход отражает возможности самого метода масс-спектрометрии, которые постоянно расширяются.
De novo секвенирование осуществляется методами тандемной масс-спектрометрии (см. раздел 1.3.3.2): интересующий ион выделяют из смеси образовавшихся ионов, активируют его распад и регистрируют спектр фрагментов. Анализ спектра ионов-продуктов, в общем случае, позволяет установить структуру исходного иона.
Широкое применение масс-спектрометрии в протеомике стало возможным, благодаря появившимся и развитым за последние 20 лет мощным методам ионизации больших нелетучих молекул - электрораспыления (ЭР) [223-226] и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) [227, 228]. В комбинации с ними используют множество способов активации фрагментации, наиболее распространенными из которых в настоящее время являются диссоциация, активированная соударениями, и диссоциация при захвате или переносе электрона.
Поиск возможностей для приложения масс-спектрометрии к анализу биохимических объектов: белков, пептидов, олигонуклеотидов, Сахаров, разнообразных биополимеров и т. п. вёлся с 60-х годов [229]. Основным сдерживающим фактором было отсутствие подходящего способа недеструктивного перевода термолабильных биомолекул в газовую фазу масс-спектрометра. Исчерпьшшощая дериватизация полярных групп пептида позволяла анализировать лишь небольшие молекулы [230, 231], но о повсеместном применении масс-спектрометрии не могло быть и речи.
В 1969 г. Беккей [232] предложил метод полевой ионизации, позволивший, в частности, исследовать молекулы больших углеводородов, простых пептидов [233], Сахаров и т. п.
В 70-х годах появились работы Беннингховена [234, 235], а также Танцырева [236, 237] по ионизации методами масс-спектрометрии вторичных ионов (ВИМС, SIMS) и бомбардировки быстрыми атомами (ББА, FAB) ряда полярных органических соединений, небольших пептидов, аминокислот, лекарств, а также фторполимеров. В 1981 г. [238, 239] в работах Барбера получены первые структуры пептидов, установленные с помощью ББА.
Объединение тандемной масс-спектрометрии, широко применявшейся к тому времени преимущественно для изучении структур органических соединений [240, 241], с новым методом ионизации (ББА) открыло новые горизонты для изучения структур биологических молекул [242]. Стали возможными работы по масс-спектрометрическому секвенированию протеолитических, сравнительно небольших, пептидов [243]. Достигнутая чувствительность полного определения аминокислотной последовательности отдельных пептидов уже составляла 0.1—1 нмоль. Для интерпретации спектров ионов-продуктов и преодоления сложностей в идентификации первой аминокислоты параллельно проводилась реакция Эдмана.
Открытые вскоре новые методы ионизации электрораспылением и МАЛДИ на сегодня полностью вытеснили ББА в применении к анализу пептидов и протеинов.
Впервые явление электрораспыления для анализа полимеров, в частности,. полистирола с массой до 860000 Да, было описано и использовано в 1968 г. Доулом с соавторами [244], однако дальнейшее развитие метод получил лишь.в 80-х годах. В 1984 г. Фенн с сотрудниками [223, 245] и параллельно Л. Н. Галль [226] опубликовали исследования по использованию электрораспыления в качестве источника ионов для масс-спектрометрии. В 2002 г. Фенн был удостоен Нобелевской премии по химии за развитие метода электрораспыления. После того, как были изучены технические возможности метода [224] и показана перспективность использования источника электрораспыления в качестве интерфейса между ВЭЖХ и масс-спектрометром, метод стал быстро набирать популярность. Этому в немалой степени способствовала высокая эффективность ионизации молекул нативных белков [225].
В результате электрораспыления образуются, в основном, многозарядные ионы пептидов и белков. Максимальный возможный заряд каждого пептида или белка определятся, в первую очередь, количеством мест, доступных для протонирования в растворе (боковые цепи основных аминокислот, N-концевая аминогруппа), а также стабильностью образующегося многозарядного иона [246, 247].
Поскольку масс-спектрометрический детектор регистрирует не массу иона, а отношение его массы к заряду, то очевидно, что многозарядность образующихся при электрораспылении ионов приводит к увеличению верхней границы масс исследуемых молекул при постоянном диапазоне регистрируемых значений m/z. Уже в ранних работах, посвященных электрораспылению, было отмечено, что большинство наблюдаемых в спектре ионов лежат в диапазоне m/z 500 - 1500 [225], т.е. более тяжелые пептиды обладают большим зарядом. Благодаря этому появляется возможность масс-спектрометрического исследования сверхтяжелых молекул: в литературе сообщается о регистрации спектров протонированньгх молекул ДНК с массой ПО МДа, несущих заряд 28000-35000 [248]. Фрагментация протонированньгх молекул в процессе электрораспыления малоинтенсивна либо вовсе отсутствует [249].
Широкое распространение этого метода ионизации связано с его простой стыковкой с ВЭЖХ, а также с возможностью использования большинства современных типов масс-анализаторов.
Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов
При определенных условиях в спектрах МАЛДИ наблюдаются не только пики протонированных молекул аналитов, но и сигналы, соответствующие фрагментным ионам [287, 288]. Причиной тому является, главным образом, энергия, получаемая исследуемыми молекулами в процессе ионизации. Количество полученной энергии зависит, в основном, от мощности лазера, матрицы, а также многих других факторов.
Различают процессы распада протонированных ионов пептидов внутри источника (In Source Decay, ISD) [289] и распада после источника (РПИ, Post Source Decay) [290, 291]. Распад внутри источника происходит быстро, до извлечения ионов из области ионизации. Ионы-продукты обладают различными скоростями движения, и для того, чтобы уменьшить их разброс по энергиям, применяют технику задержанной экстракции ионов (delayed extraction) [292]. Образовавшиеся в источнике ионы вытягивают импульсным изменением электрического поля через 100 не после лазерного импульса - время, за которое частицы в шлейфе МАЛДИ могут обменяться энергией путем столкновений. Спектры фрагментации внутри источника малоинтенсивны, в них доминируют с- и z- ионы, хотя также присутствуют а-, Ъ- и -ионы [288]. Считается, что ISD фрагментация инициируется присутствующими в плазменном облаке водородными радикалами [293].
Второй процесс, РПИ, протекает при движении ионов от источника к детектору в бесполевом пространстве времяпролетного масс-анализатора. Ионы-продукты обладают скоростями движения, близкими к скоростям исходных ионов. Поэтому обычным времяпролетным детектором регистрируются вместе с исходными ионами. При использовании рефлектрона (ионного зеркала) [294] можно скорректировать скорости движения ионов по их кинетическим энергиям, отделяя тем самым фрагментные ионы от протонированных молекул пептида. К сожалению, особенности работы рефлектрона позволяют регистрировать с приемлемым разрешением только ионы с массами от 0.7Мтах до Мтах, где Мтах - верхняя граница регистрируемых масс. Таким образом, для записи полного спектра приходится пошагово записывать спектры разных диапазонов масс, что нежелательно удлиняет анализ и увеличивает расход вещества. Тем не менее, этот метод предоставляет возможность проводить МС/МС исследования с помощью «одномерного» МАЛДИ-ВП масс-спектрометра. Именно таким образом были установлены структуры некоторых пептидов [295-297].
Фрагментация в РПИ вызывается избыточной энергией, полученной ионами как в процессах ионизации и ускорения электрическим полем, так и в.результате столкновений с молекулами газов остаточной атмосферы масс-спектрометра [291], что сближает метод с ДАС. В РПИ образуются, главным образом, серии Ъ- и j-ионов, фрагментация протекает интенсивнее, чем при распаде в источнике. Современные приборы (например, серия масс-спектрометров Ultraflex компании Bruker) могут быть оборудованы последовательно расположенными времяпролетными анализаторами с собственными детекторами и разделенными камерой соударений для дополнительной активации фрагментации, что позволяет зарегистрировать весь диапазон масс за одно сканирование. Такие приборы дают возможность проведения полноценных тандемных экспериментов (МАЛДИ-ВП/ВП).
При ионизации МАЛДИ образуются преимущественно однозарядные ионы, поэтому фрагментация в условиях РПИ отличается от таковой для ДАС многозарядных ионов, характерных для электрораспыления. В частности, если исследуемый пептид содержит аргинин, то протон прочно удерживается его боковой цепью, затрудняя фрагментацию пептидной цепи, направляемую местом протонирования. В таких условиях часто предпочтительными становятся разрывы по месту расположения кислотных остатков аспартата и глутамата, способных донировать протон, требуемый для фрагментации. Такая фрагментация в МАЛДИ, происходящая вдали от места локализации протона и часто без его участия, носит название удаленной от мести локализации заряда фрагментации (charge-remote fragmentation) [298]. Появление дополнительного протона, способного выполнять роль мобильного в аргининсодержащих пептидах, резко усиливает эффективность фрагментации пептидных связей в МАЛДИ. Такой эффект наблюдается при окислении боковых цепей цистеина до соответствующих сульфокислот [299, 300]. Направленные поиски в русле этой идеи привели к разработке ряда модификаций N-концевых аминогрупп для введения дополнительного протона в молекулу пептида (подробнее см. раздел 1.3.3.5.2).
При РПИ наблюдается интенсивная фрагментация по боковым цепям пептидов. Так, например, претерпевают разрывы дисульфидные связи между полипептидными цепями, что нашло применение при исследовании дисульфидсодержащих белков, которые в условиях РПИ наблюдаются практически только в виде индивидуальных пептидных цепей [301]. Для de novo секвенирования пептидов массой до 2 кДа применение метода РПИ положительных ионов дает хорошие результаты [302-304]. Для получения комплементарной информации о первичной структуре пептидов дополнительно используют РПИ отрицательных ионов [305].
Каждый из методов активации фрагментации полипептидных цепей обладает своими преимуществами и недостатками. Законы, управляющие фрагментацией полипептидов при электронной и столкновительной диссоциациях, по своей физической сути различны, поэтому наблюдаемые разрывы во многих случаях комплементарны друг другу. Например, в случае ДЭЗ разрывы по N-концу пролина наблюдаются редко, тогда как в ДАС - это, как правило, один из самых интенсивных разрывов [306]. Некоторые посттрансляционные модификации (например, фосфорилирование, О-гликозилирование, сульфирование и др.) крайне лабильны в условиях ДАС, что не позволяет установить точное положение модифицированной аминокислоты. Однако в условиях ДЭЗ и ДПЭ эти модификации стабильны, и эти методы дают возможность установить их местоположение в цепи [307-310]. Кроме того, ДЭЗ и ДПЭ провоцируют специфические разрывы в боковых цепях. В частности характеристические выбросы из изомерных лейцина и изолейцина (подробнее см. соответствующий раздел) [277], позволяют идентифицировать эти аминокислоты масс-спектрометрическим путем. Вследствие большей избыточной энергии, сообщаемой молекуле в процессе активации, в спектрах РПИ осуществляются направления распада, недоступные в ДАС [311]. Вместе с тем суммарная информация нескольких «ортогональных» методов активации позволяет достоверно очистить спектр от случайных сигналов и вычленить сигналы истинных фрагментных ионов. Таким образом, привлечение нескольких методов активации фрагментации для анализа одного и того же пептидного образца существенно повышает надежность его de novo секвенирования.
